Summary
Vi præsenterer her, en protokol til at ablate en genetisk mærket delpopulation af neuroner ved hjælp af en to-foton laser fra zebrafisk larver.
Abstract
For at identificere rollen, en delpopulation af neuroner i adfærd, er det vigtigt at teste konsekvenser for at blokere sin aktivitet i levende dyr. Laser ablation af neuroner er en effektiv metode til dette formål, når neuroner er selektivt mærket med fluorescerende sonder. I den foreliggende undersøgelse, er protokoller for laser ablating en delpopulation af neuroner ved hjælp af en to-foton mikroskop og afprøvning af dets funktionelle og adfærdsmæssige konsekvenser beskrevet. I denne undersøgelse bruges bytte fange adfærd i zebrafisk larver som undersøgelse model. Pretecto-hypothalamus kredsløbet er kendt for at ligge til grund for denne visuelt drevet bytte fange adfærd. Zebrafisk pretectum var laser-ablated, og neuronal aktivitet i den ringere lap af hypothalamus (ILH, målet for den pretectal projektion) blev undersøgt. Bytte fange adfærd efter pretectal ablation blev også testet.
Introduction
For at forstå hvordan adfærd udspringer af neuronal aktivitet i hjernen, er det nødvendigt at identificere de neurale kredsløb, der er involveret i generation af denne adfærd. På stadiet larve i zebrafisk giver en ideel dyremodel for at studere hjernefunktion er forbundet med adfærd fordi deres lille, gennemsigtig hjerner gør det muligt at undersøge neuronal aktivitet på et cellulært opløsning i et bredt område af den hjernen mens observere adfærd1. Billeddannelse af neuronal aktivitet i specifikke neuroner er blevet mulig gennem opfindelsen af genetisk kodet calcium (Ca) indikatorer (GECIs) som GCaMP2. GCaMP transgene zebrafisk har vist sig for at være nyttige for knytte den funktionelle neurale kredsløb med adfærd ved at foretage Ca imaging i opfører dyr3.
Mens Ca imaging kan påvise sammenhænge mellem neuronal aktivitet og adfærd, for at vise kausalitet, undertrykkelse af neuronal aktivitet og teste sin consequence(s) på adfærd er vigtige skridt. Der er forskellige måder at opnå dette: brug af genetiske mutation, der ændrer specifikke neurale kredsløb4, udtryk for nervegifte i specifikke neuroner5,6, brug af optogenetic værktøjer som halorhodopsin7, og laser ablation af målrettede neuroner8,9. Laser ablation er især velegnet til at fjerne aktivitet i et relativt lille antal specifikke neuroner. Irreversibel eliminering af neuronal aktivitet ved at dræbe neuroner letter vurdering af adfærdsmæssige konsekvenser.
En interessant adfærd, som kan observeres på stadiet larve i zebrafisk er bytte capture (fig. 1A). Denne visuelt styret, målrettet adfærd giver en gunstig eksperimentel system for studiet af synsskarphed10, visuomotor transformation11,12,13, visuel perception og anerkendelse af objekter14,15,16,17,18, og beslutningstagning19. Hvordan bytte er anerkendt af rovdyr og hvordan bytte opdagelse fører til bytte fange adfærd har været et centralt spørgsmål i Neuroetologi20. I dette papir, vi fokusere på rollen som den pretecto-hypothalamus kredsløb dannet ved projektioner af en kerne i pretectum (nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis, herefter blot noteret som pretectum) til ILH. Laser-ablation af pretectum blev vist sig at reducere bytte capture aktivitet og afskaffe neuronal aktivitet i den ILH, der er knyttet til visuelle bytte perception21. Her, laser protokoller til at udføre ablation og teste sin virkning ved hjælp af Ca2 + imaging og adfærdsmæssige optagelse i zebrafisk larver er beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ablation af en delpopulation af neuroner ved hjælp af en to-foton Laser mikroskop
Bemærk: Hvis brugere har planer om at udføre Ca imaging følgende ablation, brug UAShspzGCaMP6s linje21. Hvis brugere har planer om at udføre adfærdsmæssige optagelse efter ablation, bruge linjen UAS:EGFP ablation af EGFP-positive celler er lettere at udføre end GCaMP6s-udtrykker celler.
- Begynder ved at oprette parring af en Gal4 linje, der angiver specifikke neuroner til at blive undersøgt og UAS:EGFP eller UAShspzGCaMP6s. Sørg for at bruge nacre baggrunden for begge forældre, så nacre homozygote kan opnås.
Bemærk: Homozygote af nacre indeholder ingen melanophores på kroppens overflade (figur 1B). I nuværende undersøgelse, en Gal4 linje gSAIzGFFM119B, (som etiketter i pretectum) og en anden Gal4 line hspGFFDMC76A, (som etiketter i ILH) er brugt21. - Den følgende dag i opsætningen til parring, indsamle zebrafisk æg, og hæve dem til larve scenen på hvilket tidspunkt neuroner interesse vil udtrykke fluorescerende journalister.
- Montere zebrafisk larve i 2% lavt smeltepunkt-Agarosen (figur 1B).
- Begynd ved at forberede 2% Agarosen stamopløsning: 2 g opløses af lav smeltepunkt Agarosen pulver i 100 mL system vand (dvs., vand bruges til at opretholde voksen zebrafisk i en cirkulerende vand system)22 eller E3 vand23, ved at bringe vandet kogepunkt i en mikrobølgeovn, og blande kraftigt.
- Mikroovn 2% lavt smeltepunkt Agarosen lager, indtil det koger. Hæld Agarosen på låget af en 6-cm petriskål 3,5-4,0 mL. Vent, indtil Agarosen køler så at det er varm at røre ved, før du fortsætter.
- Placer en enkelt larve (ikke bedøvede på dette trin) i agarosegelelektroforese. Holde justere den placering og orientering af larve, så at det er oprejst, ved hjælp af en dissekere nål (figur 1C), indtil Agarosen størkner for at sikre den korrekte placering af larve.
Bemærk: Larver vil fortsætte med at svømme rundt mens Agarosen størkner. - Når larve er placeret, Tillad 5 min til Agarosen størkne helt.
- Hældes 5 mL af tricaine løsning (0,4% på 1 x arbejder koncentration) over agarosegelelektroforese.
Bemærk: Undgå bevægelser af larverne under laser ablation, skal larverne holdes bedøvede hele proceduren ablation.
- Ablate larve ved hjælp af funktionen blegning i en to-foton laser mikroskopi system.
- Placer de Agarosen indstøbte larve under en to-foton laser scanning mikroskop og starte mikroskopi system.
- Start billede erhvervelse software og klik på knappen "Om" fanen "Laser" for at aktivere laser (fig. 1D). Afvente "statussen" af laseren at ændre fra "Optaget" til "Mode-låst."
- Under fanen "Kanaler" angive laserens bølgelængde på 880 nm (maksimal effekt: ca 2.300 mW) for EGFP ablation eller på 800 nm (maksimal effekt: cirka 2.600 mW) for GCaMP ablation.
- Vælg 20 X mål linsen ved at manuelt flytte linsen revolver. Klik på fanen "Find", klik på "Normal god landbrugspraksis" til at ændre de optiske veje, og direkte Se fluorescens af øjet.
- Find zebrafisk larve hjernen på midten af visning; Klik derefter på fanen "Tilegnelse" at gå tilbage til de to-foton mikroskopi.
- Som en rekord på betingelsen 'før ablation', tage en z-stakken billede med 20 X mål linsen på hurtig scanning-hastighed (for at undgå varmeskader). Senere sammenligne billeder taget før og efter ablation eksperimenter (fig. 2A). For at opnå en z-stakken, skal du klikke på "Z-Stack" for at vælge indstillingen z-stakken og udvide tab. Angiv den nedre grænse (Klik i "indstille første" knap") efter fokusering på den ventrale ende af larve hjernen, og Angiv den øvre grænse (Klik på knappen"Angiv sidste") efter med fokus på den dorsale de fleste-overfladen af hjernen. Klik på knappen "Start eksperiment" for at køre z-stakken billede erhvervelse.
- Vælg 63 X mål linsen ved at manuelt flytte linsen revolver.
- Klik på fanen "Find" for at skifte til epi-fluorescerende mikroskopi, finde celler til at være ablated på midten af visning af øjet, så klik på fanen "Tilegnelse" at gå tilbage til laser scanning mikroskopi.
- Under fanen "Erhvervelse Mode" angive "rammestørrelse" på 256 x 256. Klik på "Live" og observere neuroner af interesse.
- Starter fra den dorsale-mest side, finde en fokalplan, hvori cellerne til at være ablated er i fokus.
- Markere et lille, cirkulært område omkring en tredjedel af cellens størrelse i diameter på hver neuron som en region af interesse (ROI) ved hjælp af funktionen "Regioner".
- Indstille scanning hastighed til 13.93 s/256 x 256 pixel (134.42 µm x 134.42 µm), hvilket svarer til en laser hviletiden ca 200 µs/pixel eller 200 µs/0,5 µm. Indstil også 4 gentagelser (' iterationssløjfe: 4'). Alternativt, optimere antallet af gentagelser og afsøgning hastighed, så tilstrækkelig ablation er opnået.
- Udføre funktionen 'Blegning' for ablation, i kombination med tiden serie (2 cykler) for image prøve (før og efter ablation) og "Regioner" (at sætte ROIs) eller tilsvarende funktioner i den anvendte software (figur 1D).
- Ved at sammenligne det første billede (før ablation) og den anden afbildning (efter ablation) i tidsserierne cyklus, sikre, at efter blegning, fluorescens i målrettede celler falder til den konstaterede på baggrundsniveau (figur 2B).
- Hvis Fluorescens er stadig til stede efter ablation, øge antallet af gentagelser.
- Næste, flytte brændplanet lidt dybere (dvs, mod den ventrale side), og Vælg næste brændplanet hvor un-ablated celler vises.
- Udføre funktionen blegning, som beskrevet ovenfor (trin 1.9). Gentag disse trin, indtil alle celler i den neurale struktur af interesse har været ablated.
- Efter at gå gennem alle de fokale planer dækker de neurale strukturer at blive ablated, Kontroller cellerne for afskaffet fluorescens. Hvis der findes nogle celler at stadig være fluorescerende på grund af utilstrækkelig ablation, laser-bestråle dem igen som beskrevet ovenfor.
- Hvis larve skal inddrives fra Agarosen efter laser bestråling, forsøg ikke at tvinge det ud af agarosegelelektroforese, da det kan beskadige larve. I stedet, omhyggeligt skære lille i Agarosen omkring larve vinkelret på overfladen af sin krop. Derefter vente for larve til at svømme ud af Agarosen på eget når narkose aftager.
- Fortsæt til de næste larve for ablation eller udføre kontrol eksperimenter ved hjælp af en anden befolkning af neuroner, der er uengagerede i opførsel under undersøgelsen.
Bemærk: Her, som et kontrolelement, Lugtekolben neuroner i UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B larver var laser-ablated ved hjælp af samme protokollen beskrevet ovenfor (figur 2A, højre). - Giver mulighed for flere timer eller 1 dag til nyttiggørelse, før du fortsætter til Ca imaging (afsnit 2) eller adfærdsmæssige optagelse (afsnit 3). Under denne restitutionstid, kontrollere larve (dvs., normal spontan svømning, ingen tilsyneladende varmeskader omkring ablated område, etc.) og fjerne larver viser tegn på dårligt helbred.
2. calcium billeddannelse til at registrere bytte-fremkaldte Neuronal aktivitet i Pretectum-ablated zebrafisk larver
- At forberede en optagelse kammer, sætte en secure seal hybridisering kammer pakning på et glas dias, med den klæbende side vender på glasset, og fjern den øverste segl.
Bemærk: Dette skaber et lille kammer, der er 9 mm i diameter og 0,8 mm i dybden (fig. 3A). - Placer en nylon mesh (størrelse åbning: 32 µm) på en 50 mL tube, der har bunden skar. Tilslut trådnet på røret (figur 3B) ved hjælp af fælles landbrugspolitik.
- Forberede paramecia (som er bytte skal bruges som den visuelle stimuli til larve).
Bemærk: Forberede Paramecium kulturen (trin 2.3.1 og 2.3.2) på forhånd.- Få paramecia frø kultur fra kommercielle kilder eller akademiske bio-resource Centre24 på forhånd.
- Kultur paramecium i flere dage i vand indeholdende autoklaveres ris halm og en pellet tørgær øl22 (figur 3C).
- Hæld paramecium kulturen gennem 2 sier successivt (en med en 150 µm blænde, efterfulgt af en anden med en 75-µm blænde) til at fjerne snavs fra kulturen.
- Saml paramecia i gennemstrømnings-fra forrige trin på en nylon mesh (13-µm blænde).
- Genopslæmmes paramecia på nylon mesh i et glas bægerglas ved hjælp af en squeeze flaske system vand (figur 3D).
- Skyl trådnet (fig. 3B) i system vand 2 x (figur 3E).
Bemærk: Formålet med dette trin er at fjerne enhver mulig duftstoffer og tastants i dyrkningsmediet paramecium som målet med den foreliggende undersøgelse er at observere visuelt drevet neuronal aktivitet. - Placer en zebrafisk larve i tricaine løsningen til bedøver.
- Montere en enkelt larve i 2% lavt smeltepunkt agarosegelelektroforese.
- Først, mikrobølgeovn 2% lavt smeltepunkt Agarosen og tilføje 1/10 volumen af 10 x koncentreret tricaine til agarosegelelektroforese.
- Anbring en dråbe af den tricaine-holdige Agarosen på optagelse kammer (fig. 3A).
- Efter at have bekræftet Agarosen er ikke for varmt, placere den bedøvede larve (fra trin 2,5) i agarosegelelektroforese, straks at fjerne eventuelle overskydende Agarosen, således at overfladen af Agarosen ser lidt konveks.
- Hurtigt orientere larve i en oprejst position med en dissekere nål (figur 1C).
Bemærk: Disse procedurer skal fuldføres inden for nogle sekunder før Agarosen størkner. - Når larve er placeret korrekt, mulighed for 5 min til Agarosen størkne helt. Derefter, hæld en dråbe af 1 x tricaine løsning på agarosegelelektroforese.
- Fjerne Agarosen omkring hovedet af zebrafisk larve og gøre plads for paramecium til at svømme med en kirurgiske kniv. For at gøre dette, skal først et par små snit i Agarosen (figur 3F). Så fjern forsigtigt den overskydende Agarosen af forsigtigt hælde system vand på kammeret.
Bemærk: På dette trin, vil tricaine blive vasket ud. - Næste, sætte en paramecium i optagelse kammer til at fungere som en visuel stimulering.
Bemærk: Når paramecium svømmer nær hovedet af zebrafisk larve, vil det fremkalde en neuronal reaktion (figur 3G). - Sted optagelse kammer under en epi-fluorescens mikroskop udstyret med en videnskabelig CMOS kamera (figur 3H) og vælge en 2,5 X mål linse (figur 3jeg).
- Indsamle time-lapse optagelser af GCaMP fluorescens signaler.
- Start programmet image erhvervelse for udstyret kamera.
- Klik på "Sekvens rude" og vælg "Harddisk Record" på ruden. Angiv "Frame Count" til 900 eller enhver anden samlede ramme antal ønskede i sektionen scanningsindstillinger.
Bemærk: Hvis det er tilgængeligt, bruge time-lapse optagelse software med et modul (her, "harddisk optager") der muliggør effektiv lagring af data på en harddisk. - I ruden "Capture" angive eksponeringstiden på 30-ms (dvs., 33.3 fps) og udsmidningen 2 x 2.
- På mikroskopet kontrol touch-panel, vælge et filter sat til normal god landbrugspraksis, som GCaMP har lignende excitation/emission spectra til normal god landbrugspraksis.
- Klik på "Live" på ruden Capture til at finde en larve i kameraet Se og fokus (figur 4A), og derefter klikke på "Stop Live" og klik på knappen "Start". Gem filmen i .cxd eller et andet format, som indeholder oplysninger om betingelsen erhvervelse.
- Efter optagelserne, analysere GCaMP6s fluorescerende signaler (Ca signaler) ved at opnå gennemsnitlige pixelværdier til ROI på en hjerne struktur i den time-lapse film ved hjælp af den gratis software Fiji25.
Bemærk: Fiji er en version af ImageJ med mange nyttige plug-in er forudinstalleret, og kan læse .cxd formater billedfiler med Bio-formater plug-in. - Hvis larver bevæge sig en anelse under indspilningen, skal du udføre billede registrering ved at køre TurboReg plug-in26 i Fiji. Fra menuen, Vælg 'Plugins', 'Registrering' og 'TurboReg'.
- Overveje, hvordan man analysere data i overensstemmelse med formålet med undersøgelsen. Følgende er et eksempel.
- Beregn F/F0 (Fluorescens intensitet på hver gang, divideret med fluorescens-intensiteten i hvile eller før enhver Ca forbigående opstod) som følger:
- Indstille ROIs på pretectum eller ILH ved hjælp af ROI Manager: i menuen, Vælg "Analysere," "Værktøjer," "ROI Manager", og "Føj" til listen over ROIs (figur 4A).
- Beregner de gennemsnitlige pixelværdier for ROIs (dvs., fluorescens intensiteter af GCaMP6s) ved at vælge på panelet ROI Manager: "Mere," "Støtteaftaler for flere foranstaltninger" og "OK". Gemme resultaterne som en regnearksfil.
- Som signalerne støjer, gennemsnitlig signaler for 11 tid-point (bevægeligt gennemsnit) ved hjælp af et program, der kan håndtere regnearksdataene.
- Divider F (Fluorescens intensiteter over tid) med F0 (Fluorescens intensitet på basal plan) til at beregne normaliseret fluorescens-intensiteten. Som et eksempel på datavisualisering, ændringer i normaliserede GCaMP6s fluorescens intensitet i pretectum og ILH er farvekodede og kortlagt på paramecium baner (fig. 4B - D).
3. vurdering af adfærdsmæssige konsekvenser efter Laser Ablation
- Oprette en adfærdsmæssige optagelse system, der består af en Stereoskopet udstyret med et videokamera. Bruge et kamera med en passende billede erhvervelse software, kommercielle eller skræddersyede (figur 5A).
- Optimere lysforhold, så paramecium kan blive opdaget af billedbehandling. For eksempel bruge en ring hvid LED lys med en spacer (figur 5B).
Bemærk: Afstand fra, og vinklen på, LED påvirker udseendet af prøven (dvs., lyse i mørke baggrund eller mørke i lyse baggrunden) og er derfor afgørende for vellykket billedbehandling. Bestemme den bedste højde på spacer (figur 5C). - Placer en zebrafisk larve (inddrives fra laser-ablation eksperimentet beskrevet i afsnit 1) i en adfærdsmæssige optagelse kammer, (som var knyttet til et glas dias) med de oprindelige top tætning fjernet (fig. 5D).
- Indsamle 50 paramecia fra kultur (trin 2.3.5) ved hjælp af en mikropipette og placere dem i salen, optagelse.
- Placere en cover slip på toppen af optagelse kammer. Sætte en lille dråbe vand på cover slip før du placerer på vandoverfladen af optagelse herhen for at undgå at indføre luften i kammeret.
Bemærk: I dette trin, vil nogle vand med paramecia overløb fra optagelse kammer. Det resterende antal paramecia i salen, optagelse vil være ca. 30-40. - Placere optagelse salen (indeholdende en larve og paramecia) i belysningssystem (fig. 5D).
- Starte time-lapse optagelsen på 10 fps for 11 min (6.600 rammer).
- (Valgfrit) For hver larve, der blev testet for adfærd, overholde fluorescens af de laser-ablated områder af fluorescerende mikroskopi til at bekræfte effektiviteten af laser-ablation (dvs.fravær eller væsentligt reduceret antal, fluorescerende celler i den laser-bestrålede område).
Bemærk: Selv efter bestråling, kan nogle fluorescerende celler stadig konstateres som følge af senere indsættende Gal4 genekspression i celler, der differentieres efter ablation27. - Efter optagelse det larve adfærd, at kompensere for manglen ensartethed i baggrunden, udføre en pixel for pixel division af hver ramme af en gennemsnitlig billede i Fiji: Klik på 'Behandle', 'Billede lommeregner', ' Operation: opdele ', ' 32-bit (float) resultatet ', og ' OK'. For at gøre en gennemsnitlig billede, skal du klikke på 'Billede', 'Stakke', 'Z-projektet', 'Gennemsnitlig intensitet' og 'OK' (figur 5E, F).
- Tæller antallet af paramecia til venstre i salen ved at klikke på 'Analysere', 'Analysere partikler', oprettelse et område rækkevidde, der dækker alle paramecia, markere afkrydsningsboksen 'Show: masker', og klikke på 'OK'. Indstillingen 'Vis: masker' vil give en udpakkede paramecia billede (figur 5G), med en liste over antallet af partikler (paramecia) i hver ramme.
- Afbilde antallet af paramecia venstre i optagelse kammer over tid. Da skøn over antallet af paramecia er støjende, anbefaler vi udfører et bevægeligt gennemsnit på hvert punkt i en vifte af 600 frames (1 min) på regnearket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Specifikke neuroner var genetisk mærket med enten EGFP eller GCaMP6s, hvis udtryk blev drevet i Gal4 linjer. En Gal4 linje gSAIzGFFM119B blev brugt til at mærke en kerne i det pretectal område (magnocellular overfladiske pretectal kerne), og en delpopulation af olfaktoriske pære neuroner. En anden Gal4 linje, hspGFFDMC76A, blev brugt til at mærke ILH. Vi laser-ablated pretectal neuroner bilateralt (figur 2A venstre panel) og også ablated neuroner i de olfaktoriske pære bilateralt som en kontrol (figur 2A højre panel) i zebrafisk larver af en Gal4 linje gSAIzGFFM119B, blev parret med UAS:EGFP reporter fisk. Resultaterne viser, at to-foton laser kan ablate målrettede celler mens tilstødende celler eller neurites upåvirket (figur 2B).
De pretectal neuroner projekt deres axoner mod ILH ipsilaterally. Her, undersøgt vi deres funktionelle forbindelse ved hjælp af Ca billeddannelse. Neuronal aktivitet i denne region kan iagttages som Ca signaler med et Ca sonden GCaMP6s (figur 4A), hvis udtryk var drevet af en Gal4 linje gSAIzGFFM119B (fig. 4B) eller en anden Gal4 linje hspGFFDMC76A (figur 4 C). de farvede pilespidser (figur 4) viser svømning retninger og baner af paramecium, samt farvekodede Ca signal-ændringer i området angivne hjernen som blev fremkaldt ved synet af svømning paramecium (Fig. 4B-D). Både pretectum (fig. 4B) og ILH (fig. 4C) viste neuronal aktivitet i den proksimale tilstedeværelse af byttedyr, tyder på, at begge neuronal aktiviteter er visuelt drevet.
Ved hjælp af de dobbelte Gal4 GCaMP6s larver (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s), vi ablated pretectal neuroner ensidigt og yderligere udføres Ca imaging for at observere neuronal aktivitet i pretectum og ILH i ablated larverne. Den venstre pretectum, der var laser-ablated viste resterende at ingen neuronal aktivitet (figur 4D, øverst til venstre), hvilket tyder på, at laser-ablation var vellykket. Den ipsilaterale ILH viste imidlertid dramatisk reduceret neuronal aktivitet (figur 4D nederst til venstre), hvilket tyder på, at den større input til ILH stammer fra den ipsilaterale pretectum. Derimod ILH på anden siden af den laser-ablated pretectum (figur 4D nederst til højre) viste neuronal aktivitet sammenlignes med neuronal aktivitet i den ipsilaterale pretectum (figur 4D, øverst til højre), som tyder på, at den rigtige ILH modtager input fra de rigtige pretectum.
Valget af hvilke adfærdsmæssige analyse til brug i et eksperiment afhænger de mulige roller af neuroner under undersøgelsen. Her viser vi et eksempel på en bytte-capture assay efter ablation af en pretectal kerne, der blev identificeret som et bytte detektor21. Ved hjælp af belysningssystem vist i figur 5A-D, kan antallet af paramecium i salen, optagelse tælles af billedbehandling (figur 5E-G). Automatiseret udvinding af øjne, og beregningen af øjet positioner (dvs.ændringer i vinkler af øjnene) kan også være muligt, fordi øjnene af zebrafisk larve vises mørkere end baggrunden i denne oplysning betingelse (figur 5Hansen ).
Resultaterne af forsøget viser, at bilaterale-ablation af pretectum afskaffet bytte-capture aktivitet (Fig. 5I, PT) mens ablation af en delpopulation af neuroner i de olfaktoriske pære ikke gjorde (figur 5jeg, OB). Disse resultater, med eksperimenter vist i figur 4, tyder på, at det pretecto-hypothalamus kredsløb er afgørende i bytte-capture adfærd.
Figur 1 . Zebrafisk larver. (A) fem - dage gamle (5-dag efter befrugtning (5-dpf)) zebrafisk larve og sit bytte, en paramecium. (B) 4-dpf nacre larve indlejret i 2% lavt smeltepunkt agarosegelelektroforese. Bemærk at nacre stammen mangler sorte pigmenter på kroppen, mens den retinale pigment epitel er intakt. Skalalinjen: 0,5 mm. (C) Dissecting nål bruges til orientere zebrafisk larver i agarosegelelektroforese. Skalalinjen: 1 cm. (D) Screenshot af softwaren anvendes i to-foton mikroskopi, viser "Blegning", "Time Series" og "Regioner" paneler, der blev brugt i ablation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Ablation af en delpopulation af neuroner ved hjælp af en to-foton laser mikroskop. ()A) EGFP fluorescerende billeder af 4-dpf zebrafisk larver før og efter ablation af neuroner. Ovenfra og sideudsigt over 3D rekonstruerede z-stak billeder ved hjælp af billedbehandlingsprogram. Z-stak billeder blev taget med en 20 X mål linse. Områderne ablated (enten i pretectum eller olfaktoriske pære) er cirklet i gul. Skalalinjen: 100 µm. ()B) eksempel på laser ablation på en enkelt brændplanet ved hjælp af funktionen "Blegning". Laser-bestrålede områder (angivet som ROIs) er vist i farver på hver celle. Skalalinjen: 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Forberedelse af zebrafisk larver og paramecia til Ca billeddannelse. (A) optagelse kammer. Et kommercielt tilgængelige 9 mm diameter x 0,8 mm dybde hybridisering pakning med 8 afdelinger blev udnyttet som optagelse kammer. Pakningen var lagt på et glas dias og overholdes. Seal på toppen af pakningen var pillet ud. ()B) nylon mesh (32 µm) bruges til at skylle paramecia. Trådnet blev placeret på en 50 mL tube. (C) Paramecium kultur indeholdende ris strå og tørre gær pellets. (D) Paramecium stamopløsning tilberedt af den kultur, der er vist i C. (E) Paramecium stamopløsning var skylles med system vand to gange for at fjerne mulige olfaktoriske og gustatoriske stikord i mediet. (F) Paramecium indlejret i optagelse kammer. Hvis du vil fjerne en del af agarosegelelektroforese, blev flere nedskæringer foretaget. (G) optagelse kammer med en zebrafisk larve og en paramecium. Fleste af Agarosen er blevet fjernet for at tillade paramecium at svømme. Lederen af zebrafisk larve er udsat. (H) oprejst fluorescerende mikroskop bruges i Ca billedbehandling. Mikroskop er udstyret med en videnskabelig CMOS kamera. (jeg) zebrafisk larve i optagelse kammer under mikroskop med lys på excitation. Med en 2,5 X mål linse er belyst området lidt større end størrelsen af salen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Repræsentant Ca imaging data. (A) placeringen af pretectum og den ringere lap af hypothalamus (ILH), cirklet i gul, i en dobbelt Gal4 hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s zebrafisk larve. (B) ændringer i pretectum Ca-signalet (gennemsnit bilateralt), farve-kortlagt på baner af en paramecium i en gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s larve. Skalalinjen: 1 mm. (C) ændringer i den ILH Ca signal (gennemsnit bilateralt), farve-kortlagt på baner af en paramecium i en hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s larve. Skalalinjen: 1 mm. (D) ændringer i pretectum og de ILH Ca signaler farve-kortlagt på baner af en paramecium i en hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s larve, der blev udsat for to-foton laser-ablation af den venstre pretectum. Skalalinjen: 1 mm. Dette billede blev gengivet fra den samme data tidligere udgivet21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Bytte capture assay og repræsentative data i laser-ablated zebrafisk larver. (A) adfærdsmæssige optagelse system. Stereomikroskopet var udstyret med en CMOS kamera. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et brugerdefineret script. (B) komponenter nødbelysningsanlæg. En grå-farvet papir, et glas diffuser, hvid LED ring lys, diffuser, en skræddersyet spacer (pap) og diffuser med et hul i midten. (C) Belysningssystemet samles fra de dele, der er vist i B. (D) optagelse kammer for bytte capture assay. Et kammer (diameter: 20 mm, dybde: 2,5 mm) blev placeret på et glas dias. Den oprindelige top tætning af salen blev pillet ud. En glas-cover blev sat på optagelse kammer. (E) Raw-billede fra en ramme af de optagede film. (F) A frame divideret (pixel for pixel) med en gennemsnitlig billede i en film. Bemærk, at de ikke-ensartet baggrund i belysning kan kompenseres af denne billedbehandling. (G) Paramecia udvundet fra en ramme ved hjælp af funktionen "Partikel analyse" i Fiji. (H) eksempel på billedet i Fiji med en anvendt tærskel. Paramecia vises lyse, øjne af zebrafisk larve vises mørke, og baggrunden er grå. Ændringer i øjet positioner (dvs., vinkler med hensyn til kroppens akse) kan beregnes, hvis nødvendigt. (jeg) repræsentative forsøgsdata af paramecium forbrug i en olfaktoriske ablated pære kontrol larve (OB) og en pretectum-ablated larve (PT). Pretectum ablation reduceret betydeligt bytte jagt evne, mens lugtekolben ablation ikke påvirkede det. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom to-foton laser har en fremragende rumlige opløsning til specifikt ablate individuelle neuroner, bør der udvises stor forsigtighed at undgå uønskede skader på hjernevævet på grund af varmen. Det vigtigste skridt i ablation eksperiment er at bestemme den optimale mængde af laser bestråling. Utilstrækkelig bestråling undlader at dræbe neuronerne. For meget bestråling vil varme-skader det omkringliggende væv, som vil resultere i uønskede virkninger. Den optimale vifte af laser bestråling (områder af ROIs, antallet af gentagelser, og afsøgning hastighed) synes at være smalle. Et par faktorer, der påvirker effektiviteten af ablation.
Først ved hjælp af forskellige fluorescerende reporter proteiner, skal ablation betingelser optimeres for hvert reporter. GCaMP udtryk er observeret i cytoplasma kerner. Derimod vises EGFP fluorescens i hele indersiden af den celle, som kan være fordelagtige for effektiv og specifikke ablation af de målrettede celler, i forhold til GCaMP. Brugen af GCaMP er også uheldigt, som en laser-ablated GCaMP-udtrykker celle kan udstille øget fluorescens intensitet på grund af umiddelbar Ca massetilstrømning, i modsætning til nedsat fluorescens intensitet i EGFP blev brugt til ablation. Således er kan ikke ændringen i fluorescens være en pålidelig indikator for omfanget af ablation med GCaMP. I sådanne tilfælde kan det være nødvendigt at validere ablation ved at observere tabet af fluorescerende celler efter en bestemt periode. Fravær eller betydelig reduktion af Ca-signaler i området ablated kan være et andet kriterium for vellykket ablation med GCaMP.
For det andet kan mængden (dvs., scanning hastighed, iteration antal scanninger) laser bestråling kræves for succesfuld ablation variere afhængigt af dybden af placeringen af neuroner fra overfladen af hjernen. Sammenlignet med celler i nærheden af overfladen, kræver dem, der findes dybt inde i hjernen flere laser bestråling, således at gøre det vanskeligere at ablate dem. Optimering for den laser bestråling bør fastsættes specifikt for hver målrettede delpopulation af neuroner.
For det tredje var det empirisk observeret, at angive et antal ROIs i et lille område i en scanning ofte varme-beskadiget væv omkring cellerne (bedømt af udseendet af bobler i området laser-bestrålede), hvorimod målretning én celle alene, eller tyndt distribuerede ROIs i en scanning på den samme betingelse har ikke skadelige virkninger. I den foreliggende undersøgelse, var blegning anvendes kun på et lille område (ca. en tredjedel af cellen kroppen størrelse) for at undgå skader på væv uden for de målrettede celler. Typisk var 5-10 celler rettet på hver brændplanet (4-8 fly til at dække hele pretectal område).
Ud over at optimere størrelsen af laser bestråling, er omfattende validering af laser ablation af udfører kontrol eksperimenter kritisk. Et kontrol-eksperiment kan omfatte laser ablation af en anden delpopulation af celler, der er usandsynligt, at være involveret i adfærd undersøges. Olfaktoriske pære neuroner mærket i den samme Gal4 linje fungerede som kontrol i den nuværende undersøgelse (figur 2A, højre, og figur 5jeg). Af ovennævnte grund kan ingen grupper af neuroner tjene som en ideel kontrol. Hver af de delpopulationer af neuroner adskiller sig fra de andre med hensyn til deres placering i hjernen, celle tæthed, fluorescerende reporter transgen udtryk niveau, spredning sats og timing af reporter transgen udtryk. Disse forskelle gør det umuligt at bruge den nøjagtige samme indstilling til ablation (funktionen 'Blegning') i kontrol eksperimenter. Således bør forskellige typer af forsøg, kontrol også betragtes som, såsom målinger af optokinetic svar, visuel adfærd28og basal aktivitet i bevægelse21 sikre den specifikke effekt af ablation.
Vores erfaring tager ablation af snesevis af de pretectal celler bilateralt, ca. 1 h (fra indlejring i agarosegelelektroforese, ablation ved hjælp af en to-foton mikroskop, til at hente fra Agarosen efter ablation). Op til 8 larver døgnet (fx, 4 larver for eksperimenterende og 4 for kontrol) kan være ablated; derfor et par sæt af eksperimenter kan være nødvendigt at sikre, at der er nok larver for en eksperimenterende gruppe (f.eks.n = 12) og en kontrolgruppe (f.eks.n = 12). Derudover er det ønskeligt at tillade halv en dag eller en dag for larver at tilbagesøge ablation (f.eks.laser ablation på 4-dpf efterfulgt af en adfærdsmæssige optagelse på 5-dpf eller ablation morgenen efterfulgt af Ca imaging om eftermiddagen). Under denne restitutionstid, bør enhver dårligt kigge larver udelukkes fra undersøgelsen.
Den protokol, der bruges til at analysere de opnåede data afhænger helt af formålet med undersøgelsen. Den nuværende undersøgelse med fokus på relationer mellem placeringen af paramecium i det visuelle felt og neuronal aktivitet i pretectum og ILH. I betragtning af den langsomme forfald (~ sekunder) af GCaMP6s signaler29, kun timingen af stigningen, men ikke faldet, af GCaMP6s signaler korrelerer med placeringen af paramecium. Ca signaler kan være høje, selv når paramecium flytter væk. Dermed, vi kun medtaget øget fluorescens intensiteten af GCaMP6s i præsentationen af data. Denne type analyse kræver ofte specialfremstillede scripts skrevet med specifikke programmerings sprog eller makrosprog. De scripts, der anvendes i dette papir er tilgængelige efter anmodning.
Den tilbageholdende tilstand (dvs.Agarosen-embedded) kan være stressende at zebrafisk larverne til en vis grad; dog vi ikke observere tilsyneladende stress-induceret neuronal aktivitet eller adfærd i denne tilstand, når man sammenligner med de fritsvømmende betingelse21,22. Agarosen indstøbte zebrafisk larver kan overleve mindst 24 h, (formentlig flere) uden synlige problemer. Paramecium-drevet Ca signaler i pretectum og ILH i begrænset tilstand var det samme som observeret i fritsvømmende larver21. Zebrafisk visuel adfærd kan styres af døgnrytme. Dermed, vi gennemførte adfærdsmæssige eksperimenter fra tidligt til sent om aftenen. Vildtype og kontrol larver forbruges et betydeligt antal paramecia under denne optagetid.
De funktionelle og adfærdsmæssige assays beskrevet her udnytter de mest almindeligt tilgængelige udstyr, der kan findes i mange laboratorier eller kunne være nemt at sætte op, og dermed den skulle brede programmer i forskellige områder af adfærdsmæssige videnskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter til betænkningen.
Acknowledgments
Disse undersøgelser blev finansieret af tilskud modtaget fra MEXT, JSP'ER KAKENHI Grant numre JP25290009, JP25650120, JP17K07494 og JP17H05984.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
- Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
- Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
- Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
- Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
- Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
- Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
- Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
- Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
- Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
- Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
- Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
- Ewert, J. -P. Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , Springer Verlag. (1980).
- Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
- Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , University of Oregon Press. (2007).
- National BioResource Project Paramecium. , Available from: http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en (2017).
- Fiji. , Available from: https://fiji.sc (2017).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
- Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
