Summary
Hier beschrijven we methoden voor het uitvoeren van ChIP-Seq en CARIP-Seq, met inbegrip van de voorbereiding van de bibliotheek van next-generation sequencing, voor het genereren van wereldwijde epigenomic en chromatine-geassocieerde RNA kaarten in ES-cellen.
Abstract
Embryonale stamcellen (ES) cel zelf-vernieuwing en differentiatie wordt beheerst door Extrinsieke signalen en intrinsieke netwerken van transcriptiefactoren, epigenetische regelgevers en na vertaling wijzigingen van histonen dat combinatorisch het gen beïnvloeden staat van de expressie van genen die in de buurt. RNA is ook aangetoond dat interactie met verschillende eiwitten chromatine dynamiek en expressie van genen te reguleren. Chromatine-geassocieerde RNA immunoprecipitation (CARIP) gevolgd door sequentiebepaling van volgende-generatie (CARIP-Seq) is een nieuwe methode om RNAs gekoppeld chromatine eiwitten, terwijl de chromatine immunoprecipitation, gevolgd door sequentiebepaling van volgende-generatie (enquête ChIP-Seq) is een krachtige genomics techniek om de kaart van de locatie van de posttranslationele wijziging van histones, transcriptiefactoren en epigenetische modifiers op een wereldwijde schaal-in ES-cellen. Hier beschrijven we methoden voor het uitvoeren van CARIP-Seq en ChIP-Seq, met inbegrip van bibliotheek constructie voor de volgende generatie sequencing, voor het genereren van globale chromatine-geassocieerde RNA en epigenomic kaarten in ES-cellen.
Introduction
Embryonale stamcellen (ES) cel lot besluiten worden gereguleerd door de communicatie tussen de extracellulaire signalen en een heleboel transcriptionele-regelgevers, met inbegrip van Histon modifiers, en na vertaling wijziging van Histon staarten. Deze interacties vergemakkelijken chromatine toegankelijkheid en verpakking van de chromatine in één van twee staten: euchromatine, die is geopend en transcriptionally actief, en heterochromatin, die is compact en over het algemeen transcriptionally inactieve. Transcriptiefactoren met DNA sequentie-specifieke bindende affiniteiten en epigenetische modifiers vennoot met euchromatique regio's te nemen bij het beheersen van de genexpressie. Volgende-generatie sequencing methoden, met inbegrip van ChIP-Seq1, zijn instrumentale in kaart brengen van genoom-brede transcriptionele netwerken die fundamenteel zijn voor ES cel zelf-vernieuwing en pluripotent2,3,4 ,5,6. Bovendien, terwijl RNA immunopreciation gevolgd door de volgende-generatie sequencing (RIP-Seq)7 evaluaties van RNA-eiwit interacties suggereren dat DNA-bindende proteïnen interactie met RNAs te reguleren transcriptionele gebeurtenissen7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, weinig studies hebben onderzocht de genoom-brede lokalisatie van RNAs chromatine12of globale interactie tussen RNA en histone modificaties is gekoppeld. Lang niet-coderende RNAs (lncRNAs) vormen een klasse van RNAs die zijn gevonden voor het regelen van de activiteit van chromatine-geassocieerde eiwitten13,14,15. Bijvoorbeeld, is Xist een lncRNA die wordt geregeld, in vrouwelijke zoogdiercellen inactivatie van één X-chromosoom, door de aanwerving van epigenetische repressors16,17. Het volledige spectrum van RNAs gekoppeld chromatine is echter grotendeels onbekend. Hier beschrijven we een nieuw protocol, chromatine-geassocieerde RNA immunoprecipitation (CARIP) gevolgd door sequentiebepaling van de volgende generatie (CARIP-Seq), te identificeren van chromatine-geassocieerde RNAs op basis van genoom-brede in ES-cellen, met inbegrip van bibliotheek voorbereiding voor volgende-generatie sequencing en ChIP-Seq global bezetting van Histon modificaties, transcriptiefactoren en epigenetische parameters toewijzen. In tegenstelling tot andere RIP-Seq methoden7bevat CARIP-Seq crosslinking en ultrasoonapparaat stappen, waarmee voor de directe identificatie van de RNAs chromatine is gekoppeld. Samen ChIP-Seq is een krachtig hulpmiddel om te identificeren van genoom-brede eiwit-DNA interacties, terwijl CARIP-Seq is een krachtige methode om enquête RNAs chromatine onderdelen zijn gekoppeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cultuur van muis ES cellen in Feeder-vrij voorwaarden.
Opmerking: Muis ES-cellen worden conventioneel gekweekt in media op een cel cultuur schotel bedekt met gelatine en een mono-laag van muis embryonale fibroblasten (MEF), die mitotically geïnactiveerd (iMEFs). Echter, moet MEFs worden verwijderd vóór downstream epigenetische of expressie analyses om te voorkomen dat de besmetting van chromatine MEF-geassocieerde en RNA.
- Voorbereiding van een feeder-laag: gelatine jas van een 6-well cel cultuur plaat door toevoeging van 2 mL 0,1% gelatine in water, en Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 20-30 min.
- 10% DMEM high-glucose media met 2 mM L-glutamine, 10% foetale runderserum (FBS) en 1 x penicilline/streptomycine voor te bereiden.
- MEFs van E13.5 tot en met E14.5 muizen18,19 te isoleren of het verwerven van een commerciële leverancier. Mitotically inactivering van MEFs door de behandeling met mitomycine C of gamma bestraling met standaardprotocollen19. U kunt ook kunnen mitotically geïnactiveerd MEFs (iMEFs) worden verkregen bij een commerciële leverancier.
- MEFs kweken. Vooraf warm MEF media bij 37 ° C, ontdooi bevroren Injectieflacon van iMEFs en cultuur in 10% FBS MEF media bij 37 ° C met 5% CO2. Plaat MEFs op ~ 200.000 cellen per putje van een schotel 6-well cultuur.
- Het kweken van ES-cellen op een laag van cellen van de feeder (iMEFs).
- 12-24 uur na de plating iMEFs, warme vooraf een tube van 50 mL van ES cel media (DMEM high-glucose, LIF (10 ng/mL), 15% ES cel-gekwalificeerde FBS, 1 × cel-cultuur gekwalificeerd 2-mercaptoethanol, 1 × glutamine, niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1 × penicilline/streptomycine), bij 37 ° C met 5% CO2.
- De media van de cel cultuur platen met iMEFs gecombineerd, resuspendeer de cellen van de ES in 2 mL zuiver media (na het ontdooien bij 37 ° C) en de cellen op de laag van iMEFs plaat. Bij het plaatsen van de schotel van cultuur in de incubator, is het belangrijk om de schotel in de vorm van een "t" gelijkmatig verdelen de cellen en om te voorkomen dat samenvoeging naar het midden van de schotel.
- Passage van de ES-cellen op feeder-vrije gelatine beklede gerechten. Passage de ES-cellen voordat ze confluente worden. ES cel kolonies behouden zelf-vernieuwing best als de koloniën gelijkmatig verdeelde en niet confluent zijn. De aanwezigheid van vele ES cel koloniën die zijn ontroerend geeft aan dat de celdichtheid te hoog is.
- Jas een 6-well cultuur schotel met gelatine zoals hierboven beschreven. Incubeer 0,25% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende ~ 10-15 min naar vooraf warm trypsine.
- Volgende, passage de ES-cellen door eerste wassen met 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en toevoeging van 1 mL trypsine-EDTA-oplossing van 0,25%. Wacht 1-2 min voor de koloniën om los te maken. De kolonies tot de schorsing van een eencellige distantiëren door pipetteren met een 1 mL tip voor ~ 5 keer.
- Gebruik een microscoop om te bevestigen eencellige dissociatie van de ES-cellen. Om de reactie te quench, of te "neutraliseren" de trypsine, 10% FBS MEF media toevoegen. Centrifugeer de cellen bij 300 x g bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten, en de media gecombineerd.
- Resuspendeer de cellulaire pellet in 2 mL zuiver media (ES cel) aangevuld met glycogeen synthase kinase-3 (GSK3) remmer (CHIR99021; GSK3i), of 2i (MEKi/GSK3i) voorwaarden (2-3 µM GSK3i: CHIR99021, 1 µM MEKi: PD0325901).
- Gecombineerd de gelatine van de cel cultuur schotel, voeg toe 2 mL medium met SER's naar de schotel en zet de schotel in de 37 ° C incubator (figuur 1A-D). Dual remming van GSK3i en MEKi bevordert grondtoestand naïef pluripotent van ES-cellen in de afwezigheid van feeder cellen (iMEFs) en zonder serum20. ES-cellen moeten twee tot drie keer te verwijderen MEFs alvorens tot crosslinking gepasseerd.
2. Crosslinking van ES cellen voor ChIP- en CARIP
- Oogst de ES-cellen door wassen met PBS, dan toevoegen van 0,25% trypsine vooraf opgewarmd bij 37 ° C. Incubeer de cellen gedurende enkele minuten bij kamertemperatuur. Vermijd over trypsinebehandeling van ES-cellen, die tot celdood leiden zal. Gebruik een microscoop om te evalueren van eencellige dissociatie.
- Spijsvertering van de trypsine Quench zoals hierboven beschreven voor passaging ES-cellen, en de cellen bij 300 x g bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten centrifugeren.
- Resuspendeer de cellen in voorverwarmde (37 ° C) MEF media (10% FBS/DMEM) 2 × 106 cellen/ml.
- Naar dwarslijn de cellen, 37% formaldehyde oplossing toevoegen om een eindconcentratie van 1%, en de cellen in een conische buis (15 mL of 50 mL) incuberen bij 37 ° C voor 8 min. omkeren de buis meerdere malen tijdens de periode van 8 min tot homogene fixatie.
Opmerking: De tijd van de fixatie kan empirisch worden geoptimaliseerd voor CARIP. Als de tijd van de fixatie wordt gewijzigd, moet het aantal ultrasoonapparaat cycli ook worden aangepast. Ook stijgt de temperatuur van 37 ° C crosslinking efficiëntie ten opzichte van crosslinking bij kamertemperatuur. De temperatuur van fixatie kan empirisch worden geoptimaliseerd. - Stop de reactie van de fixatie, het toevoegen van 1,25 M glycine (vooraf gekoeld bij 4 ° C) tot een concentratie van 0,125 M. omkeren de buis bij 8 omwentelingen per minuut met behulp van een rotator gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de media gecombineerd.
- De cel pellet met vooraf gekoeld PBS (4 ° C) wassen, centrifugeren van het monster bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gecombineerd PBS. De cellen met PBS opnieuw wassen. Volgende, aliquoot 15 × 106 cellen per tube 15 mL.
- De cel pellet bevriezen door het plaatsen van het in vloeibare stikstof voor 1 min, op droog ijs voor 5 min, of onmiddellijk van kracht worden bij-80 ° C.
Opmerking: Vaste ES cel pellets kunnen worden opgeslagen voor maximaal 6 maanden zonder verminderde kwaliteit in downstream experimenten.
3. chromatine ultrasoonapparaat voor ChIP- en CARIP
- Het ontdooien van vaste ES cel pellet op ijs. Resuspendeer de pellet cel in ultrasoonapparaat buffer (2,5 mL). Voor transcriptiefactoren of epigenetische regelgevers (proteïne factoren), resuspendeer de pellet in 1 x TE, 1 mM PMSF, 1 x proteïnase inhibitor cocktail. Voor histone modificaties, resuspendeer de pellet in 1 x TE, 0,1% SDS, 1 mM PMSF, 1 x proteïnase inhibitor van de omwenteling.
Opmerking: Terwijl de toevoeging van SDS ultrasoonapparaat efficiëntie verbetert, het wellicht niet gunstig zijn voor de evaluatie van bepaalde bestanddelen van de chromatine of transcriptiefactoren. - Bewerk voor chromatine immunoprecipitation (ChIP), ultrasone trillingen ten chromatine met 14-18 cycli (30 s op, 30 s rest) bij 40% amplitude. Voor chromatine-geassocieerde RNA immunoprecipitation (CARIP), verminderen het aantal ultrasoonapparaat cycli (8-10 cycli). Dankzij mobiele, fixatie en sonifier variabiliteit, moeten voorwaarden voor ultrasoonapparaat empirisch worden vastgesteld.
- Supplement de ultrasoonapparaat buffer met 28 µL van 10% SDS voor eiwit-factoren, 28 µL van natrium-deoxycholate, en 0,28 mL 10% Triton-X100, en meng goed.
Opmerking: Toevoeging van deze componenten aan de buffer ultrasoonapparaat genereert RIPA buffer. - Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C om vooraf duidelijk de chromatine. De bovendrijvende vloeistof naar een verse buis en doorgaan met chromatine immunoprecipitation.
- U kunt ook kan sonicated chromatine worden achtergelaten bij-80 ° C tot gebruik. De opslag van sonicated chromatine bij-80 ° C kan echter leiden tot verminderde kwaliteit voor eiwit-factor ChIP.
4. chIP en CARIP proces
- 40 µL van EiwitA of G magnetische kralen toevoegen aan een 1,5 mL, lage bindende buis. Voeg 600 µL van PBS te wassen van de kralen. Plaats de buis op een rek met een magneet, laat de buis voor 1 minuut bij kamertemperatuur inwerken, verwijderen van PBS en resuspendeer de magnetische kralen in 100 µL van PBS.
- 2-4 µg van antilichaam aan de buis met magnetische kralen toevoegen. Incubeer en draai de buis bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten bij 8 omwentelingen per minuut met behulp van een rotator te vergemakkelijken van de antilichaam binding aan de magnetische kralen. Invoegen van de buis op het magnetische rek, laat het 1 minuut bij kamertemperatuur inwerken en deze vervolgens verwijdert PBS.
- Voeg 200 µL van PBS te wassen van de magnetische kralen. Wassen met PBS uitgevoerd om de gratis IgGs verwijderen. Incubeer en draai de buis bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten tussen wassen stappen. Koppelen van de buis aan de magneet en verwijder de PBS.
- Immunoprecipitate chromatine-gebonden eiwitten door het broeden van de sonicated chromatine Extraheer (4 × 106 cellen per spaander), met de magnetische kralen en roteren van het monster bij 4 ° C ('s nachts).
- Wassen van de magnetische kralen. Incubeer het monster bij kamertemperatuur met de volgende buffers en draai het monster gedurende 10 minuten met elke buffer: tweemaal met 1 mL van de buffer RIPA (TE (10 mM Tric-HCl, 1 mM EDTA) pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% natrium deocycholate, 0,1% SDS), tweemaal met 1 mL van RIPA buffer c ontaining 0,3 M NaCl, tweemaal met 1 mL van LiCl buffer (0,5% natrium deocycholate van 0,5% NP40, 0,25 M LiCl), één keer met 1 mL TE buffer met 0,2% Triton X-100, en een keer met 1 mL TE.
- De-crosslinking voor ChIP. Resuspendeer de magnetische kralen in 100 µL van TE. Voeg 3 µL van 10% SDS en 5 µL van proteïnase K (20 mg/mL). Incubeer het monster bij 65 ° C ('s nachts).
Opmerking: Het is belangrijk om de buizen dekking tijdens deze stap met parafilm of plastic wrap ter voorkoming van verdamping.- De volgende dag, omkeren de buis meerdere malen te mengen. Gebruik vervolgens het magneet rek het supernatant overbrengen naar een verse buis. Wassen van de magnetische kralen, voeg 100 µL voor TE met 0,5 M NaCl en vervolgens combineren de twee supernatant.
- De-crosslinking voor CARIP. Resuspendeer de magnetische kralen in 100 µL van TE. Voeg 3 µL van 10% SDS en 5 µL van proteïnase K (20 mg/mL). Incubeer het monster bij 65 ° C gedurende 4 tot en met 12 h. incubatie tijd bij 65 ° C moet worden empirisch bepaald als gevolg van de variabiliteit tussen de celtypes, ultrasoonapparaat en fixatie, enz.
- Omkeren van de buis 3 - 5 keer te mengen, toepassing van de buis op het magnetische rek, en vervolgens het supernatant te verplaatsen naar een verse buis.
- Wassen van de magnetische kralen, voeg 100 µL voor TE met 0,5 M NaCl en vervolgens combineren de twee supernatant.
Opmerking: Het is belangrijk te gebruiken reagentia nuclease-gratis (bv., TE buffer, SDS, enz.) om te voorkomen dat het verlies van DNA of RNA dat tijdens de de-crosslinking stap.
- Uittreksel DNA/RNA met behulp van 200 µL van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (PCI) (25:24:1, v/v).
Opmerking: RNA kan ook worden geëxtraheerd met behulp van commerciële kits met behulp van de instructies van de fabrikant. Schudden voor 30 s, draaien op 10.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, en supernatant naar een verse buis.- Toevoegen om te precipiteren DNA/RNA, 2 µL van GlycoBlue, 20 µL van 3 M natriumacetaat en 600 µL van ethanol. Meng door het omkeren van de ~ 5-8 keer, en plaats het monster op droog ijs of bij-80 ° C gedurende ten minste 1-2 uur.
- Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 30 min met behulp van een centrifuge gekoelde (4 ° C)-tafelblad. Lucht drogen de pellet voor < 1 min en resuspendeer in 40 µL van EB buffer (10 mM Tris-HCl). Voorbereiding ChIP-Seq bibliotheek, ga verder met stap 6.
- DNA van chromatine-geassocieerde RNA IP monsters met behulp van DNase verwijderen. Voeg toe 10 x DNase buffer aan 1 x concentratie in de CARIP monster. Voeg 1 µL van DNase voor tot 10 µg RNA (50 µL reactie). Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 30 min. Extract het RNA monster met PCI. Resuspendeer in nuclease-vrije H2O.
5. double-stranded cDNA synthese voor CARIP-Seq
- Synthese van eerste-strand cDNA. Voor de omgekeerde-transcriptie-reactie, stelt de volgende reactie in een buis die is ontworpen voor een PCR-machine: 10.5 µL van RNA en 1 µL willekeurige hexamer inleidingen (3 µg/µL).
- Incubeer de buis bij 65 ° C gedurende 5 min te denatureren van de secundaire structuur en sla deze op het ijs voor 2 min. Mix de volgende onderdelen: 4 µL van eerste-onderdeel buffer, 2 µL van 0,1 M DTT, 1 µL van dNTP en 0,5 RNase uit. Voeg vervolgens aan de PCR-buis, 7,5 µL van de master mix. Incubeer de buis gedurende 2 minuten bij 25 ° C. Voeg 1 µL van Superscript II (200 U/µL) en incubeer als volgt: 25 ° C gedurende 10 min, 42 ° C gedurende 50 min, 70 ° C gedurende 15 minuten, en houd bij 4 ° C.
- Tweede-strand cDNA synthese. Plaats de buis op ijs. Voeg vervolgens de volgende onderdelen in volgorde: 91 µL van diethyl-pyrocarbonate (DEPC) behandeld water, 30 µL van 5 x tweede fronten reactie buffer, 3 µL van dNTP mix (10 mM), 1 µL van E. Coli DNA ligase-(10 U/µL), 4 µL van de Polymerase van DNA E.coli (10U/µL) , en 1 µL van E. Coli RNase H (2U/µL). Meng door zachtjes vortexing en Incubeer bij 16 ° C gedurende 2 uur.
Opmerking: Mengen door flicking of omkeren van de buis kan niet volstaan om te grondig Meng de reagentia. - Voeg 2 µL van de Polymerase van het DNA van de T4 en Incubeer bij 16 ° C gedurende 5 min. zuiveren cDNA (double-stranded, dscDNA) met behulp van PCR zuivering kit. Elueer de dscDNA in 40 µL van EB buffer.
- Fragment double-stranded cDNA. Schuintrekken cDNA (dscDNA) met behulp van een water bad sonifier en een tube 1,5 mL tot een grootte van 250-500 bp. ultrasoonapparaat van dscDNA is cruciaal voor het verminderen van fragment maten om de volgorde van de volledige transcriptie van RNA.
- Wanneer u een standaardmodel voor een water-bad sonifier, bewerk ultrasone trillingen ten het monster voor de 3 × 10 min, of 4 × 10 min.
Opmerking: Drie cycli moeten worden gebruikt voor maximaal 1 µg totaal RNA, terwijl vier cycli worden aanbevolen voor 1-5 µg totaal RNA. Centrifugeer de buis kort na elke cyclus ultrasoonapparaat en onderhouden van een bad met koud water door toevoeging van vers ijs. - Bij het gebruik van een Pico-sonifier, het is aanbevolen om gebruik van zes cycli voor 1-5 µg totaal RNA en fietsen oorzaken (30 s op, 90 s af). Centrifugeer de buis kort na 2-3 ultrasoonapparaat cycli. De efficiëntie van ultrasoonapparaat kan worden bepaald door het laden van een fractie van de sheared dscDNA (3-4 µL) op een agarose gel (2%). Het is belangrijk om de empirisch testen ultrasoonapparaat omstandigheden als gevolg van de variabiliteit tussen de sonifiers.
- Voert bibliotheek voorbereiding, zoals beschreven in stap 6 voor het rangschikken van de volgende generatie.
6. chIP-Seq en CARIP-Seq bibliotheek bouw
- Reparatie uiteinden van DNA met behulp van een einde-Reparatieset van DNA. Deze kit wordt gebruikt voor het genereren van bot-ended DNA. Voor deze reactie, instellen van de volgende in een 1,5 mL, lage bindend buis: 34 µL van DNA, 5 µL van 2.5 mM dNPTs, 5 µL van 10 mM ATP, 5 µL van 10 x einde-reparatie buffer (5 mM DTT, 100 mM magnesium acetaat, 660 mM Kaliumacetaat 300 mM Tris-acetaat, pH 7,8), en 1 µL van eind-reparatie enzym mix (T4 polynucleotide kinase, T4 DNA-polymerase).
- Incubeer het monster gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuiveren van DNA met een kit voor het opruimen van reactie. Elueer einde herstelde DNA in 32 µL voorverwarmde (65 ° C) EB buffer. Terwijl wij doen niet meestal het kwantificeren van de concentratie van DNA na ChIP, of RNA na CARIP, voorafgaand aan de voorbereiding van de bibliotheek, is het raadzaam om te beginnen met minstens 5-10 ng van ChIP DNA of RNA dat CARIP.
- Toevoeging van een overhang van de 3' "A" tot einde herstelde DNA. De onderdelen toevoegen aan een 1,5 mL, lage bindende buis: 30 µL van DNA above, 5 µL van 10 x NEB buffer 2, 1 µL van dATP uit voorraad van 10 mM, 11 µL van H2O en 3 µL van 5 U / µL Klenow fragment (3' - 5' Exo-) , en meng zachtjes door pipetteren.
- Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Gebruik een reactie opruimen kit voor het zuiveren van DNA. Elueer DNA in 25 µL voorverwarmde (65 ° C) EB buffer.
- Afbinden adapter. Toevoegen van de volgende onderdelen op het ijs: 23 µL van DNA van bovenaf, 3 µL van 10 x T4 DNA ligase buffer, 1 µL van ontharde PE of multiplexing adapter (4 µM) en 3 µL van T4 DNA ligase (400 U/µL) en meng zachtjes door pipetteren.
Opmerking: Adapter sequenties kunnen ook worden verkregen bij een commerciële bron.
Oligonucleotide sequenties:
PE-Adapters
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplexing Adapters
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Maat keuze van DNA met behulp van een voorgegoten (2%) agarose gel uitvoeren Stel de gel gedurende 10 minuten.
- De regio overeenkomend met 250-450 bp accijnzen.
Opmerking: door het snijden van de gel boven boven 200 bp, is er een verminderde kans op verontreiniging van unligated adapter Dimeren. Het is belangrijk om te verwijderen voor alle unligated-adapters voorafgaand aan de PCR-stap. - Gebruik een gel extractie kit voor het zuiveren van DNA. Elueer in 20 µL van EB buffer.
- PCR en bibliotheek zuivering voor ligaturen DNA monsters die gekoppeld-einde (PE) adapters. Toevoegen van de componenten in een PCR-buis: 12 µL van 50% van het DNA van bovenaf, 12 µL van water, 25 µL van master mix (Phusion HF), 1 µL van PE PCR Inleiding 1.0 en 1 µL van PE PCR Inleiding 2.0.
Opmerking: Oligonucleotide sequenties kunnen ook worden verkregen bij een commerciële bron.
Oligonucleotide sequenties:
PE PCR Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PE PCR Primer 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - PCR en bibliotheek zuivering voor ligaturen monsters met Index PE adapters. De onderdelen toe te voegen: 12 µL van 50% van het DNA van bovenaf, 12 µL van water, 1 µL van het PCR primer InPE 1.0 (verdunde 1:2), 1 µL van het PCR primer InPE 2.0 (verdunde 1:2) en 1 µL van het PCR Inleiding Index (verdunde 1:2).
Opmerking: oligonucleotide sequenties kunnen ook worden verkregen bij een commerciële bron.
Oligonucleotide sequenties:
Multiplex PCR Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplex PCR Primer 2.0
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PCR Primer Index sequenties 1-12
PCR Primer, Index 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - Uitvoeren van PCR fietsen met behulp van de volgende voorwaarden (denatureren voor 30 bij 98 ° C, 18 cycli van 10 s bij 98 ° C, 30 s bij 65° C, 30 s bij 72 ° C, 5 min bij 72 ° C, s houden bij 4 ° C).
Opmerking: Het aantal cycli van PCR moet empirisch bepaald worden. - Maat keuze van PCR producten. Uitvoeren van DNA op een voorgegoten E-Gel EX (2%) of zelfgemaakte 2% gel (agarose) en accijnzen van de 300-500 bp regio.
- Gebruik een gel extractie kit voor het zuiveren van het DNA van de gel. Elueer PCR eindproduct in 20 µL van EB buffer.
- Gebruik een Fluorimeter voor het meten van de concentratie van de bibliotheek. Volgende-generatie rangschikken uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We ondervraagd met succes de genoom-brede binding van H3K4me3, H3K4me2 en KDM5B in ES-cellen met behulp van deze ChIP-Seq protocol6. ES-cellen werden gekweekt in feeder-vrij voorwaarden (Figuur 1), en kruiselings gekoppelde zoals hierboven beschreven. Ultrasoonapparaat werd vervolgens uitgevoerd zoals beschreven in stap 3.2 van het protocol van de ChIP-Seq en geëvalueerd door het uitvoeren van DNA op een 2% agarose gel (Figuur 2). Vervolgens ChIP werd uitgevoerd zoals beschreven in stap 4 en bibliotheek voorbereiding werd uitgevoerd zoals beschreven in stap 6. ChIP-Seq bibliotheken werden sequenced op een volgende-generatie sequencing-platform. Representatieve aangepaste UCSC browser weergaven onthullen verrijking van H3K4me3, H3K4me2 en KDM5B op het core pluripotent gen POU5F1 (figuur 3A), en op de HOXC cluster (figuur 3B). CARIP-Seq werd ook gezongen door het volgens het protocol, zoals beschreven in stap 4-6. Een representatieve UCSC browserweergave onthult verrijking van H4K20me3-geassocieerde RNA (CARIP-Seq) en de H4K20me3 bezetting (ChIP-Seq) op een loci in ES-cellen (Figuur 4). Het signaal van de CARIP-Seq toont aan dat terwijl de RNA gekoppeld aan H4K20me3 is, het geeft niet noodzakelijkerwijs aan dat het samenwerkt met de locus komt te staan. CARIP-Seq datasets kan worden geanalyseerd op een vergelijkbare manier als ChIP-Seq datasets. Gegevens die zijn gegenereerd op basis van muis ES cel CARIP-Seq en ChIP-Seq experimenten kunnen zowel aan het genoom van een referentie kunnen worden uitgelijnd (bv., mm9, mm10) met behulp van bowtie221. ChIP-Seq en CARIP-Seq verrijkt regio's kunnen zowel worden geïdentificeerd met behulp van de piek aanroepende programma's zoals "Ruimtelijke Clustering voor identificatie van ChIP-Enriched Regions" (SICER)22 of MACS23,24. Omdat CARIP-Seq datasets waarschijnlijk met brede pieken, is het belangrijk om het gebruik van een algoritme dat brede en scherpe pieken kan identificeren. Terwijl de protocollen die zijn beschreven in dit manuscript zijn geoptimaliseerd voor het uitvoeren van ChIP-Seq en CARIP-Seq ES cuvetten, deze protocollen ook moet geschikt zijn voor de evaluatie van de eiwit-DNA en RNA-interacties chromatine-geassocieerde in andere celtypes.
Figuur 1: Feeder-vrije cultuur van ES-cellen. (A) experimenteel design. (B) ES-cellen gekweekt op iMEFs in ES cel media met LIF, of in omstandigheden met ES feeder-free cell media met LIF en (C) GSK3i of (D) GSK3i en MEKi (2i). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: ultrasoonapparaat van kruisverwijzende ES cel chromatine. Kruisverwijzende ES-cellen werden sonicated met behulp van een sonifier met een microtip voor 18 cycli (40% amplitude, 30 s op, en 30 s rest). Crosslinking werd teruggedraaid en RNase spijsvertering werd vervolgens uitgevoerd om te verwijderen van RNA. DNA werd gezuiverd met behulp van PCI en draaien op een agarose gel (2%). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger ChIP-Seq analyse van een enzym en histone modificaties in ES-cellen wijzigen Histon. Aangepaste UCSC browser weergaven van H3K4me3, H3K4me2 en KDM5B op de pluripotent-regulator (A) POU5F1 en de cluster b HOXC in ES-cellen (genormaliseerde label dichtheid (RPBM), lezen per base per miljoen leest). Opmerking de overlap tussen KDM5B bindende en H3K4me3/2 bezetting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vertegenwoordiger CARIP-Seq analyse van RNA die is gekoppeld aan een histone modificaties en de ChIP-Seq in ES-cellen. UCSC browser uitzicht van H4K20me3 CARIP-Seq en H4K20me3 ChIP-Seq signalen in ES-cellen (genormaliseerde label dichtheid (RPBM), lezen per base per miljoen leest). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ChIP-Seq is een handige methode om te evalueren van de locatie van globale eiwit-DNA interacties (bv., transcriptie factoren/Histon wijzigen enzymen/histone modificaties en DNA) in ES-cellen, terwijl de nieuw ontwikkelde CARIP-Seq-protocol is nuttig in genoom-brede vereniging van RNAs met chromatine kiezers te ondervragen. ChIP-Seq is een fundamenteel instrument dat wordt gebruikt ter beoordeling van de epigenetische landschappen van ES-cellen en andere celtypes. De kwaliteit van ChIP-Seq en CARIP-Seq bibliotheken is grotendeels afhankelijk van ChIP-grade antilichamen. De geschiktheid van antilichamen voor ChIP-Seq kan empirisch worden bepaald door het uitvoeren van ChIP-PCR, waar een ≥ 3 5-fold verrijking op positieve controle regio's ten opzichte van onbezette gebieden voldoende moeten zijn zou voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige ChIP-Seq gegevens25. Evenzo kunnen antilichamen worden getest voor hun geschiktheid voor CARIP-Seq op een vergelijkbare manier als beschreven voor het ChIP-Seq met kleine wijzigingen. Na de RNA IP stap in het CARIP-protocol zoals wordt beschreven in de sectie van de methoden hierboven, moet omgekeerde-transcriptie PCR worden uitgevoerd voor het genereren van cDNA, die kan worden gebruikt als een sjabloon voor het uitvoeren van Q-RT-PCR. Het is aanbevolen om het evalueren van de verrijking na ChIP of CARIP op verscheidene genomic gebieden. Er zijn aanvullende overwegingen voor het testen van de bij de beoordeling van de kwaliteit van antilichamen voor ChIP of CARIP. Bijvoorbeeld, de striktheid van buffers gebruikt voor ChIP en CARIP kan worden geoptimaliseerd door een wijziging van de concentratie van NaCl: een lage concentratie van NaCl is geschikt voor zeer specifieke antilichamen, terwijl een hoge concentratie van NaCl nut voor antilichamen met zijn kan niet-specifieke binding. Met betrekking tot de voorbereiding van de bibliotheek voor het rangschikken van de volgende generatie, aangepaste inleidingen en indexen kunnen ook worden gebruikt in plaats van commercieel verworven oligonucleotides. Het is echter belangrijk op te merken dat met inbegrip van een wijziging van de phosphorothioate tussen twee basen aan de 3'-eind is gebleken om te voorkomen dat nuclease spijsvertering26. Derden RNA-Seq of ChIP-Seq bibliotheek constructiekits kunnen ook worden gebruikt voor het genereren van bibliotheken voor het rangschikken van CARIP en ChIP van monsters, respectievelijk. Het is echter belangrijk om te empirisch testen de kits ter evaluatie van hun doeltreffendheid in genereren kwaliteit bibliotheken voor het rangschikken van de volgende generatie. Aanvullende protocollen kunnen ook worden gebruikt voor het uitvoeren van ChIP-Seq bibliotheek voorbereiding, zoals de ChIPmentation27. Aanpassing van de ChIPmentation bij het protocol van de ChIP-Seq hier beschreven vergt echter extra wijzigingen en verdere optimalisatie.
We beschrijven hier, ChIP en CARIP protocollen die zijn geoptimaliseerd met behulp van matige aantallen cellen (4 × 106 cellen per IP). Terwijl het ChIP-protocol kan worden uitgevoerd met behulp van lage tot tussentijdse cel nummers (105 tot 106 cellen), we hebben niet uitgevoerd CARIP-Seq met behulp van minder dan 2 × 10-6 cellen. Door empirisch testen verschillende fixatie en ultrasoonapparaat omstandigheden, is het echter mogelijk dat dit protocol kan werken met succes met behulp van een klein aantal cellen.
Kortom zijn ChIP-Seq en CARIP-Seq nuttig voor het genereren van globale kaarten van chromatine-geassocieerde eiwitten en RNAs in ES-cellen, respectievelijk. Terwijl deze protocollen zijn geoptimaliseerd voor ES-cellen, kunnen zij worden geoptimaliseerd voor het genereren van chromatine kaarten gebruikend een grote verscheidenheid van zoogdieren cellijnen en weefseltypes (HLA). Deze protocollen kunnen ook worden geoptimaliseerd voor het genereren van eencellige ChIP-Seq of CARIP-Seq bibliotheken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, een subsidie van de National Heart-, Long- en bloed Instituut (1K22HL126842-01A1) toegekend aan B.L.K. Dit werk gebruikt de Wayne State Universiteit hoge Performance Computing Grid voor computationele middelen (< https://www.grid.wayne.edu/>). Wij danken Jiji Kurup voor hulp bij CARIP-Seq data-analyse.
AUTEURS DE BIJDRAGEN:
B.L.K. van de CARIP-Seq-methode bedacht, ontworpen en de ChIP-Seq en CARIP-Seq experimenten uitgevoerd analyseerde de gegevens rangschikken en opgesteld van het manuscript. Alle auteurs hebben gelezen en goedgekeurd van de definitieve versie van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
