Summary
כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע שבב-Seq ומפות CARIP-Seq, כולל ספריית לקראת הדור הבא רצפי, ליצירת epigenomic הכללית ו- RNA הקשורים כרומטין תאים ES.
Abstract
גזע עובריים (ES) תא התחדשות עצמית, בידול נשלטת על ידי אותות חיצוני ורשתות מהותי של גורמי שעתוק epigenetic regulators, שינויים פוסט-תרגום של שינויים היסטוניים combinatorially להשפיע על הגן מצב ביטוי של גנים הסמוכה. RNA הוכח גם לקיים אינטראקציה עם חלבונים שונים כדי לווסת כרומטין דינמיקה של ביטוי גנים. כרומטין-הקשורים RNA immunoprecipitation (CARIP) ואחריו הדור הבא רצפי (CARIP-Seq) היא שיטה סקר RNAs המשויך חלבוני כרומטין, בעוד immunoprecipitation כרומטין ואחריו (הדור הבא רצפי ChIP-Seq) היא טכניקה גנומיקה חזק כדי למפות את המיקום של שינוי post-translational של שינויים היסטוניים, גורמי שעתוק, מכפילי epigenetic בקנה מידה עולמי תאים ES. כאן, אנו מתארים שיטות לבצע CARIP-Seq שבב-Seq, כולל בניית ספריה עבור הדור הבא רצף, ליצירת RNA הקשורים כרומטין הכללית ומפות epigenomic ES תאים.
Introduction
החלטות גורל תאי גזע עובריים (ES) מוסדרים על ידי תקשורת בין אותות חוץ-תאית וכן שורה של גנים ברמת השעתוק-וסתים, כולל היסטון מגבילים, תרגום שלאחר שינוי של היסטון זנבות. אינטראקציות אלה להקל על נגישות כרומטין, אריזה של כרומטין לתוך אחד של שתי מדינות: euchromatin, אשר פתוח ופעיל transcriptionally, ואת הטרוכרומטין, אשר הוא קומפקטי וקל בדרך כלל transcriptionally לא פעיל. גורמי שעתוק DNA רצף ספציפי איגוד הזיקות, עמית מכפילי epigenetic עם אזורים תהיה להשתתף בשליטה על ביטוי גנים. הדור הבא רצפי שיטות, כולל צ'יפ-Seq1, היה אינסטרומנטלי מיפוי הגנום כולו רשתות תעתיק מהותי עבור ES תא התחדשות עצמית, pluripotency2,3,4 5, ,6. יתר על כן, בעוד immunopreciation RNA ואחריו הדור הבא רצף (RIP-Seq)7 ההערכות של אינטראקציות חלבון ה-RNA מציע כי ה-DNA מחייבת חלבונים אינטראקציה עם RNAs להסדיר אירועים תעתיק7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, מחקרים מעטים חקרו לוקליזציה ברמת הגנום של RNAs המשויך כרומטין12או גלובלי האינטראקציות בין שינויים RNA והיסטון. זמן אי קידוד RNAs (lncRNAs) הם קבוצה אחת של RNAs אשר נמצאו להסדיר את הפעילות של חלבונים הקשורים כרומטין13,14,15. לדוגמה, Xist הוא lncRNA המווסת, בתאים בתרבית של נקבה, איון של כרומוזום X אחד, דרך הגיוס של epigenetic repressors16,17. אולם, מלוא הספקטרום של RNAs הקשורים עם כרומטין הוא אינו מודע לקיומם. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול הרומן, הקשורים כרומטין RNA immunoprecipitation (CARIP) ואחריו הדור הבא רצפי (CARIP-Seq), לזיהוי הקשורים כרומטין RNAs על בסיס הגנום כולו, תאים ES, כולל הכנה ספריה עבור הדור הבא רצפי, צ'יפ-Seq למפות תפוסת הכללית של שינויים היסטון, גורמי שעתוק, מכפילי epigenetic. שלא כמו שאר שיטות RIP-Seq7, CARIP-Seq כולל שלבים crosslinking ו sonication, המאפשרים זיהוי ישיר RNAs הקשורים עם כרומטין. יחד, צ'יפ-Seq הוא כלי רב עוצמה לזיהוי אינטראקציות חלבון-DNA הגנום כולו, בזמן CARIP-Seq היא שיטה חזקה סקר RNAs הקשורים רכיבים כרומטין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות של העכבר ES תאים מזין ללא תנאי.
הערה: העכבר ES תאים כמקובל מתורבתים בתקשורת על התא לצלחת תרבות מצופה עם הג'לטין ואת מונו-שכבה של העכבר מתחלקים fibroblasts (MEF), אשר היו mitotically מוחלש (iMEFs). עם זאת, יש להסיר MEFs לפני ניתוחים epigenetic או ביטוי במורד הזרם כדי למנוע הזיהום של כרומטין הקשורים MEF ו- RNA.
- הכנת שכבה מזין: ג'לטין מעיל צלחת תרבות 6-ובכן תא על-ידי הוספת 2 מ"ל של 0.1% ג'לטין במים, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות.
- הכינו 10% DMEM גבוהה-גלוקוז המדיה המכילה 2 מ מגלוטמין, 10% סרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין x 1/סטרפטומיצין....
- לבודד MEFs מן E13.5 E14.5 עכברים18,19 או לרכוש מיצרן מסחרי. Mitotically בטל MEFs על ידי טיפול עם מיטומיצין C או הקרנה גאמה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים19. לחלופין, mitotically לא פעיל MEFs (iMEFs) ניתן לרכוש מיצרן מסחרי.
- Culturing MEFs. לחמם MEF מדיה ב 37 מעלות צלזיוס, להפשיר בקבוקון קפוא של iMEFs, תרבות ב 10% FBS MEF מדיה ב 37 ° C עם 5% CO2. צלחת MEFs-~ 200,000 תאים לכל טוב של צלחת תרבות 6-. טוב.
- Culturing ES תאים בשכבה מזין תאים (iMEFs).
- 12-24 שעות לאחר ציפוי iMEFs, לחמם שפופרת 50 מ של ES תא מדיה (DMEM high-גלוקוז, LIF (10 ng/mL), 15% ES מוסמך תא FBS, 1 × מוסמך תרבית תאים מרקפטואתנול, גלוטמין × 1, חומצות אמינו שאינן חיוניות (NEAA), 1 × פניצילין/סטרפטומיצין), ב 37 ° C עם 5% CO2.
- האחות המדיה מן הלוחות התרבות התא המכיל iMEFs מחדש להשעות את התאים ES 2 מ"ל של מדיה (לאחר מפשיר ב 37 מעלות צלזיוס), צלחת את התאים על השכבה של iMEFs. בשעת מיקום המנה תרבות בחממה, חשוב להעביר את המנה בצורה "t" לפיזור אחיד של התאים, כדי למנוע צבירת לכיוון המרכז של המנה.
- המעבר ES התאים על מנות מזין ללא ג'לטין מצופים. המעבר את התאים ES לפני שהם הופכים confluent. מושבות תאים ES לשמור על מחירי התחדשות עצמית אם המושבות שמפוזרות לא confluent. נוכחותם של רבים מושבות תאים ES כי הם נוגעים מציין צפיפות התאים הוא גבוה מדי.
- מעיל לצלחת תרבות 6-ובכן עם ג'לטין כמתואר לעיל. דגירה 0.25% טריפסין-EDTA ב 37 ° C ~ 10-15 דקות לטריפסין חם מראש.
- בשלב הבא, המעבר את התאים ES על-ידי הראשון כביסה עם 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) והוספת 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA פתרון. . אני לא. 1-2 דקות על המושבות לנתק מביצועם המושבות כדי השעיה תא בודד על-ידי pipetting עם טיפ 1 מ"ל ~ 5 פעמים.
- השתמש במיקרוסקופ כדי לאשר תא בודד דיסוציאציה של תאים ES. כדי להרוות את התגובה, או "לנטרל" את טריפסין, להוסיף 10% FBS MEF מדיה. Centrifuge התאים ב g x 300 בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות, וארוקן את המדיה.
- מחדש להשעות את צניפה הסלולר ב 2 מ"ל של מדיה (ES תא) בתוספת גליקוגן סינתאז קינאז-3 (GSK3) המעכב (CHIR99021; GSK3i), או 2i (MEKi/GSK3i) תנאים (2-3 מיקרומטר GSK3i: CHIR99021, 1 מיקרומטר MEKi: PD0325901).
- תשאף הג'לטין מתוך קערה התרבות תאים, ו להוסיף 2 מ של המדיה המכילה ESCs למנה, ולמקם את המנה בחממה 37 ° C (איור 1 א'-D). עיכוב כפול של GSK3i ו- MEKi מקדם בקרקע pluripotency תמים של תאים ES בהיעדר מזין תאים (iMEFs), ללא סרום20. תאים ES צריך להיות passaged שתיים עד שלוש פעמים כדי להסיר את MEFs לפני שימשיך crosslinking.
2. Crosslinking של ES תאים עבור שבב ו- CARIP
- הקציר ES התאים בשטיפה עם PBS, ולאחר מכן להוסיף טריפסין 0.25% מראש חימם ב 37 º C. תקופת דגירה התאים של מספר דקות בטמפרטורת החדר. הימנע מעל trypsinization של תאים ES, אשר יוביל למוות של התא. השתמש במיקרוסקופ כדי להעריך דיסוציאציה תא בודד.
- להרוות טריפסין עיכול כפי שתואר לעיל עבור passaging ES התאים, centrifuge את התאים ב g x 300 בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.
- מחדש להשעות את התאים בתקשורת MEF ומחוממת מראש (37 ° C) (10% FBS/DMEM)-2 × 106 תאים למ"ל.
- כדי crosslink התאים, להוסיף 37% פורמלדהיד פתרון ריכוז סופי של 1%, וכן דגירה התאים צינור חרוטי (15 מ"ל או 50 מ ל) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 מינימלית היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים במהלך תקופת 8 דקות כדי להשיג קיבוע הומוגנית.
הערה: הזמן קיבוע יכול להיות מדעית אופטימיזציה עבור CARIP. אם הזמן קיבוע היא שונה, מספר מחזורי sonication צריך גם להיות מותאם. גם, הטמפרטורה 37 ° C מגביר יעילות crosslinking לעומת crosslinking בטמפרטורת החדר. הטמפרטורה של קיבוע ניתן למטב מדעית. - כדי לעצור את התגובה קיבעון, להוסיף 1.25 מ' גליצין (טרום מקורר ב 4 ° C) כדי ריכוז של 0.125 מ' היפוך הצינור ב rpm 8 באמצעות מסובב עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. Centrifuge המדגם-300 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, וארוקן את המדיה.
- לשטוף את צניפה תא עם PBS טרום מקורר (4 ° C), centrifuge את הדגימה ב g x 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, תשאף PBS. לשטוף את התאים עם PBS שוב. הבא, aliquot 15 × 106 תאים למחזור 15 מ"ל.
- הקפא בגדר תא על-ידי הצבתו של חנקן נוזלי עבור 1 דקות, על קרח יבש למשך 5 דקות, או מקום באופן מיידי ב- 80 ° c
הערה: כדורי תא ES קבוע ניתן לאחסן עד 6 חודשים ללא ירידה באיכות בניסויים במורד הזרם.
3. כרומטין sonication צ'יפ והפאי CARIP
- הפשרה קבוע ES תא צניפה על קרח. מחדש להשעות בגדר תא במאגר sonication (2.5 מ ל). גורמי שעתוק או epigenetic הרגולטורים (חלבון גורמים), מחדש להשעות בגדר ב- 1 x טה, 1 מ PMSF, 1 x proteinase מעכב קוקטייל. עבור שינויים היסטון, מחדש להשעות בגדר ב 1 x טה, 0.1% מרחביות, 1 מ PMSF, 1 x proteinase מעכב.
הערה: בעוד התוספת של מרחביות משפר את יעילות sonication, יתכן שלא מועילה להערכת כרומטין המרכיבים או גורמי שעתוק מסוימים. - עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP), sonicate כרומטין עם 14-18 מחזורים (30 s במנוחה, 30 s) ב- 40% משרעת. עבור הקשורים כרומטין RNA immunoprecipitation (CARIP), להפחית את מספר מחזורי sonication (8-10 מחזורים). סלולרי, קיבוע וכתוצאה sonifier השתנות, תנאים sonication מדעית ייקבע.
- תוספת למאגר sonication עם 28 µL למען חברה דמוקרטית 10% חלבון-גורמים, 28 µL של נתרן-deoxycholate, ו- 0.28 מ ל 10% טריטון-X100, ולערבב היטב.
הערה: תוספת של רכיבים אלה אל המאגר sonication יוצר מאגר ריפה. - Centrifuge הדגימה ב 10,000 g x 10 דקות ב 4 ° C לפנות מראש של כרומטין. להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים והמשך עם כרומטין immunoprecipitation.
- לחלופין, ניתן לאחסן כרומטין sonicated ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. עם זאת, האחסון של כרומטין sonicated ב-80 מעלות צלזיוס עלול להוביל באיכות מופחתת חלבון-factor שבב.
4. שבב ותהליך CARIP
- להוסיף 40 µL של חלבון A או G beads מגנטי mL 1.5, שפופרת קשירה נמוכה. הוסף µL 600 ל- PBS לשטוף את החרוזים. למקם את הצינור לתוך ארון המכיל מגנט, דגירה של צינור 1 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר PBS ולסדר מחדש להשעות את החרוזים מגנטי ב 100 µL ל- PBS.
- להוסיף 2-4 µg של נוגדן ברכבת התחתית עם beads מגנטי. דגירה וסובב את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות ב- rpm 8 באמצעות מסובב כדי להקל על הכריכה נוגדן ל החרוזים מגנטי. הוסף את הצינורית אל המדף מגנטי, תקופת דגירה זה של 1 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להסיר PBS.
- להוסיף 200 µL ל- PBS לשטוף את החרוזים מגנטי. כביסה עם PBS מתבצע כדי להסיר IgGs חינם. דגירה וסובב את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בין השלבים לשטוף. לצרף את הצינור המגנט ולהסיר את PBS.
- Immunoprecipitate חלבוני כרומטין מכורך מאת המקננת של כרומטין sonicated לחלץ (4 × 106 תאים לכל שבב), עם החרוזים מגנטי וסובב את הדגימה ב 4 ° C (לילה).
- לשטוף את החרוזים מגנטי. דגירה המדגם בטמפרטורת החדר עם המאגרים הבאים ולסובב את הדגימה 10 דקות עם כל מאגר: פעמיים עם 1 מ"ל של מאגר ריפה (TE (10 מ"מ בטריק-HCl, 1 מ מ EDTA) pH 8.0, 1% X-100 טריטון, 0.1% נתרן deocycholate, 0.1% מרחביות), פעמיים עם 1 מ"ל של c מאגר ריפה ontaining 0.3 M NaCl, פעמיים עם 1 מ"ל LiCl מאגר (0.5% נתרן deocycholate, 0.5% NP40, 0.25 מ' LiCl), פעם אחת עם 1 מ"ל של טה מאגר עם 0.2% טריטון X-100, ופעם 1 מ"ל של טה.
- דה-crosslinking שבב. מחדש להשעות את החרוזים מגנטי ב 100 µL של טה. להוסיף 3 µL למען חברה דמוקרטית 10% ו- 5 µL של proteinase K (20 מ"ג/מ"ל). דגירה המדגם-65 ° צ' (לילה).
הערה: חשוב לכסות את הצינורות במהלך שלב זה עם מצלמות-מיקרוסקופים או בניילון נצמד כדי למנוע התאיידות.- למחרת, היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים כדי לערבב. בשלב הבא, השתמש המדף מגנט כדי להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים. לשטוף את החרוזים מגנטי, להוסיף 100 µL של טה המכילה 0.5 M NaCl, ולאחר מכן לשלב את שני supernatants.
- דה-crosslinking עבור CARIP. מחדש להשעות את החרוזים מגנטי ב 100 µL של טה. להוסיף 3 µL למען חברה דמוקרטית 10% ו- 5 µL של proteinase K (20 מ"ג/מ"ל). דגירה המדגם-65 מעלות צלזיוס במשך 4-12 ח' הדגירה זמן ב 65 ° C צריך להיקבע מדעית עקב השתנות בין סוגי תאים, sonication ותנאי קיבעון, וכו '.
- היפוך ברכבת התחתית 3 - 5 פעמים כדי לערבב, להחיל את הצינורית אל המדף מגנטי, לאחר מכן לעבור את תגובת שיקוע צינור טריים.
- לשטוף את החרוזים מגנטי, להוסיף 100 µL של טה המכילה 0.5 M NaCl, ולאחר מכן לשלב את שני supernatants.
הערה: חשוב להשתמש נוקלאז ללא ריאגנטים (למשל., טה מאגר, למען חברה דמוקרטית, וכו.) כדי למנוע האובדן של DNA או RNA במהלך השלב דה-crosslinking.
- תמצית ה-DNA/RNA באמצעות µL 200 של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (PCI) (25:24:1, וי/v).
הערה: גם רנ א ניתן באמצעות ערכות מסחרי באמצעות הוראות היצרן. לנער 30 s, להסתחרר ב g 10,000 x בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולעבור תגובת שיקוע לרכבת התחתית טריים.- שהרגיז מישהו אחר DNA/RNA, להוסיף 2 µL של GlycoBlue, µL 20 של 3 מ' סודיום אצטט µL 600 של אתנול. מיקס על ידי היפוך ~ 5-8 פעמים, ולמקם את הדגימה על קרח יבש או ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1-2 h.
- Centrifuge הדגימה ב g x 10,000 למשך 30 דקות באמצעות צנטריפוגה שולחני בקירור (4 ° C). האוויר יבש בגדר עבור < 1 דקות ו מחדש להשעות אותו µL 40 של EB מאגר (10 מ מ טריס-HCl). הכנה ספריית שבב-Seq, המשך לשלב 6.
- הסר את הדנ א הקשורים כרומטין דגימות RNA IP באמצעות DNase. להוסיף 10 מאגר DNase x 1 x ריכוז במדגם CARIP. להוסיף 1 µL של DNase עבור עד 10 µg של RNA (התגובה 50 µL). דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לחלץ את הדגימה RNA עם PCI. Resuspend ב H נטולת נוקלאז2O.
5. כפול-גדילי cDNA סינתזה עבור CARIP-Seq
- סינתזה של cDNA הראשון-strand. עבור התגובה הפוכה-שעתוק, להגדיר את התגובה הבאה בצינור המיועד מכונת ה-PCR: 10.5 µL של RNA ו- 1 µL אקראית של hexamer תחל (3 µg/µL).
- דגירה הצינור ב 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי denature את מבנה שניוני, ואחסן אותו בקרח עבור 2 דק לערבב את המרכיבים הבאים: 4 µL הראשון-strand המאגר, 2 µL של 0.1 M DTT, µL 1 של dNTP ו 0.5 RNase החוצה. בשלב הבא, כדי הצינור PCR, להוסיף 7.5 µL של המיקס מאסטר. דגירה הצינור למשך 2 דקות ב 25 º C. להוסיף 1 µL של עילי השני (200 U µL) דגירה כדלקמן: 25 º C למשך 10 דקות, 42 º C למשך 50 דקות, 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, והחזק ב 4 º C.
- השני-strand cDNA סינתזה. מניחים את הצינורית על קרח. לאחר מכן, הוסף את המרכיבים הבאים לפי סדר: 91 µL של diethyl pyrocarbonate (DEPC) התייחס מים, 30 µL של 5 x מאגר התגובה השנייה-strand, 3 µL של dNTP מיקס (10 מ מ), µL 1 של e. Coli DNA ליגאז (10 U/µL), µL 4 של e. Coli DNA פולימראז (10U/µL) , ו- 1 µL של e. Coli RNase H (2U/µL). לערבב על ידי בעדינות vortexing, דגירה ב 16 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
הערה: ערבוב מצליף או היפוך הצינור עשוי לא יספיק לערבב ביסודיות את ריאגנטים. - להוסיף 2 µL של T4 DNA פולימראז, דגירה ב 16 מעלות צלזיוס במשך 5 דק Purify cDNA (כפול גדילי, dscDNA) באמצעות ערכת טיהור PCR. Elute את dscDNA ב 40 µL EB המאגר.
- שבר כפול גדילי cDNA. הטיה cDNA (dscDNA) באמצעות sonifier אמבט של מים וצינור 1.5 mL לגודל של 250-500 bp. Sonication של dscDNA הוא קריטי כדי להפחית פרגמנט גדלים כדי להקל על רצף של תמליל RNA כולו.
- בעת שימוש מודל סטנדרטי של sonifier תנורים, sonicate לדוגמה עבור 3 × 10 דקות או 4 × 10 דקות.
הערה: בשלושה מחזורים אמור לשמש עד 1 µg של RNA הכולל, בעוד ארבעה מחזורים, מומלץ לקבל 1-5 µg של RNA הכולל. Centrifuge את הצינור לזמן קצר לאחר כל מחזור sonication ולתחזק אמבט מים קרים על-ידי הוספת קרח טרי. - בעת שימוש sonifier את פיקו, מומלץ לשימוש שישה מחזורים 1-5 µg של RNA הכולל, רכיבה על אופניים התנאים הבאים (30 עליך, 90 s הנחה). Centrifuge את הצינור לזמן קצר לאחר 2-3 sonication מחזורים. היעילות של sonication יכול להיקבע על-ידי טעינת שבריר של הוטו dscDNA (3-4 µL) על ג'ל agarose (2%). חשוב לבחון מדעית sonication תנאים עקב השתנות בין sonifiers.
- לבצע הכנה ספריית כפי שמתואר בשלב 6 עבור הדור הבא רצפי.
6. שבב-Seq ובנייה ספריית CARIP-Seq
- תיקון קצוות הדנ א באמצעות ערכת סיום-תיקון ה-DNA. ערכה זו משמש להפקת DNA הסתיימה בלאנט. התגובה הזו, להגדיר הבא יהיה mL 1.5, נמוך מחייב צינור: 34 µL של ה-DNA, 5 µL של 2.5 מ מ dNPTs, 5 µL 10 מ מ ATP, 5 µL של 10 x מאגר קצה-תיקון (5 מ מ DTT, אצטט מגנזיום 100 מ מ, אצטט אשלגן 660 מ מ 300 מ"מ טריס-אצטט, pH 7.8), ו- 1 µL של סוף-תיקון תערובת אנזימים (T4 polynucleotide קינאז, T4 DNA פולימראז).
- דגירה המדגם למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- לטהר הדנ א באמצעות ערכת ניקוי התגובה. Elute תוקן קצה-DNA µL 32 מאגר EB ומחוממת מראש (65 ° C). בעוד אנחנו לא quantitate כלל את הריכוז של ה-DNA בעקבות צ'יפ או RNA בעקבות CARIP, לפני הספריה הכנה, מומלץ להתחיל עם פחות 5-10 ng של שבב ה-DNA או CARIP RNA.
- תוספת של הסככה 3' "א" ל- DNA תוקן קצה. להוסיף את הרכיבים mL 1.5, שפופרת קשירה נמוכה: 30 µL של ה-DNA מלמעלה, µL 5 של 10 x מאגר נב 2, µL 1 של dATP מ 10 מ מ מניות, µL 11 של H2O ו- µL 3 5 U / µL Klenow פרגמנט (3 - 5' Exo-) , ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
- דגירה המדגם למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- להשתמש ערכת ניקוי התגובה לטהר את הדנ א. Elute DNA ב 25 µL מאגר EB ומחוממת מראש (65 ° C).
- מאתרים ומפסיקים את המתאם. הוספת הרכיבים הבאים על הקרח: 23 µL של ה-DNA מלמעלה, 3 µL של 10 x T4 DNA ליגאז מאגר, µL 1 annealed PE או ריבוב מתאם (4 מיקרומטר) ו- 3 µL של T4 DNA ליגאז (400 U µL), מערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
הערה: מתאם רצפים גם ניתן לקבל ממקור מסחרי.
רצפים oligonucleotide:
מתאמי PE
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
ריבוב מתאמי
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - דגירה המדגם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לבצע בחירה גודל של ה-DNA באמצעות ג'ל (2%) agarose טרומי. הפעל את הג'ל במשך 10 דקות.
- לסלק את אזור המתאים bp 250-450.
הערה: על ידי גזירה את הג'ל מעל מעל 200 bp, קיימת אפשרות ירידה של זיהום של הדימרים מתאם unligated. חשוב להסיר את כל המתאמים unligated לפני השלב ה-PCR. - להשתמש ערכת חילוץ ג'ל לטהר את הדנ א. Elute ב µL 20 EB המאגר.
- PCR וטיהור ספריה עבור DNA מחוברים דוגם המכיל מתאמי לזווג-end (PE). הוספת המרכיבים בשפופרת PCR: 12 µL של 50% מהדנ א מלמעלה, 12 µL של מים, 25 µL של מיקס מאסטר (Phusion HF), µL 1 של PE PCR פריימר 1.0 ו- µL 1 של פריימר PE PCR 2.0.
הערה: רצפים Oligonucleotide גם ניתן לקבל ממקור מסחרי.
רצפים oligonucleotide:
PE PCR פריימר 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
פריימר PCR PE 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - טיהור PCR וספריה עבור דגימות מחוברים המכיל אינדקס PE מתאמי. הוסף את הרכיבים: 12 µL של 50% מהדנ א מלמעלה, 12 µL של מים, µL 1 של ה-PCR פריימר InPE 1.0 (מדולל 1:2), 1 µL של ה-PCR פריימר InPE 2.0 (מדולל 1:2) ו- µL 1 של ה-PCR פריימר אינדקס (מדולל 1:2).
הערה: רצפים oligonucleotide גם ניתן לקבל ממקור מסחרי.
רצפים oligonucleotide:
ריבוב PCR פריימר 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
ריבוב PCR פריימר 2.0
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PCR-פריימר-אינדקס-רצפים 1-12
PCR פריימר, אינדקס 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
PCR פריימר, אינדקס 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
PCR פריימר, אינדקס 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
PCR פריימר, אינדקס 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
PCR פריימר, אינדקס 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
PCR פריימר, אינדקס 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
PCR פריימר, אינדקס 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
PCR פריימר, אינדקס 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
PCR פריימר, אינדקס 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
PCR פריימר, אינדקס 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
PCR פריימר, אינדקס 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
PCR פריימר, אינדקס 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - לבצע PCR רכיבה על אופניים באמצעות התנאים הבאים (denature ל 30 s ב 98 ° C, 18 מחזורים של 10 s ב 98 ° C, 30 s ב 65° C, 30 s ב-72 מעלות, 5 דקות ב-72 מעלות, להחזיק ב 4 ° C).
הערה: מספר מחזורי PCR צריך להיקבע מדעית. - גודל מבחר מוצרי ה-PCR. להפעיל את ה-DNA על טרומי E-ג'ל EX (2%) או תוצרת בית 2% ג'ל (agarose), לסלק את האזור bp 300-500.
- להשתמש ערכת חילוץ ג'ל כדי לטהר את הדנ א של הג'ל. Elute המוצר הסופי PCR ב 20 µL EB המאגר.
- להשתמש fluorometer כדי למדוד את הריכוז של הספרייה. לבצע רצף הדור הבא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהצלחה חקרנו את הכריכה ברמת הגנום של H3K4me3, H3K4me2 ו- KDM5B ES תאים באמצעות פרוטוקול זה צ'יפ-Seq6. ES התאים היו בתרבית בתנאי נטולת מזין (איור 1), קישורים צולבים כמתואר לעיל. Sonication לאחר מכן שבוצעה כמתואר בשלב 3.2 של פרוטוקול שבב-Seq, והוא מוערך על ידי הפעלת הדנ א על 2% agarose ג'ל (איור 2). בשלב הבא, שבב בוצע כפי שמתואר בשלב 4, ספריית הכנה בוצע כפי שמתואר בשלב 6. שבב-Seq ספריות היו רציף על פלטפורמת הדור הבא רצפי. נציג תצוגות דפדפן UCSC מותאמות אישית חושפים העשרה של H3K4me3, H3K4me2, KDM5B את הגן pluripotency ליבה POU5F1 (איור 3 א), ובבית האשכול HOXC (איור 3B). CARIP-Seq בוצעה גם על-ידי ביצוע הפרוטוקול כפי שמתואר שלבים 4-6. תצוגת הדפדפן UCSC נציג מגלה העשרה של RNA הקשורים H4K20me3 (CARIP-Seq) ותפוסה H4K20me3 (צ'יפ-Seq)-לוקוסים תאים ES (איור 4). האות CARIP-Seq מדגים כי בזמן הרנ א משויך H4K20me3, זה אינו מצביע בהכרח כי הוא מקיים אינטראקציה עם מיקומה המוצג. CARIP-Seq datasets ניתן לנתח בצורה דומה כמו datasets שבב-Seq. הנתונים המופקים העכבר ES תא CARIP-Seq ו שבב-Seq ניסויים ניתן שניהם ליישר את הגנום הפניה (למשל., mm9, mm10) באמצעות bowtie221. שבב-Seq ואזורים CARIP-Seq מועשר שניהם ניתן לזהות באמצעות תוכניות התקשרות שיא, כגון "מרחבי קיבוץ באשכולות עבור זיהוי של ChIP-Enriched אזורים" (SICER)22 או23,MACS24. מכיוון CARIP-Seq datasets סביר כוללות פסגות רחבה, חשוב להשתמש אלגוריתם לזיהוי פסגות רחבה וחד. בעוד הפרוטוקולים המתואר בכתב היד מוטבו לביצוע שבב-Seq ו- CARIP-Seq באמצעות תאים ES, פרוטוקולים אלה צריך גם להיות מתאימים להערכת חלבון-DNA ואינטראקציות הקשורים כרומטין RNA סוגי תאים אחרים.
איור 1: מזין נטול התרבות של תאים ES- (א) תכנון ניסויים. (ב) ES התאים תרבותי על iMEFs ב ES תא המדיה המכילה LIF, או בתנאים ללא מזין עם ES תא המדיה המכילה LIF, GSK3i (ג) או (ד) GSK3i, MEKi (2i). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Sonication של כרומטין תא תפור ES- תפור ES התאים היו sonicated באמצעות sonifier עם microtip מחזורים 18 (40% משרעת, 30 s על, ומנוחה s 30). Crosslinking היתה הפוכה, RNase עיכול בוצעה לאחר מכן להסיר את ה-RNA. דנ א היה טהור באמצעות PCI ולהפעיל של ג'ל agarose (2%). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג שבב-Seq ניתוח של היסטון שינוי שינויים אנזים ו היסטון תאים ES- תצוגות מותאמות אישית של הדפדפן UCSC של H3K4me3, H3K4me2 KDM5B את pluripotency-הרגולטור (א) POU5F1, האשכול (ב) HOXC ES תאים (תג מנורמל צפיפות (RPBM), קרא לכל בסיס לכל קורא מיליון). הערה את החפיפה בין איגוד KDM5B ותפוסה H3K4me3/2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: נציג CARIP-Seq ניתוח של RNA הקשורים עם שינוי היסטון, צ'יפ-Seq תאים ES- UCSC דפדפן תצוגות של אותות H4K20me3 CARIP-Seq ו H4K20me3 שבב-Seq תאים ES (תג מנורמל צפיפות (RPBM), קרא לכל בסיס לכל קורא מיליון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שבב-Seq היא שיטה שימושית כדי להעריך את המיקום של אינטראקציות חלבון העולמי-DNA (למשל., גורמי שעתוק/שינוי שינויים אנזימים/היסטון ודנ א היסטון) תאים ES, בעוד פרוטוקול CARIP-Seq פיתח הוא שימושי חוקר את השיוך ברמת הגנום של RNAs המרכיבים כרומטין. שבב-Seq הוא כלי בסיסי המשמש כדי להעריך נופים epigenetic של תאים ES, סוגי תאים אחרים. האיכות של שבב-Seq וספריות CARIP-Seq תלויה ברובה נוגדנים שבב-כיתה. ההתאמה של נוגדנים עבור שבב-Seq יכול להיקבע מדעית על ידי ביצוע שבב-PCR, איפה ≥ 3 כדי 5-fold העשרה-אזורי בקרה חיובית ביחס אזורים ריקים. צריך להספיק לייצר באיכות גבוהה שבב-Seq נתונים25. באופן דומה, נוגדנים ניתן לבחון את התאמתם עבור CARIP-Seq באופן דומה כמתואר עבור שבב-Seq עם שינויים מזעריים. בעקבות הצעד RNA IP בפרוטוקול CARIP כמתואר בסעיף שיטות לעיל, הפוכה-תמלול PCR צריכה להתבצע כדי להפיק cDNA, אשר יכול לשמש כתבנית כדי לבצע Q-RT-PCR. מומלץ להעריך את העשרת בעקבות צ'יפ או CARIP על מספר אזורים גנומית. ישנם שיקולים נוספים כדי לבדוק בעת הערכת האיכות של נוגדנים עבור אסימון או CARIP. לדוגמה, ניתן למטב את לכתחילה של מאגרים המשמשים שבב CARIP על ידי שינוי הריכוז של NaCl: ריכוז נמוך של NaCl מתאים נוגדנים ספציפיים מאוד, בעוד ריכוז גבוה של NaCl עשוי להיות מועיל עבור נוגדנים עם כריכת שאינם ספציפיים. לגבי הכנת ספריה עבור הדור הבא רצפי, תחל מותאם אישית ואינדקסים יכול לשמש גם במקום oligonucleotides רכשה מסחרית. עם זאת, חשוב לציין כי כולל שינוי phosphorothioate בין שני בסיסים בקצה 3' הוכח כדי למנוע עיכול נוקלאז26. צד שלישי RNA-Seq או שבב-Seq ערכות בניה ספריה עשוי לשמש גם כדי ליצור ספריות עבור רצף של CARIP ו שבב דגימות, בהתאמה. עם זאת, חשוב לבחון את ערכות כדי להעריך את היעילות שלהם בספריות איכות ייצור עבור הדור הבא רצפי הנתונים באופן אמפירי. פרוטוקולים נוספים עשויים גם להיות מועסק כדי לבצע הכנה ספריית שבב-Seq, כגון ChIPmentation27. עם זאת, עיבוד של ChIPmentation בפרוטוקול שבב-Seq המתוארים כאן ידרוש שינויים נוספים ואופטימיזציה עוד יותר.
כאן, אנו מתארים פרוטוקולים של השבב, CARIP מוטבו באמצעות מספרי מתונה של תאים (4 × 106 תאים לכל IP). בעוד הפרוטוקול שבב יכול להתבצע באמצעות מספרי הטלפון הנייד נמוך עד בינוני (105 כדי 106 תאים), לא ערכנו CARIP-Seq באמצעות תאים6 × 10 פחות מ-2. עם זאת, באמצעות בדיקה מדעית קיבוע שונים ותנאי sonication, זה אפשרי כי פרוטוקול זה יפעלו בהצלחה באמצעות מספר קטן של תאים.
לסיכום, צ'יפ-Seq ו- CARIP-Seq שימושיים ליצירת מפות עולמי של חלבונים הקשורים כרומטין RNAs תאים ES, בהתאמה. בעוד פרוטוקולים אלה מוטבו עבור תאים ES, הם ניתן למטב ליצירת מפות כרומטין באמצעות מגוון רחב של סוגי רקמות וקווי בתרבית של תאים. פרוטוקולים אלה עשויים גם להיות מוטבת ליצירת תא בודד שבב-Seq או ספריות CARIP-Seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי ויין סטייט, Karmanos סרטן אוניברסיטאי, מענק מן הלאומי ללב, ריאות ודם המכון (1K22HL126842-01A1) הוענק B.L.K. עבודה זו מנוצל ויין המדינה אוניברסיטת גבוהה ביצועי מחשוב ברשת עבור משאבים חישובית (< https://www.grid.wayne.edu/>). אנו מודים ג'יג'י Kurup על סיוע עם ניתוח נתונים CARIP-Seq.
התרומות של המחברים:
B.L.K. היגו בשיטת CARIP-Seq, תוכנן ביצעו ניסויים שבב-Seq ו- CARIP-Seq, ניתח את הנתונים רצף ו ניסח את כתב היד. כל המחברים לקרוא, אישר את הגרסה הסופית של כתב היד הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
