CARIP-Seq और चिप-Seq: क्रोमेटिन-संबद्ध RNAs और प्रोटीन-भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में डीएनए बातचीत की पहचान करने के तरीके
Summary
यहाँ, हम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय तैयारी सहित चिप Seq और CARIP-Seq, प्रदर्शन करने के लिए तरीकों का वर्णन, ES कोशिकाओं में वैश्विक epigenomic और क्रोमेटिन-जुड़े आरएनए नक्शे उत्पन्न करने के लिए.
Abstract
भ्रूण स्टेम (ते) सेल स्व नवीकरण और भेदभाव बाह्य संकेतों और प्रतिलेखन कारकों, epigenetic नियामकों के आंतरिक नेटवर्क द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और histones के बाद अनुवाद संशोधनों कि combinatorially प्रभाव जीन आसपास के जीन की अभिव्यक्ति राज्य । आरएनए भी क्रोमेटिन गतिशीलता और जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए विभिन्न प्रोटीन के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया गया है । क्रोमेटिन-एसोसिएटेड आरएनए immunoprecipitation (CARIP) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (CARIP-Seq) द्वारा पीछा RNAs प्रोटीन के साथ जुड़े क्रोमेटिन सर्वेक्षण करने के लिए एक उपंयास विधि है, जबकि क्रोमेटिन immunoprecipitation अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा पीछा ( चिप-Seq) ES कोशिकाओं में एक वैश्विक पैमाने पर histones, प्रतिलेखन कारकों, और epigenetic संशोधक के पोस्ट-शोधों के संशोधन के स्थान को मैप करने के लिए एक शक्तिशाली जीनोमिक्स तकनीक है । यहां, हम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय निर्माण सहित CARIP-Seq और चिप-Seq, प्रदर्शन करने के तरीकों का वर्णन, वैश्विक क्रोमेटिन-संबद्ध आरएनए और ES कोशिकाओं में epigenomic नक्शे उत्पन्न करने के लिए.
Introduction
भ्रूण स्टेम (ES) सेल भाग्य निर्णय extracellular संकेतों और transcriptional-नियामकों के एक मेजबान के बीच संचार द्वारा विनियमित रहे हैं, हिस्टोन संशोधक सहित, और हिस्टोन पूंछ के बाद अनुवाद संशोधन । ये बातचीत दो राज्यों में से एक में क्रोमेटिन की क्रोमेटिन पहुंच और पैकेजिंग की सुविधा प्रदान करते हैं: euchromatin, जो खुला और transcriptionally सक्रिय है, और heterochromatin, जो कॉम्पैक्ट है और आम तौर पर निष्क्रिय transcriptionally । डीएनए अनुक्रम के साथ प्रतिलेखन कारकों-विशिष्ट बाध्यकारी समानताएं और epigenetic संशोधक euchromatic क्षेत्रों के साथ सहयोगी जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में भाग लेने के लिए । अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विधियों, चिप-Seq1सहित, जीनोम-वाइड transcriptional नेटवर्क है कि ES सेल सेल्फ नवीकरण और pluripotency2,3,4 के लिए मौलिक है मानचित्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ,5,6. इसके अलावा, जबकि आरएनए immunopreciation अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा पीछा किया (चीर-Seq) शाही सेना के7 मूल्यांकन-प्रोटीन बातचीत सुझाव है कि डीएनए बंधन प्रोटीन RNAs के साथ बातचीत transcriptional घटनाओं को विनियमित करने के लिए7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, कुछ अध्ययनों क्रोमेटिन12, या आरएनए और हिस्टोन संशोधनों के बीच वैश्विक बातचीत के साथ जुड़े RNAs के जीनोम व्यापक स्थानीयकरण की जांच की है । लंबे समय से गैर कोडिंग RNAs (lncRNAs) RNAs के एक वर्ग है जो क्रोमेटिन से जुड़े प्रोटीन13,14,15की गतिविधि को विनियमित पाया गया है । उदाहरण के लिए, Xist एक lncRNA है कि, महिला स्तनधारी कोशिकाओं में विनियमित, एक एक्स गुणसूत्र की निष्क्रियता, epigenetic दमन के16,17की भर्ती के माध्यम से । हालांकि, क्रोमेटिन से जुड़े RNAs का पूरा स्पेक्ट्रम काफी हद तक अनजान है । यहां, हम एक उपंयास प्रोटोकॉल, क्रोमेटिन-एसोसिएटेड आरएनए immunoprecipitation (CARIP) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (CARIP-Seq), के बाद का वर्णन करने के लिए ES कोशिकाओं में एक जीनोम व्यापक आधार पर क्रोमेटिन संबद्ध RNAs की पहचान, पुस्तकालय की तैयारी सहित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, और चिप-Seq हिस्टोन संशोधनों, प्रतिलेखन कारकों, और epigenetic संशोधक के वैश्विक अधिभोग नक्शा करने के लिए । अंय चीर-Seq तरीकों के विपरीत7, CARIP-Seq में crosslinking और sonication के चरण शामिल हैं, जो RNAs से संबद्ध क्रोमेटिन की प्रत्यक्ष पहचान के लिए अनुमति देते हैं । एक साथ, चिप-Seq जीनोम-वाइड प्रोटीन-डीएनए बातचीत की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जबकि CARIP-Seq क्रोमेटिन घटकों के साथ जुड़े सर्वेक्षण RNAs के लिए एक शक्तिशाली तरीका है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
चिप Seq वैश्विक प्रोटीन के स्थान का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है डीएनए बातचीत (उदा, प्रतिलेखन कारकों/ES कोशिकाओं में एंजाइमों/हिस्टोन संशोधनों और डीएनए को संशोधित हिस्टोन), जबकि नव विकसित CAR…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम वेन राज्य विश्वविद्यालय, Karmanos कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े और रक्त संस्थान (1K22HL126842-01A1) से अनुदान का समर्थन किया गया था B.L.K. को संमानित किया इस काम की गणना संसाधनों के लिए वेन राज्य विश्वविद्यालय उच्च प्रदर्शन कंप्यूटिंग ग्रिड का उपयोग () । CARIP-Seq डाटा एनालिसिस के साथ सहायता के लिए हम जीजी कुरुप को धन्यवाद देते हैं ।
लेखकों का योगदान:
B.L.K. CARIP-Seq विधि की कल्पना, डिजाइन और चिप Seq और CARIP-Seq प्रयोगों से बाहर किया, अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण, और पांडुलिपि का मसौदा तैयार । सभी लेखकों को पढ़ा है और इस पांडुलिपि के अंतिम संस्करण को मंजूरी दे दी है ।
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
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