Summary
Ici, nous décrivons des méthodes pour effectuer des ChIP-Seq et cartes de CAIRP-Seq, y compris la préparation de la bibliothèque pour l’ordonnancement de nouvelle génération, pour générer l’épigénomique global et l’ARN associée à la chromatine dans les cellules ES.
Abstract
Auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires (ES) et de différenciation est régie par des signaux extrinsèques et intrinsèques réseaux de facteurs de transcription, régulateurs épigénétiques et traduction après modification des histones qui combinatoirement influent sur le gène État d’expression des gènes voisins. RNA a également été montré pour interagir avec diverses protéines pour réguler la dynamique de la chromatine et expression du gène. Immunoprécipitation de RNA associées à la chromatine (CAIRP) suivie de la nouvelle génération séquençage (CAIRP-Seq) est une nouvelle méthode pour sonder l’ARN associée à des protéines de la chromatine, tandis que de l’immunoprécipitation de la chromatine suivie par séquençage de prochaine génération ( ChIP-Seq) est une technique puissante de génomique pour mapper l’emplacement du post-traductionnelles des histones, facteurs de transcription et épigénétiques modificateurs à l’échelle mondiale-dans les cellules ES. Nous décrivons ici les méthodes pour exécuter CAIRP-Seq et ChIP-Seq, y compris la construction de la bibliothèque de SEQUENÇAGE de nouvelle génération, pour générer des global associées à la chromatine RNA et épigénomique cartes dans les cellules ES.
Introduction
Décisions de devenir cellules souches embryonnaires (ES) sont réglementées par la communication entre des signaux extracellulaires et une foule de régulateurs transcriptionnels, y compris les modificateurs d’histone et traduction après modification des queues d’histone. Ces interactions facilitent l’accessibilité de la chromatine et l’emballage de la chromatine dans l’un des deux États : euchromatine, qui est ouvert et transcriptionally actif, et l’hétérochromatine, qui est compact et généralement transcriptionnellement inactif. Facteurs de transcription et les affinités de liaison de séquence spécifique d’ADN modificateurs épigénétique associé régions euchromatiques à participer dans le contrôle de l’expression des gènes. Méthodes de séquençage de nouvelle génération, dont ChIP-Seq1, ont grandement contribués à cartographier le génome réseaux transcriptionnels qui sont fondamentales pour ES cellules autorenouvellement et pluripotence2,3,4 ,5,6. De plus, tout en immunopreciation RNA suivie de prochaine génération séquençage (RIP-Seq)7 évaluations des interactions ARN-protéine suggèrent que protéines liant l’ADN interagissent avec l’ARN pour réglementer les événements transcriptionnelle7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, peu d’études ont étudié la localisation de tout le génome d’ARN associée à la chromatine12ou interactions globales entre les ARN et histone modifications. Longtemps non codantes RNAs (lncRNAs) sont une classe d’ARN qui ont été trouvés à réguler l’activité des protéines associées à la chromatine13,14,15. Par exemple, Xist est un lncRNA qui réglemente, dans les cellules mammifères femelles, inactivation d’un chromosome X, grâce au recrutement de répresseurs épigénétique16,17. Toutefois, l’éventail complet des ARN associée à la chromatine est en grande partie inconnu. Nous décrivons ici un protocole roman, associée à la chromatine RNA immunoprécipitation (CAIRP) suivi par séquençage de prochaine génération (CAIRP-Seq), pour identifier les ARN associée à la chromatine sur une base du génome dans les cellules ES, y compris la préparation de la bibliothèque pour séquençage de prochaine génération et ChIP-Seq pour mapper l’occupation globale des modifications d’histone, facteurs de transcription et modificateurs de l’épigénétiques. Contrairement aux autres méthodes de RIP-Seq7, CAIRP-Seq inclut des étapes de réticulation et sonication, permettant l’identification directe d’ARN associée à la chromatine. Ensemble, ChIP-Seq est un outil puissant pour identifier les interactions protéine-ADN de Génome-large, tandis que CAIRP-Seq est une méthode puissante d’arpenter RNAs sont associées aux composantes de la chromatine.
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Protocol
1. culture de souris ES cellules dans des Conditions sans chargeur.
NOTE : Souris ES cellules sont traditionnellement cultivées dans les médias sur une boîte de Petri de cellule recouverte de gélatine et un mono-couche de fibroblastes embryonnaires de souris (force expéditionnaire des marines), qui ont été mitotically inactivés (iMEFs). Toutefois, les MEFs doivent être retirés avant les analyses épigénétiques ou expression en aval pour éviter la contamination de la chromatine associées à MEF et de l’ARN.
- Préparation d’une couche de conducteur : gélatine recouvrir une plaque de culture de cellules de 6 puits en ajoutant 2 mL de 0,1 % de gélatine dans l’eau et incuber les plaques à 37 ° C pendant 20-30 min.
- Préparer les médias de haut-glucose 10 % DMEM contenant 2 mM de L-glutamine, 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 x pénicilline/streptomycine.
- Isoler les MEFs de E13.5 à E14.5 souris18,19 , ou acquérir auprès d’un fournisseur commercial. Inactiver mitotiquement MEFs en traitant avec la mitomycine C ou l’irradiation gamma à l’aide de protocoles standard19. Vous pouvez également mitotically inactivés MEFs (iMEFs) peuvent être acquis auprès d’un fournisseur commercial.
- Culture de MEFs. Réchauffez les médias MEF à 37 ° C, décongeler des surgelés flacon d’iMEFs et de la culture dans 10 % médias FBS MEF à 37 ° C, avec 5 % de CO2. Plaque MEFs à ~ 200 000 cellules / puits d’une boîte de Petri de 6 puits.
- Culture de cellules ES sur une couche de cellules nourricières (iMEFs).
- 12 à 24 heures après l’ensemencement iMEFs, préchauffer un tube de 50 mL de milieux cellulaires ES (DMEM haute-glucose, FRV (10 ng/mL), 15 % ES complet cellule FBS, qualifiée de culture cellulaire de 1 × 2-mercaptoéthanol, 1 × glutamine, acides aminés non essentiels (NEAA), 1 × pénicilline/streptomycine), à 37 ° C avec 5 % de CO2.
- Aspirer les médias des plaques de culture cellulaire contenant iMEFs, remettre en suspension les cellules ES dans 2 mL de médias (après décongélation à 37 ° C) et les cellules de la couche d’iMEFs de la plaque. Lorsque vous placez la boîte de Pétri dans l’incubateur, il est important de passer le plat en forme de « t » pour répartir les cellules et pour empêcher l’agrégation vers le centre du plat.
- Le passage des cellules ES sur vaisselle exempt d’engraissement enduit de gélatine. Le passage des cellules ES avant qu’ils deviennent confluentes. Colonies de cellules ES maintiennent l’auto-renouvellement meilleur si les colonies sont également espacés et non confluentes. La présence de nombreuses colonies de cellules d’ES qui entrent en contact avec indique que la densité cellulaire est trop élevée.
- Enduire un plat de 6 puits de culture avec de la gélatine comme décrit ci-dessus. Incuber à 0,25 % de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant environ 10-15 min à la trypsine Préchauffez.
- Ensuite, le passage des cellules ES en premier lavage avec 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et en ajoutant 1 mL de solution de trypsine-EDTA de 0,25 %. Attendre 1-2 min pour les colonies à détacher. Dissocier les colonies à une suspension de cellules individuelles en pipettant également, avec une pointe de 1 mL pour environ 5 fois.
- Utiliser un microscope pour vérifier la dissociation cellulaire unique des cellules ES. Pour étancher la réaction, ou de « neutraliser » la trypsine, ajouter des éléments multimédias FBS MEF de 10 %. Centrifuger les cellules à 300 g à température ambiante pendant 3-5 min et aspirer les médias.
- Resuspendre le culot cellulaire dans 2 mL de médias (cellules ES) additionné de la glycogène synthase kinase-3 (GSK3) inhibiteur (CHIR99021 ; GSK3i), ou 2i conditions (MEKi/GSK3i) (2-3 µM GSK3i : CHIR99021, 1 µM MEKi : PD0325901).
- Aspirer la gélatine de la capsule de culture cellulaire, ajouter 2 mL de support contenant des ESCs au plat et placer le plat dans un incubateur à 37 ° C (Figure 1 a-D). Double inhibition de GSK3i et de MEKi favorise l’état fondamental naïf pluripotence des cellules ES en l’absence de cellules nourricières (iMEFs) et sans sérum20. Les cellules ES doivent être repiquées deux à trois fois pour enlever les MEFs avant de procéder à la réticulation.
2. la réticulation des ES cellules pour puce et CAIRP
- Récolter les cellules ES en les lavant avec du PBS, puis ajouter 0,25 % de trypsine préchauffée à 37 ° C. Incuber les cellules pendant plusieurs minutes à la température ambiante. Éviter la trypsinisation de cellules d’ES, qui conduira à la mort cellulaire. Utiliser un microscope pour évaluer la dissociation cellulaire unique.
- Étancher la digestion trypsique comme décrit ci-dessus pour le passage des cellules ES et centrifuger les cellules à 300 g à température ambiante pendant 3 à 5 min.
- Remettre en suspension les cellules dans les médias MEF préchauffé (37 ° C) (10 % FBS/DMEM) à 2 × 106 cellules/mL.
- Pour relier les cellules, ajouter la solution de formaldéhyde de 37 % à une concentration finale de 1 % et incuber les cellules dans un tube à fond conique (15 mL ou 50 mL) à 37 ° C pendant 8 min. inverser le tube plusieurs fois au cours de la période 8 min pour atteindre la fixation homogène.
NOTE : Le temps de fixation peut être empiriquement optimisé pour CAIRP. Si le temps de fixation est modifié, le nombre de cycles de sonication doit également être ajusté. En outre, la température de 37 ° C augmente l’efficacité de réticulation par rapport à réticulant à température ambiante. La température de fixation peut être empiriquement optimisée. - Pour arrêter la réaction de fixation, ajouter 1,25 M glycine (pré réfrigéré à 4 ° C) à une concentration de 0,125 M. inverser le tube à 8 t/mn à l’aide d’un agitateur pendant 5 min à température ambiante. Centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer les médias.
- Laver le culot cellulaire avec PBS préalablement réfrigérées (4 ° C), centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer PBS. Laver les cellules avec du PBS à nouveau. Ensuite, aliquote 15 × 106 cellules par tube de 15 mL.
- Congeler le culot cellulaire en le plaçant dans l’azote liquide pendant 1 min, sur la glace sèche pendant 5 min, ou placer immédiatement à-80 ° C.
Remarque : Boulettes de cell ES fixe peuvent être stockés pendant 6 mois sans qualité diminuée lors d’expériences en aval.
3. la sonication pour puce et CAIRP chromatine
- Décongeler le culot ES fixe sur la glace. Resuspendre le culot dans le tampon de sonication (2,5 mL). Resuspendre le culot dans 1 x TE, PMSF, 1 mM 1 x inhibiteur de protéinase cocktail de facteurs de transcription ou régulateurs épigénétiques (facteurs protéiques). Pour les modifications d’histone, resuspendre le culot dans 1 x TE, SDS 0,1 %, PMSF, inhibiteur de protéinase 1 x 1 mM.
NOTE : Bien que l’ajout de SDS améliore l’efficacité de la sonication, il peut-être pas bénéfique pour l’évaluation de certains constituants de la chromatine ou les facteurs de transcription. - Pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), laisser agir la chromatine avec des cycles de 14-18 (30 s sur, 30 repos s) à amplitude de 40 %. Pour les associés à la chromatine RNA immunoprécipitation (CAIRP), réduire le nombre de cycles de sonication (8-10 cycles). En raison de cellulaire, la fixation et la variabilité sonifier, conditions de sonication doivent être déterminées empiriquement.
- Supplément la mémoire tampon de sonication 28 µL du SDS de 10 % pour les protéines-facteurs, 28 µL de désoxycholate de sodium et 0,28 mL 10 % Triton-X100, et bien mélanger.
Remarque : L’ajout de ces composants dans la mémoire tampon de sonication génère tampon RIPA. - Centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 10 min à 4 ° C à l’avance de la chromatine. Déplacer le surnageant dans un tube frais et passez à l’immunoprécipitation de la chromatine.
- Par ailleurs, la chromatine aux ultrasons peut être stockée à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Toutefois, le stockage de la chromatine aux ultrasons à-80 ° C peut conduire à qualité diminuée pour puce de protéine-facteur.
4. chIP et processus de l’ACPIR
- Ajouter 40 µL de protéine A ou billes magnétiques G à un 1,5 mL, tube de liaison faible. Ajouter 600 µL de PBS pour laver les perles. Placer le tube sur un support contenant un aimant, incuber le tube pendant 1 min à température ambiante, PBS de retirer et remettre en suspension les billes magnétiques dans 100 µL de PBS.
- Ajouter 2 à 4 µg d’anticorps dans le tube avec des billes magnétiques. Incuber et tourner le tube à température ambiante pendant 40 min à 8 t/mn à l’aide d’un agitateur pour faciliter la liaison des anticorps aux billes magnétiques. Insérer le tube sur le support magnétique, il incuber pendant 1 min à température ambiante, puis retirez les PBS.
- Ajouter 200 µL de PBS pour laver les billes magnétiques. Laver avec du PBS est exécutée pour supprimer les IgG gratuit. Incuber et tourner le tube à température ambiante pendant 5 min entre les lavages. Fixer le tube à l’aimant et enlever le PBS.
- Protéines liées à la chromatine immunoprécipitation en incubant la chromatine aux ultrasons (4 × 106 cellules par puce), un extrait avec les billes magnétiques et faire tourner l’échantillon à 4 ° C (la nuit).
- Laver les billes magnétiques. Incuber les échantillons à température ambiante avec les tampons suivants et tourner l’échantillon pendant 10 min avec chaque tampon : deux fois avec 1 mL de tampon RIPA (pH de TE (10 mM Tric-HCl, EDTA 1 mM) 8,0, 1 % X-100 Triton, 0,1 % sodium deocycholate, SDS 0,1 %), deux fois avec 1 mL de c tampon RIPA ontenant 0,3 M NaCl, deux fois avec 1 mL de tampon de LiCl (0,5 % sodium deocycholate, 0,5 % NP40, 0,25 M LiCl), une fois avec 1 mL de TE mettre en mémoire tampon avec 0,2 % X-100 Triton et une fois avec 1 mL de TE.
- De-réticulation de puce. Remettre en suspension les billes magnétiques dans 100 µL de TE. Ajouter 3 µL du SDS de 10 % et 5 µL de protéinase K (20 mg/mL). Incuber les échantillons à 65 ° C (la nuit).
Remarque : Il est important de couvrir les tubes au cours de cette étape avec parafilm ou une pellicule plastique pour éviter l’évaporation.- Le lendemain, il faut inverser le tube plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, utilisez le support de l’aimant pour transférer le surnageant dans un nouveau tube. Pour laver les billes magnétiques, ajouter 100 µL de TE contenant 0,5 M de NaCl et ensuite combiner les deux surnageants.
- De-réticulation pour CAIRP. Remettre en suspension les billes magnétiques dans 100 µL de TE. Ajouter 3 µL du SDS de 10 % et 5 µL de protéinase K (20 mg/mL). Incuber les échantillons à 65 ° C pendant 4 à 12 h d’Incubation à 65 ° C doit être déterminée empiriquement en raison de la variabilité entre les types de cellules, sonication et fixation des conditions, etc..
- Inverser le tube 3 - 5 fois pour mélanger, appliquer le tube à la grille magnétique et déménage par la suite le surnageant dans un tube frais.
- Pour laver les billes magnétiques, ajouter 100 µL de TE contenant 0,5 M de NaCl et ensuite combiner les deux surnageants.
Remarque : Il est important d’utiliser des réactifs exempte de nucléase (e.g., tampon TE, SDS, etc..) pour prévenir la perte d’ADN ou d’ARN au cours de l’étape de-réticulation.
- Extraire l’ADN/ARN, avec 200 µL de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (PCI) (25:24:1, v/v).
NOTE : L’ARN peut également être extrait à l’aide de trousses commerciales en utilisant les instructions du fabricant. Agiter pendant 30 s, tournent à 10 000 x g à température ambiante pendant 10 min et déplacer le surnageant dans un nouveau tube.- Pour précipiter l’ADN/ARN, ajouter 2 µL de GlycoBlue et 20 µL d’acétate de sodium 3M 600 µL d’éthanol. Mélanger en retournant le ~ 5-8 fois et placer l’échantillon sur la glace sèche ou à-80 ° C pendant au moins 1-2 h.
- Centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 30 min à l’aide d’une centrifugeuse de table-top réfrigérateur (4 ° C). Sécher à l’air le culot pour < 1 min et remettre en suspension dans 40 µL de EB tampon (10 mM Tris-HCl). Pour la préparation de ChIP-Seq de bibliothèque, passez à l’étape 6.
- Retirez l’ADN associées à la chromatine des échantillons d’ARN IP à l’aide de DNase. Ajouter 10 x DNase tampon 1 concentration de x dans l’échantillon de l’ACPIR. Ajouter 1 µL de DNase pour jusqu'à 10 µg d’ARN (réaction de 50 µL). Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 30 min. extrait de l’échantillon de RNA avec PCI. Remettre en suspension les en exempte de nucléase H2O.
5. double-brin cDNA synthèse pour CAIRP-Seq
- Synthèse de cDNA de premier-brin. Pour la réaction de transcription inverse, mis en place la réaction suivante dans un tube conçu pour une machine PCR : 10,5 µL d’ARN et de 1 µL aléatoire d’amorces hexamère (3 µg/µL).
- Incuber les tubes à 65 ° C pendant 5 min dénaturer la structure secondaire et stockez-le sur glace pendant 2 min. mélanger les composants suivants : 4 µL de tampon de premier-brin, 2 µL de 0,1 M TNT, 1 µL de dNTP et 0,5 RNase OUT. Ajoutez ensuite le tube PCR, 7,5 µL du mélange maître. Incuber le tube pendant 2 min à 25 ° C. Ajouter 1 µL d’exposant II (200 U/µL) et incuber comme suit : 25 ° C pendant 10 min, 42 ° C pendant 50 minutes, 70 ° C pendant 15 min et maintenez à 4 ° C.
- Synthèse de cDNA de deuxième brin. Placer le tube sur la glace. Ensuite, ajoutez les éléments suivants dans l’ordre : 91 µL de diéthyl pyrocarbonate (DEPC) traités eau, 30 µL de 5 x tampon de réaction du deuxième brin, 3 µL du mélange dNTP (10 mM), 1 µL d’e. Coli DNA ligase (10 U/µL), 4 µL de polymérase d’ADN (10U/µL) de Escherichia Coli . et 1 µL d’e. Coli RNase H (2U/µL). Mélanger délicatement mélangé au vortex et incuber à 16 ° C pendant 2 h.
Remarque : Mélange en effleurant ou en renversant le tube peut être pas suffisant pour bien mélanger les réactifs. - Ajouter 2 µL de T4 ADN polymérase et incuber à 16 ° C pendant 5 min. Purify cDNA (double-brin, dscDNA) à l’aide du kit de purification de PCR. Éluer la dscDNA en 40 µL de tampon de EB.
- Fragment d’ADNc double brin. Cisaillement de cDNA (dscDNA) à l’aide d’un sonifier de bain de l’eau et un tube de 1,5 mL pour une taille de 250-500 BP. Sonication de dscDNA est essentiel pour réduire la taille de fragment pour faciliter le séquençage de l’ARN de transcription complète.
- Lorsque vous utilisez un modèle standard d’un sonifier bain-marie, laisser agir l’échantillon pour 3 × 10 min ou 4 × 10 min.
NOTE : Trois cycles doivent être utilisés pour jusqu'à 1 µg d’ARN total, tandis que quatre cycles sont recommandés pour 1 à 5 µg d’ARN total. Centrifuger le tube brièvement après chaque cycle de sonication et maintenir un bain d’eau froide en ajoutant glace fraîche. - Lorsque vous utilisez un sonifier Pico, il est recommandé d’utiliser six cycles de 1 à 5 µg d’ARN total et les conditions suivantes de cyclisme (30 s, 90 s éteint). Centrifuger le tube brièvement après 2-3 cycles de sonication. L’efficacité de la sonication peut être déterminée en chargeant une fraction de la dscDNA cisaillé (3-4 µL) sur gel d’agarose (2 %). Il est important de tester empiriquement conditions de sonication en raison de la variabilité entre les sonifiers.
- Exécuter bibliothèque préparation tel que décrit à l’étape 6 pour le séquençage de prochaine génération.
6. chIP-Seq et Construction de bibliothèque de CAIRP-Seq
- Réparer les extrémités de l’ADN à l’aide d’un kit de fin-réparation de l’ADN. Ce kit est utilisé pour générer l’ADN émoussé-terminée. Pour cette réaction, mises en place ce qui suit dans un 1,5 mL, à faible liaison tube : 34 µL d’ADN, 5 µL de dNPTs 2,5 mM, 5 µL de l’ATP, 5 µL de fin-réparation mémoire tampon (5 mM DTT, acétate de magnésium 100 mM, l’acétate de potassium 660 mM 10 x 10 mM 300 mM Tris-acétate, pH 7,8) et 1 µL de réparation fin mélange enzymatique (T4 polynucléotide kinase, T4 ADN polymérase).
- Incuber l’échantillon pendant 45 min à température ambiante.
- Purifier l’ADN à l’aide d’un kit de nettoyage de réaction. Éluer réparé à la fin de l’ADN en 32 µL de tampon EB préchauffé (65 ° C). Tandis que nous doser pas généralement la concentration de l’ADN suite à puce ou l’ARN après CAIRP, avant la préparation de la bibliothèque, il est recommandé de commencer au moins 5-10 ng de puce ADN ou d’ARN de l’ACPIR.
- Ajout d’un surplomb de 3' « A » à l’ADN réparé à la fin. Ajouter des composants à un 1,5 mL, tube de liaison faible : 30 µL d’ADN par dessus, 5 µL de NEB mémoire tampon 2, 1 µL de dATP de stock de 10 mM et 11 µL d’H2O 3 µL de 5 U 10 x / fragment de Klenow µL (3' - 5' Exo-) et mélanger doucement en pipettant également.
- Incuber l’échantillon pendant 30 min à 37 ° C.
- Utiliser un kit de nettoyage de réaction pour purifier l’ADN. Éluer ADN dans 25 µL de tampon EB préchauffé (65 ° C).
- Ligaturer adaptateur. Ajoutez les composants suivants sur la glace : 23 µL d’ADN par le haut, 3 µL de 10 x T4 DNA ligase tampon, 1 µL de recuit PE ou multiplexage adaptateur (4 µM) et 3 µL de T4 DNA ligase (400 U/µL) et mélanger doucement en pipettant également.
NOTE : Séquences adaptateur peuvent également être obtenues auprès une source commerciale.
Séquences oligonucléotidiques :
Adaptateurs de PE
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplexage des adaptateurs
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - Incuber l’échantillon pendant 30 min à température ambiante.
- Effectuez la sélection de la taille de l’ADN à l’aide d’un gel d’agarose (2 %) préfabriqué. Exécutez le gel pendant 10 min.
- La région correspondant à 250-450 bp de l’accise.
Remarque : en coupant le gel au-dessus de plus de 200 bp, il est possible une diminution de la contamination de dimères d’adaptateur unligated. Il est important d’enlever toute unligated adaptateurs avant l’étape de l’ACP. - Utiliser un kit d’extraction de gel pour purifier l’ADN. Éluer dans 20 µL de tampon de EB.
- Bibliothèque et PCR purification ADN ligaturé échantillons contenant les adaptateurs jumelé-fin (PE). Ajouter les composants dans un tube PCR : 12 µL de 50 % de l’ADN par le haut, 12 µL d’eau, 25 µL du mélange principal (Phusion HF), 1 µL d’amorces PCR PE 1.0 et 1 µL d’amorces PCR PE 2.0.
NOTE : Séquences oligonucléotidiques peuvent également être obtenus d’une source commerciale.
Séquences oligonucléotidiques :
Amorce PCR PE 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Amorce PCR PE 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - Bibliothèque et PCR purification ligaturé échantillons contenant des cartes Index PE. Ajouter les composants : 12 µL de 50 % de l’ADN par le haut, 12 µL d’eau, 1 µL d’amorce PCR InPE 1.0 (dilué 1:2), 1 µL d’amorce PCR InPE 2.0 (dilué 1:2) et 1 µL d’amorce PCR Index (dilué 1:2).
NOTE : séquences oligonucléotidiques peuvent également être obtenus d’une source commerciale.
Séquences oligonucléotidiques :
Amorce PCR multiplex 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Amorce PCR multiplex 2.0
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
Séquences de Index d’amorces PCR 1-12
Amorce PCR, Index 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
Amorce PCR, Index 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
Amorce PCR, Index 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
Amorce PCR, indice 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
Amorce PCR, indice 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
Amorce PCR, indice 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
Amorce PCR, Index 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
Amorce PCR, Index 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
Amorce PCR, Index 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
Amorce PCR, indice 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
Amorce PCR, Index 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
Amorce PCR, Index 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - Effectuer des PCR vélo en utilisant les conditions suivantes (dénaturer pendant 30 s à 98 ° C, 18 cycles de 10 s à 98 ° C, 30 s à 65° C, 30 s à 72 ° C, 5 min à 72 ° C, tenir à 4 ° C).
Remarque : Le nombre de cycles PCR devrait être déterminé empiriquement. - Sélection de la taille des produits PCR. Exécutez l’ADN sur un E-Gel préfabriqué EX (2 %) ou maison 2 % gel (agarose) et de l’accise de la région de bp 300-500.
- Utiliser un kit d’extraction de gel pour purifier l’ADN du gel. Éluer final produit de PCR dans 20 µL de tampon de EB.
- Utilisez un fluorimètre pour mesurer la concentration de la bibliothèque. Effectuer le séquençage de prochaine génération.
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Representative Results
Nous avons interrogé avec succès la liaison pangénomique du H3K4me3, H3K4me2 et KDM5B dans les cellules ES ce ChIP-Seq protocole6. ES cellules ont été cultivées dans des conditions sans chargeur (Figure 1) et réticulé comme décrit ci-dessus. Sonication a été effectuée tel que décrit à l’étape 3.2 du protocole ChIP-Seq et évalués par l’ADN en cours d’exécution sur un gel d’agarose à 2 % (Figure 2). Ensuite, la puce a été effectué tel que décrit à l’étape 4 et preparation de bibliothèque a été réalisé comme décrit à l’étape 6. ChIP-Seq bibliothèques ont été séquencés sur une plate-forme de séquençage de prochaine génération. Représentant affichages personnalisés du navigateur UCSC révèlent enrichissement de H3K4me3, H3K4me2 et KDM5B dans le gène de la pluripotence core POU5F1 (Figure 3 a) et dans le cluster HOXC (Figure 3 b). CAIRP-Seq a également été effectuée en suivant le protocole décrit dans les étapes 4-6. Une vue de navigateur UCSC représentative révèle enrichissement de H4K20me3 associée à l’ARN (CAIRP-Seq) et H4K20me3 occupation (ChIP-Seq) à un locus dans les cellules ES (Figure 4). Le signal de CAIRP-Seq montre que bien que l’ARN est associé à H4K20me3, il n’indique pas nécessairement qu’elle interagit avec le locus montré. CAIRP-Seq datasets peuvent être analysés de façon semblable comme ChIP-Seq datasets. Les données générées par les souris ES cell CAIRP-Seq et ChIP-Seq expériences peuvent être alignés à un génome de référence (p. ex.., mm9, mm10) à l’aide de bowtie221. ChIP-Seq et CAIRP-Seq enrichi régions peuvent tous deux être identifiées en utilisant des programmes appelant pic comme « Spatial Clustering pour Identification des ChIP-Enriched régions » (FAC)22 ou MACS23,24. Car CAIRP-Seq datasets probables inclure pics larges, il est important d’utiliser un algorithme qui permet d’identifier des pics larges et pointues. Alors que les protocoles décrits dans ce manuscrit ont été optimisés pour l’exécution de ChIP-Seq et CAIRP-Seq utilisant des cellules ES, ces protocoles devraient également convenir pour l’évaluation de l’ADN-protéine associée à la chromatine interactions et ARN dans d’autres types de cellules.
Figure 1 : Feeder-free culture de cellules ES. (A) protocole expérimental. B cellules cultivées sur iMEFs en ES cell milieux contenant du FRV ou dans des conditions sans chargeur avec ES cellules milieux contenant MEKi (2i) ou GSK3i (D) et (C) GSK3i, FRV. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Sonication de chromatine cellulaire RETICULE ES. Cellules RETICULE ES étaient sonication utilisant un sonifier avec un microtip pour 18 cycles (amplitude de 40 %, 30 s et 30 s reste). Réticulation s’est inversée, et digestion de la RNase a été réalisée par la suite pour supprimer RNA. ADN a été purifiée à l’aide de PCI et exécuter sur gel d’agarose (2 %). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse représentant ChIP-Seq d’une histone Modification enzymatique et histone modifications dans les cellules ES. Vues de browser UCSC personnalisées de H3K4me3, H3K4me2 et KDM5B à la pluripotence-régulateur (A) POU5F1 et le cluster HOXC (B) dans les cellules ES (densité tag normalisé (RPBM), lire par base par million de lectures). Notez le chevauchement entre la liaison KDM5B et H3K4me3/2 occupation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : analyse représentant CAIRP-Seq d’ARN associée à une modification des histones et ChIP-Seq dans les cellules ES. Vues de navigateur UCSC des signaux H4K20me3 CAIRP-Seq et H4K20me3 ChIP-Seq dans les cellules ES (densité tag normalisé (RPBM), lire par base par million de lectures). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
ChIP-Seq est une méthode utile pour évaluer l’emplacement des interactions protéine-ADN global (e.g., facteurs de transcription/histone modifiant les modifications d’enzymes/histone et l’ADN) dans les cellules ES, tandis que le protocole de CAIRP-Seq nouvellement développé est utile dans interroger l’association génome d’ARN avec des constituants de la chromatine. ChIP-Seq est un outil fondamental qui sert à évaluer les paysages épigénétiques des cellules ES et autres types de cellules. La qualité de ChIP-Seq et bibliothèques CAIRP-Seq est largement tributaire des anticorps ChIP-grade. L’adéquation des anticorps pour ChIP-Seq peut être empiriquement déterminée en effectuant la puce-PCR, où un ≥ 3 à 5 fois enrichissement aux régions de contrôle positif par rapport aux régions inoccupées devrait suffire à générer la qualité ChIP-Seq données25. De même, les anticorps peuvent être testés pour leurs qualités pour CAIRP-Seq de manière similaire comme pour le ChIP-Seq avec des modifications mineures. Après l’étape de RNA IP dans le protocole de CAIRP tel que décrit dans la section des méthodes ci-dessus, transcription inverse PCR doit être effectuée pour générer des ADNc, qui peut être utilisé comme un modèle pour exécuter Q-RT-PCR. Il est recommandé d’évaluer l’enrichissement suite puce ou CAIRP à plusieurs régions génomiques. Il y a des considérations supplémentaires pour tester lors de l’évaluation de la qualité des anticorps pour puce ou CAIRP. Par exemple, la rigueur des tampons utilisés pour puce et CAIRP peut être optimisée en modifiant la concentration de NaCl : une faible concentration de NaCl est adaptée aux anticorps hautement spécifiques, alors qu’une forte concentration de NaCl peut être utile pour les anticorps avec liaisons non spécifiques. Concernant la préparation de la bibliothèque pour l’ordonnancement de nouvelle génération, amorces personnalisés et index permet également au lieu des oligonucléotides commercialement acquis. Toutefois, il est important de souligner qu’y compris une modification phosphorothioate entre deux bases situées à l’extrémité 3' a été d’empêcher la nucléase digestion26. Kits de construction bibliothèque RNA-Seq ou ChIP-Seq tiers peuvent également servir à générer des librairies pour le séquençage de l’ACPIR et puce échantillons, respectivement. Cependant, il est important de tester empiriquement les kits afin d’évaluer leur efficacité dans les bibliothèques de qualité générant pour l’ordonnancement de la prochaine génération. Protocoles additionnels peuvent également être employées pour effectuer la préparation de bibliothèque de ChIP-Seq, tels que ChIPmentation,27. Cependant, adaptation de ChIPmentation au protocole ChIP-Seq décrit ici nécessitera des modifications supplémentaires et l’optimisation supplémentaire.
Nous décrivons ici la puce et CAIRP des protocoles qui ont été optimisés à l’aide d’un nombre moyen de cellules (4 x 106 cellules / IP). Alors que le protocole de la puce peut être effectué à l’aide du nombre de cellules de faible à intermédiaire (105 106 cellules), nous n’avons pas effectué CAIRP-Seq en utilisant moins de 2 × 106 cellules. Cependant, par l’épreuve empiriquement différentes conditions de fixation et de la sonication, il est possible que ce protocole peut fonctionner avec succès à l’aide d’un petit nombre de cellules.
En résumé, ChIP-Seq et CAIRP-Seq sont utiles pour générer des cartes mondiales d’ARN et de protéines associées à la chromatine dans les cellules ES, respectivement. Alors que ces protocoles ont été optimisés pour les cellules ES, ils peuvent être optimisées pour générer des cartes de la chromatine en utilisant une grande variété de lignées cellulaires de mammifères et de types de tissus. Ces protocoles peuvent également être optimisés pour générer des unicellulaires ChIP-Seq ou bibliothèques CAIRP-Seq.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, une bourse du National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01 a 1) attribué à B.L.K. Ce travail a utilisé la Wayne State University Haute Performance Computing Grid pour des ressources informatiques (< https://www.grid.wayne.edu/>). Nous remercions Jiji Kurup d’assistance avec l’analyse des données CAIRP-Seq.
DE CONTRIBUTIONS DES AUTEURS :
B.L.K. conçoit la méthode CAIRP-Seq, conçu et réalisé des expériences de la ChIP-Seq et CAIRP-Seq, ont analysé les données de séquençage et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
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