Summary
Toutes les espèces pathogènes de Leishmania résident et répliquent à l’intérieur de macrophages de leurs hôtes vertébrés. Nous présentons ici un protocole pour infecter les macrophages dérivés de la moelle osseuse souris dans la culture avec la Leishmania, suivie d’une quantification précise de la cinétique de croissance intracellulaire. Cette méthode est utile pour l’étude des facteurs individuels qui influencent l’interaction hôte-pathogène et la virulence de Leishmania .
Abstract
Le cycle de vie de Leishmania, l’agent causal de la leishmaniose, alterne entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et vertébrés hôtes, respectivement. Alors que les symptômes pathogènes de la leishmaniose peuvent varier considérablement, de lésions cutanées bénignes aux formes hautement mortelle maladie viscérale selon l’espèce infectieux, toutes les espèces de Leishmania résident à l’intérieur de macrophages de l’hôte pendant l’étape de vertébrés du leur cycle de vie. Leishmania infectiosité est donc directement liée à sa capacité à envahir, de survivre et de répliquer dans les vacuoles parasitophore (PVs) à l’intérieur des macrophages. Ainsi, évaluer la capacité du parasite à répliquer intracellulairement sert une méthode fiable pour déterminer la virulence. Étudier le développement de la leishmaniose à l’aide de modèles animaux est long, fastidieux et souvent difficile, en particulier avec les formes viscérales rôle importants. Nous décrivons ici une méthodologie pour suivre le développement intracellulaire de Leishmania dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs). Nombre de parasites intracellulaires est déterminés à intervalles de 24 h pour 72-96 h après l’infection. Cette méthode permet une détermination fiable des effets de divers facteurs génétiques sur la virulence de Leishmania . À titre d’exemple, nous montrons comment une délétion seul allèle du gène Mitochondrial transporteur de fer Leishmania (LMIT1) porte atteinte à la capacité de la souche mutante de Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 à pousser à l’intérieur de BMMs, soit une réduction drastique dans la virulence par rapport au type sauvage. Ce dosage permet également un contrôle précis des conditions expérimentales, qui peuvent être manipulés individuellement pour analyser l’influence de divers facteurs (nutriments, espèces réactives de l’oxygène, etc.) sur l’interaction hôte-pathogène. Par conséquent, l’exécution appropriée et la quantification des études d’infection BMM fournissent une alternative non invasive, rapide, économique, sécuritaire et fiable pour les études sur des modèles animaux conventionnels.
Introduction
La leishmaniose se réfère à un large éventail de maladies humaines causées par les espèces de protozoaire parasite du genre Leishmania. Environ 12 millions de personnes sont actuellement infectées par Leishmania dans le monde entier, et plus de 350 millions sont menacés. La pathologie de la maladie dépend de l’espèce de Leishmania et facteurs de l’hôte, et symptômes varient d’innofensif auto guérison des lésions cutanées aux formes visceralizing mortelles. Si non traitée, viscérale de la leishmaniose est fatale, rang seulement après le paludisme comme la plus meurtrière maladie humaine causée par une infection par un protozoaire parasite1. En dépit des différences de grande envergure dans la pathologie de la maladie et les symptômes, toutes les espèces de Leishmania ont un cycle de digéniques alternant entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et les hôtes vertébrés, respectivement. Intérieur vertébrés, Leishmania ciblent les macrophages hôtes pour invasion et induisent la formation de vacuoles parasitophore (PVs), compartiments acides avec les propriétés des phagolysosomes où les formes hautement virulente amastigote répliquent. Amastigotes persistent dans les tissus de l’hôte lors d’infections chroniques et peuvent être passés vers des phlébotomes, complétant le cycle de transmission. Par conséquent, dans le contexte du développement de la maladie humaine, amastigotes sont le plus important Leishmania lifecycle formulaire2. Étudier comment les amastigotes se reproduire à l’intérieur de macrophages PVs est essentiel pour comprendre Leishmania virulence3,4,5,6,7 et la développement de nouveaux traitements efficaces.
Nous décrivons ici une méthode régulièrement utilisée par notre laboratoire pour étudier les maladies infectieuses Leishmania et réplication dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs), qui prévoit une évaluation quantitative du nombre d’intracellulaire Leishmania au fil du temps. Le processus implique la récolte des monocytes de moelle osseuse de souris et de la différenciation à macrophages en culture, in vitro l’infection avec des formes infectantes (promastigotes métacycliques ou amastigotes) de Leishmania et quantification de la nombre de parasites intracellulaires à chaque intervalle de 24h pour une période de 72-96 h après l’infection. Ce test a été utilisé dans notre laboratoire pour déterminer l’effet de plusieurs facteurs environnementaux et les gènes parasites, y compris l’identification du rôle crucial de fer dans la promotion de L. amazonensis virulence qui a été également validé par coussinet plantaire études de développement de lésions en souris6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Étant donné que toutes les espèces de Leishmania pathogènes établissent leur niche réplicative à l’intérieur de macrophages de l’hôte, ce test peut être utilisé universellement pour les déterminations de la virulence chez toutes les espèces de Leishmania .
Effectuant des infections BMM permet l’analyse des interactions hôte-parasite au niveau de la cellule unique et donc une plus vaste compréhension de comment les parasites Leishmania interagissent avec leur microenvironnement hôte préféré, le PVs des macrophages. Macrophage infection dosages ont été utilisées avec succès par plusieurs groupes16,17,18,19,20,21,22 à explorer fonctions de macrophage hôte et Leishmania de gènes spécifiques et leur implication potentielle dans les interactions complexes qui caractérise l’infection intracellulaire. Les infections BMM permettent la quantification de la croissance du parasite comme une lecture de l’impact des facteurs de l’hôte qui influencent la survie intracellulaire, tels que la production d’oxyde nitrique microbicide, génération d’espèces réactives de l’oxygène et autres conditions défavorables rencontrés dans le lysosome type PVs23. Macrophage infection essais ont également été utilisés pour identifier prospects de drogue anti-leishmanies potentiels pour le développement de thérapeutiques13,24.
Le caractère in vitro des infections BMM offre plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes pour évaluer la virulence de Leishmania . Cependant, plusieurs études antérieures, examen des mécanismes de survie du parasite intracellulaire au fil du temps n’ont pas quantifié l’infection comme un taux de21,20,24. En outre, beaucoup d’études axé sur le suivi des infections in vivo au fil du temps l’a fait en mesurant la taille des lésions cutanées et autres symptômes physiologiques qui ne sont qu’indirectement liées au parasite réplication25,26 , 27. in vivo de l’infection est une approche rigoureuse pour évaluer la virulence du parasite, mais les mesures de taille de lésion basées sur coussinet plantaire gonflement seul sont souvent insuffisantes, car elles reflètent la réponse inflammatoire dans les tissus infectés et pas la nombre absolu de parasites. Pour cette raison, le développement des lésions coussinet plantaire dosages doivent être suivies par la quantification de la charge parasitaire dans les tissus infectés, une procédure qui exige la dilution limite longue tests28. En outre, des études in vivo impliquent souvent sacrifier plusieurs animaux à différents points dans le temps pour en extraire des tissus d’intérêt6,8,9,10, 11 , 13. en revanche, un grand nombre de BMMs peut être obtenu d’un seul animal, et que ces cellules peuvent être plaqués dans des conditions qui permettent l’évaluation d’infection à divers points dans le temps. En outre, par rapport aux études in vivo , effectuant des infections in vitro BMM permet une plus grande maîtrise des conditions expérimentales. Quantifier les macrophages infectés ainsi que les parasites permet un contrôle précis de la multiplicité d’infection (MOI) et des conditions de culture. Contrôle précis sur ces facteurs peut être la clé dans l’identification des caractéristiques des voies cellulaires discrets et dans la compréhension de leur impact sur l’évolution de l’infection.
Compte tenu de ces avantages, il est quelque peu surprenant que très peu étudient des Leishmania virulence ont jusqu'à présent pleinement tiré profit de l’évaluation quantitative de réplication intracellulaire dans les macrophages. Dans cet article, nous discutons des pièges communs qui peuvent être gênant l’utilisation plus étendue de ce test et fournir un protocole étape par étape pour faciliter son application correcte. Compte tenu de sa précision et la polyvalence, le dosage d’infection BMM que nous décrivons ici peut non seulement servir d’explorer les interactions hôte-pathogène qui influent sur la virulence de la leishmaniose , mais aussi d’étudier d’autres microorganismes qui reproduisent à l’intérieur macrophages29. Ce qui est important, ce dosage peut également être développé comme une méthode de dépistage pré-clinique rapide et économique pour le développement de médicaments anti-leishmanies.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux recommandations du guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire par le National Institutes of Health et ont été approuvés par l’Université du Maryland IACUC. Toutes les étapes décrites dans les sections 1 à 4 devraient être effectués aseptiquement à l’intérieur des hottes à flux laminaire biologique. Protection individuelle doit être utilisée, et il faut être prudent lors de la manipulation de Leishmania vivants pendant toutes les étapes d’expérimentation .
1. isolement et différenciation des Macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs)8,30,31
- Jour 0 : 4 - 6 semaines femelle C57BL/6 ou souris BALB/c dans une chambre de CO2 de sacrifier et confirmer la mort par dislocation cervicale. Assurer la stérilisation des ciseaux et des pinces en les gardant trempées dans l’éthanol à 70 %. Vaporiser gants d’éthanol à 70 % pour permettre stérile manutention durant tout le processus d’isolement cellulaire la moelle osseuse.
- Sécuriser les souris sacrifiée au Conseil de dissection en épinglant ses pattes avant et désinfecter en pulvérisant abondamment avec l’éthanol à 70 %.
- Faire une petite incision (environ 1 cm) avec des ciseaux près de l’articulation de la hanche. Insérez avec précaution les ciseaux sous la peau pour séparer le muscle sous-jacent et couper la peau tout autour de l’articulation de la hanche.
NOTE : Le jury de la dissection peut être tourné pour permettre un accès amélioré à l’articulation de la hanche. - Soigneusement deglove la peau de la jambe en tirant vers la cheville et le retirer. Couper le pied à la cheville, en faisant très attention de ne couper égale ou inférieure à la cheville, commune de laisser le tibia entièrement intact.
Remarque : Le péroné à ce stade est librement fixé et peut être facilement séparé avec la pince. - Localiser manuellement l’articulation de la hanche en manipulant le fémur pour identifier le point de rotation. Avec soin, utiliser des ciseaux pour couper la jambe au-dessus de l’articulation de la hanche de laisser la tête proximale du fémur intact.
- Eliminez autant de muscles et du tissu conjonctif que possible de la jambe avec des ciseaux. Retirez toute la peau restante de la cheville et toute matière osseuse excessive au-dessus de l’articulation de la hanche.
- Placer les os nettoyés dans RPMI stérile additionné de pénicilline/streptomycine (concentration finale de 1 %) dans une boîte de Pétri sur la glace.
- Répétez les étapes 1,4 à 1,6 à isoler le tibia et le fémur de la jambe de derrière d’autre.
- Supprimer les éventuels musculaire et du tissu conjonctif des os trempage dans RPMI à l’aide de forceps stérilisé et lame #10 stérile.
- Placer les os sur le couvercle de boîte de Pétri. Coupez soigneusement le tibia avec la lame immédiatement au-dessus de l’articulation de la cheville pour accéder à la moelle. Enlever le tibia du reste de la jambe en coupant immédiatement au-dessous de l’articulation du genou.
- Tirer 10 mL RPMI stérile additionné de pénicilline/streptomycine (concentration finale de 1 %) dans une seringue de 10 mL et attacher une aiguille 25G.
- Maintenez les tibia fermement avec une pince, verticalement sur un tube conique de 50 mL sur la glace. Utiliser la seringue pour injecter doucement environ 5 mL de RPMI dans l’extrémité de l’OS pour vider la moelle osseuse de l’autre extrémité dans le tube à fond conique. Rincer la moelle osseuse avec un total de 10 mL RPMI jusqu'à ce que l’OS devient blanc.
Remarque : Après vidange complète, l’OS doivent blanchir. Si ce n’est pas le cas, poursuivre le rinçage pour enlever la moelle osseuse. L’extrémité distale du tibia peut être nécessaire de tailler revient avec la lame si elle est trop étroite pour insérer l’aiguille. - Coupez immédiatement le fémur au-dessus de l’articulation du genou et immédiatement au-dessous de l’articulation de la hanche pour exposer les deux extrémités de l’OS pour accéder à la moelle. Rincer la moelle osseuse du fémur avec un total de 10 mL RPMI de la même façon que le tibia.
- Répéter nettoyage et rinçage étapes 1.6 par 1.13 avec les os restants et de recueillir les cellules de la moelle osseuse rouge dans un tube conique unique 50 mL
Remarque : Si un OS tombe à tout moment au cours de la dissection avant rinçage osseuse, n’utilisez pas la moelle de cet OS. - Centrifuger le tube conique utilisé pour collecter la moelle osseuse vidée de tous quatre os pendant 10 min à 4 ° C à 300 x g.
- Mettre 60 mL de milieu stérile de BMM (RPMI avec une concentration finale de 20 % des BF, 1 % pénicilline/streptomycine, 1,2 mM Na-pyruvate, 25 µg/mL M-CSF humain) dans un flacon de culture cellulaire de2 de 175 cm avec bouchon de filtre.
- Jeter la surnageante centrifugation suivante et remettre en suspension le culot cellulaire en douce et descendre de pipetage à l’aide de 5 mL de milieu BMM du flacon.
- Transférer la suspension cellulaire dans le flacon de culture et rincer le tube conique deux fois avec moyen BMM du flacon de culture pour assurer le recouvrement de cellulaires maximales. Assurer la suspension cellulaire est bien mélangée dans un milieu et distribuer 30 mL le flacon de culture cellulaire initiale 175 cm2 à un deuxième 175 cm2 flacon de culture cellulaire avec bouchon de filtre.
- Incuber les deux flacons contenant de suspension cellulaire 30 mL chaque nuit à 37 ° C, 5 % de CO2 pour permettre la séparation de tout contaminant les fibroblastes, des macrophages résidents et autres cellules adhérentes.
- Jour 1 : Transférer le surnageant contenant des cellules indifférenciées de la moelle osseuse de flacons de 100 x 15 mm non traités-TC polystyrène Pétri à environ 10 mL/plat et incuber à 37 ° C, 5 % CO2. Jeter les flacons.
- Jour 3 ou 4 : Ajouter un support BMM supplémentaire 5 mL (préalablement chauffé à 37 ° C) pour chaque boîte de Pétri et continuer d’incubation à 37 ° C, 5 % de CO2.
2. électrodéposition BMMs sur lamelles couvre-objet pour l’Infection (jour 7 ou 8)
- Préparer les plaques 6 puits culture de tissu en plaçant quatre 4 lamelles de verre stérile 12 mm (stérilisés à l’autoclave et stockées dans un récipient en verre fermés) dans le fond de chaque vide bien.
NOTE : Ramasser chaque lamelle stérile 12 mm avec un embout d’aspiration monté sur une ligne vide. Placer les lamelles dans les puits sans chevauchement, libérant à la position désirée en pinçant le tube pour interrompre le vide. - Aspirat médias (et toute les cellules non adhérentes) de Pétri recouvertes d’adhérentes la moelle osseuse provenant des macrophages et doucement des cellules adhérentes de rinçage 2 x avec saline tamponnée au Phosphate de Dulbecco stérile sans chlorure de calcium et de magnésium (PBS- / -) préchauffée à 37 ° C.
- Ajouter goutte à goutte, 5 mL stérile 1 x PBS- / - avec une concentration finale de 1 mM EDTA à chaque boîte de Pétri et incuber pendant 5 min à 37 ° C, pour détacher adherent BMMs. vérifier que les cellules sont détachent à l’aide d’un microscope.
- Prélever des cellules tout détachés suspendus dans du PBS 1 x- / -, additionné de 1 mM EDTA dans un tube conique de 50 mL. Rincer chaque plat 2 x 5 ml de PBS- / - et ajouter au pool de suspension cellulaire.
NOTE : Suspension cellulaire peut être diluée avec du PBS supplémentaires- / - pour protéger des macrophages de la toxicité de l’EDTA pendant le processus de collecte. - Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les macrophages dans 5-10 mL de milieu de BMM de pipetage. Place remis en suspension sur la glace pour éviter la saisie à tubes et agglutination des cellules.
- Compter les cellules viables utilisant le bleu Trypan exclusion dans l’hémocytomètre.
Remarque : Pour compter les cellules BMM resuspendues dans 5 mL de milieu, un mélange de dilution de 25 µL de la suspension cellulaire dans 445 µL PBS- / - et 30 µL de solution de bleu de Trypan 0,4 % généralement permet de quantification facile dans un hémocytomètre (prenant en compte un facteur de dilution 20 x pour le calcul final ). Compter uniquement les cellules qui ne pas tachés avec le bleu de Trypan (cellules viables). Le volume de suspension cellulaire peut être modifié si ce mélange est trop concentré ou dilué. En général, le rendement du BMM par préparation varie entre 2 x 10,7 et 5 x 107 cellules de souris unique. - Préparer la suspension de cellules dans un milieu BMM à concentration de placage désiré (5 x 105/ml) et disperse suspension à 6 plats au milieu de 2 mL par puits, afin que chacun reçoive bien 1 x 106 macrophages.
NOTE : Ceci est une étape essentielle qui garantit chaque obtient bien le nombre adéquat de macrophages pour couvrir les lamelles uniformément. Vérifiez que les lamelles dans les puits ne sont pas chevauchement ou flottant dans le milieu. Dans l’affirmative, ajuster doucement avec un embout de la pipette stériles. - Incuber une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2.
3. purification des formes infectantes de L. amazonensis
NOTE : Préparez Leishmania car les infections - purifier promastigotes métacycliques du stationnaire promastigote cultures8,13, ou différencier promastigotes en culture en forme amastigote, utilisant le standard L. amazonensis différenciation axéniques protocole6,8.
-
Purification de Leishmania promastigotes métacycliques utilisant media(Materials) gradient de densité 33
- Préparer la solution mère de 40 % des médias gradient de densité dans l’eau stérile, exempt d’endotoxine.
- Diluer la solution gradient de densité dans un milieu x M199 10 (sans sérum) pour préparer la concentration de 10 % dans le milieu M199.
- Toutes les solutions filtrer sur un filtre à 0,22 µm.
Remarque : Les solutions mères peuvent être stockées à 4 oC dans l’obscurité pour n’est plus d’un mois. - Ajouter 2 mL de solution de médias gradient de densité 40 % dans le fond d’un tube à centrifuger conique de 15 mL.
- 2 mL de solution de médias gradient de densité de 10 % dans M199 sur le dessus de la couche de médias gradient de densité de 40 % de couche, soigneusement, à l’aide d’une pipette Pasteur afin d’éviter tout mélange entre les deux couches.
- Collecter 1 x 109 parasites de la culture de la phase stationnaire par centrifugation à 1 900 x g pendant 10 min.
- Remettre en suspension les cellules dans de 6 mL Dulbecco modifié essentiel (DMEM).
- Couche 2 mL de la suspension cellulaire directement sur le dessus de la densité de 10 % dégradé media layer, doucement, à l’aide d’une pipette Pasteur pour éviter le mélange entre les couches.
- Centrifuger le dégradé pendant 10 min à 1 300 g à la température ambiante.
Remarque : En raison de différences de propriétés physiques entre les espèces de Leishmania , conditions de centrifugation pour chacun pourraient avoir à être légèrement ajustée afin d’assurer un rendement maximal. - Recueillir des parasites (enrichis sous forme de promastigotes métacycliques) de la bande formée à la frontière entre le gradient médias haute densité de 10 % (interface entre les couches de médias de gradient de densité 0 % et 10 %).
- Diluer les parasites avec un volume de DMEM et recueillir par centrifugation (1 900 x g pendant 10 min à température ambiante).
- Remettre en suspension dans 500 µL de milieu DMEM et compter dans un hémocytomètre pour quantifier le rendement.
-
Génération de L. amazonensis amastigotes dans des conditions de culture axénique (faible pH / température élevée)6,8,13
- Mélanger 5 mL de la phase logarithmique promastigote culture (pH 7,4 à 26 oC) avec un volume égal d’amastigotes de milieu (pH 4,5), à l’aide de flacons de 25 cm2 (moyenne totale de 10 mL) et incuber pendant la nuit à 26 ° C.
- Passer le ballon entre 26 ° C à 32 ° C.
- Après 3 ou 4 jours, rompre la culture 1:5 dans médias amastigote à 32 ° C.
- Contrôler les parasites dans les 3-4 jours (maximum 7 jours) pour voir si ils sont prêt à être utilisé dans les infections.
NOTE : Amastigotes axéniques sain doit avoir une forme ovale, sans flagelles visibles. Les amastigotes partiellement différenciées ont une grande forme ovale avec des flagelles courts. La culture n’ait pas beaucoup de touffes - nombreuses touffes sont une indication de non croissance, parasites en train de mourir. La culture de l’amastigote peut être divisée 1:5 et maintenue pendant un maximum de 3 semaines.
4. l’infection par L. amazonensis
- Diluer les suspensions de parasite selon MOI désiré (habituellement promastigotes métacycliques de 3-5 par macrophage [MOI de 1:3 ou 1:5]) et 1 amastigote par macrophage [MOI 1:1]. Ajouter Leishmania dans du PBS- / - dans un volume de 50-100 µL à chaque puits contenant déjà 2 mL de milieu.
- BMMs Incuber 1 h avec amastigotes et 3 h avec promastigotes métacycliques à 34 oC pour l’infection.
Remarque : La température optimale de l’infection peut varier selon les espèces. - Après incubation, soigneusement laver libres parasites dans chaque bien 3 x avec 2 mL de PBS- / - pré chauffé à 37 ° C.
Remarque : Se dispersent PBS doucement pour s’assurer que les lamelles couvre-objet ne pas flotter sur l’autre. Agiter doucement la plaque et puis aspirer le liquide. Utiliser distinct embout aspiration si vous utilisez plusieurs souches de parasites afin d’éviter la contamination croisée. - Difficulté 1 h ou 3 h-point dans le temps des échantillons en incubant chacun bien avec 1,5 à 2 mL de 2 % PFA dans du PBS- / - pendant environ 10 minutes laver 3 x avec PBS- / -. Ne pas aspirer le dernier lavage et réfrigérer les plaques contenant des lamelles dans du PBS jusqu'à coloration.
- Ajouter un milieu frais BMM 2 mL dans chaque cupule sur plaques pour davantage de temps-points et incuber à 34 ° C.
- Difficulté des temps-points restants comme souhaité comme indiqué au point 4.3 et réfrigérez plaques jusqu'à coloration.
5. le DAPI coloration et montage de la lamelle couvre-objet
- Aspirer les PBS de puits contenant des lamelles et ajouter 1,5 mL de PBS- / - avec 0,1 % de détergent non ionique. Incuber pendant 10 min à température ambiante, suivie de lavage x 3 avec 2 mL de PBS- / -.
- Ajouter 1 mL de PBS- / - 2 µg/ml DAPI (dilué de 5 mg/mL de solution dans l’eau) dans les puits contenant des lamelles couvre-objet et incuber pendant encore 1 h à température ambiante.
Remarque : Le temps d’incubation au DAPI est essentiel pour la bonne visualisation de Leishmania intracellulaire . Noyaux de macrophage teinté rapidement, en raison de leur plus grande taille et l’ADN contenu mais la coloration des noyaux des parasites intracellulaires est plus lent. Ainsi, prolongeant la durée d’incubation au-delà de ce qui est nécessaire pour visualiser les noyaux BMM est nécessaire pour permettre au DAPI de pénétrer à travers et la parasite de la membrane plasmique et la membrane nucléaire de parasite. Avec la bonne coloration DAPI, le kinétoplaste mitochondrial DNA près de la poche flagellaire du parasite peut aussi être visualisé, en plus de l’ADN nucléaire. - Lavez chaque puits contenant des lamelles 3 x avec 2 mL de PBS- / - et puis soulevez-le et clapet lamelles couvre-objet avec une pince pour placer le côté de la cellule vers le bas et monter sur verre microscope slides avec un réactif de montage antifade commercialement disponibles.
NOTE : Lamelles sont extrêmement fragiles et ont besoin de manipulation prudente. Éviter de mettre la pression sur eux, en particulier contre le flanc des puits lors du levage. Ajouter quelques gouttes de PBS- / - réduit la tension superficielle entre la lamelle et bien et facilite le processus de levage. Une aiguille fine jauge peut servir à aider à écarter les lamelles du fond du puits. Après avoir placé un lamelle couvre-objet sur la diapositive, appuyer doucement avec une pince pour faire sortir les bulles d’air dans les supports de montage. Si un lamelle couvre-objet est cassé ou a peut-être renversé pendant le processus de levage, remonter pas ; Il suffit d’utiliser la rechange lamelle quatrième. - Réfrigérer diapositives jusqu’au dosage.
6. infection Quantification
- Examiner les lames DAPI sous un microscope à fluorescence en mettant l’accent sur les macrophages à l’aide de lentille d’objectif X 100 avec de l’huile d’immersion (excitation à 358 nm ; émission optimale à 461 nm).
Veiller à ce que l’accent est sur la couche des macrophages entre la lame et lamelle. - Quantifier le nombre de macrophages (gros noyaux colorés au DAPI) et le nombre de plus petits noyaux amastigote groupés autour de chaque noyau de macrophages (voir la Figure 2 a, DAPI) pour chaque champ de vision, en utilisant un compteur manuel.
Remarque : Les noyaux Amastigote seront peut-être pas tous visibles dans un seul plan d’activité en raison de leur petite taille. Compter ceux qui sont visibles lorsque centrée sur le noyau de macrophages et puis utilisez mise au point fine pour vérifier les noyaux de parasite dans les avions au-dessus et en dessous les noyaux de macrophage. - Déplacer vers un autre champ de vision de répéter la quantification. Utiliser une clé séparée compteur pour suivre le nombre de champs comptés. Par le biais de champs visuels en rangées parallèles traversent chaque lamelle, pour empêcher chevauchement de comptage.
- Quantifier un minimum de 200 macrophages par lamelle couvre-objet. Quantifier à chaque instant de l’infection en trois exemplaires (3 lamelles). Compter la lamelle quatrième si l’un des précédents n’est pas approprié pour le comptage en raison de la lamelle couvre-objet chevauchement, mauvais montage, bris de verre, etc.
Remarque : Si 200 macrophages ne peuvent pas compter sur toute une lamelle couvre-objet, compter la roue de secours à la quatrième. - Calculer le taux d’infection comme les macrophages amastigotes/macrophage ou amastigotes/100 et déterminer le pourcentage des macrophages infectés des données brutes de quantification.
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Representative Results
Leishmania a deux formes infectantes - promastigotes métacycliques qui différencient des promastigotes procycliques à la phase stationnaire de la culture et les amastigotes, qui sont les stades intracellulaires (Figure 1). Chez certaines espèces de Leishmania comme L. amazonensis, amastigotes peuvent également être différenciés en culture axénique en déplaçant les cellules promastigote pour abaisser le pH (4.5) et des températures élevées (32 ° C), des conditions similaires à celles que l'on trouve à l’intérieur du BMM PVs 8 , 34. seulement métacycliques formes promastigote ou amastigotes de Leishmania sont capables d’induire la formation de PVs et répliquer intracellulairement après être englouti par le hôte macrophages35. Indifférenciées phase logarithmique promastigotes sont non virulentes et incapables de promouvoir la formation PV (Figure 2).
Dans le cas d’infections avec promastigotes métacycliques, il y a généralement un délai de 24h avant l’augmentation du nombre de parasite intracellulaire. Cela se produit car les promastigotes métacycliques ont les premiers à se différencier en amastigotes avant de commencer la réplication. Pour cette raison, les infections initiées avec promastigotes métacycliques prendra plus de temps à une augmentation du nombre total de parasite intracellulaire et pour cette raison, peuvent devoir être incubées pendant de plus longs moments.
Figure 2 a représente une infection réussie à l’aide de conditions axéniques différenciées amastigotes, montrant la localisation intracellulaire de Leishmania (en rouge) après l’infection initiale (1 h), avant la formation de PVs par fusion des phagosomes avec lysosomes. Après 48 h, des PVs grands distinctes hébergeant plusieurs parasites peuvent être observés. Une augmentation constante du nombre de parasites à l’intérieur de PVs est caractéristique des infections virulentes de Leishmania . Phase logarithmique non virulentes promastigotes (Figure 2 b), en revanche, sont incapables d’initier le développement de PV (point de temps de 48 h), ne parviennent pas à répliquer et sont finalement tués à l’intérieur de macrophages de l’hôte, même si absorbés par les macrophages de l’hôte à des nombres comparables les promastigotes métacycliques ou amastigotes.
Pour démontrer l’efficacité de cette méthode, nous avons comparé la sauvage, L. amazonensis avec LMIT1/ΔLmit1 parasites contenant une seule copie de la LMIT1 (Leishmania Mitochondrial Iron T ransporter 1) gène, qui se traduit par l’insuffisance de fer mitochondrial importer13. Perte d’un allèle LMIT1 n’a pas entraîner des modifications importantes de l’activité mitochondriale en promastigotes LMIT1/ΔLmit1 ou réduisent le rendement des formes métacycliques purifiées par rapport au type sauvage promastigotes13. Les promastigotes métacycliques purifiés de type sauvage (WT) et LMIT1/ΔLmit1 cultures stationnaires sont également efficaces dans l’invasion BMMs, basées sur le nombre comparable des parasites intracellulaires quantifié 1 h après l’infection ( Figure 3 a, 1 h). Suite à un décalage dans le temps initial de 24h, qui est requis pour les promastigotes métacycliques d’adapter et de se différencier en forme amastigote, une constante augmentation du nombre des parasites intracellulaires de type sauvage (environ 3 fois entre 24h et 72 h temps) a été observée. En revanche, peu ou pas de croissance intracellulaire des parasites LMIT1/ΔLmit1 (comparer des points de temps 1 h et 72 h) a été observée, ce qui suggère que la perte du seul allèle LMIT1 affecte significativement la capacité de cette souche à pousser à l’intérieur macrophages. Épisomiques expression de la protéine de LMIT1 chez la souche complémentée (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) a sauvé la croissance du parasite intracellulaire à des niveaux de type sauvage, confirmant que la LMIT1 est critique pour les amastigotes intracellulaires 13la réplication et la virulence.
Infection des macrophages réalisée avec des amastigotes axéniques, générées en déplaçant le promastigote cultures (à un pH de 7,4 ; 26 oC) à des conditions de croissance amastigotes (pH 4,5 ; 32 oC)34,36, a montré une croissance intracellulaire schéma (Figure 3 b) similaire à celle observée avec les promastigotes métacycliques (Figure 3 a). Suite à des niveaux comparables de captation initiale (Figure 3 b, 1 h) type sauvage (WT) et LMIT1 (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) amastigotes a augmenté régulièrement, tout en amastigotes LMIT1/ΔLmit1 nouveau Impossible d’afficher une croissance intracellulaire. Amastigotes axéniques ont été plus infectieux (MOI 1:1 contre 1:5 pour promastigotes métacycliques) et reproduit plus efficacement à l’intérieur de PVs.
Nos résultats démontrent un retard initial de 24h pour les infections promastigotes métacycliques, avant il y a une augmentation en nombre parasite intracellulaire (comparaison entre des points de temps de 24h dans la Figure 3 a et 3 b). Le décalage est le délai nécessaire pour intériorisée promastigotes métacycliques tout d’abord différencier en amastigotes avant de commencer à se répliquer. Un peuple erreur prendre lorsque vous l’utilisez promastigotes métacycliques à infecter, n’est pas attendre assez longtemps. Dans les cas où le changement dans la virulence n’est pas radical, les expériences menées sur une période de 96 h plutôt que 72 h produire des décisions beaucoup plus fiables.
Figure 1 : Balayage Micrographie électronique des images de différents stades L. amazonensis . Promastigote phase logarithmique, promastigotes métacycliques de phase stationnaire et axénique amastigote. Bar = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Une illustration représentante d’infection virulente amastigotes axéniques (A) et la phase logarithmique non virulentes promastigotes (B) de L. amazonensisBMM. Images d’immunofluorescence des macrophages isolés de souris BALB/c , 1 h et 48 h après l’infection. Macrophages infectés ont été traitées pour l’immunofluorescence, tel que décrit dans le protocole. Membranes PV ont été colorées avec des anticorps monoclonaux rat anti-souris Lamp1 (1:1, 000 dilution) pendant 1 h, suivie de 1 h d’incubation avec anti-lapin fluorescent IgG (dilution 1/500). Une coloration parasite a été réalisée en incubant des lamelles couvre-objet avec des anticorps polyclonaux de souris générés contre axéniques L. amazonensis amastigotes, suivis par red IgG anti-souris teindre (dilution 1/500) 6. Toutes les lamelles ont été plus traités au DAPI pour la coloration des noyaux. (A) formation de PVs distinctes hébergeant plusieurs amastigotes au point de temps de 48 h est caractéristique d’une infection de Leishmania réussie avec les amastigotes axéniques. (B) l’absence de formation PV distinct et reproduisant les amastigotes au point de temps de 48 h est typique de manque de virulence chez les promastigotes de culture phase logarithmique. Rouge indique -Leishmania coloration, vert indique anti-Lamp1, bleu indique ADN colorés au DAPI et jaune indique la fusion d’anti-Lamp1 et taches DAPI. Bars, 5 µm. Ce chiffre a été modifié par Mittra, b. et coll., 2013. Article publié dans J. exp. Med. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Suppression d’un allèle LMIT1 altère gravement la croissance intracellulaire de mutants parasites de LMIT1/Δlmit1 . BMM étaient infectées de l’indiqués fois avec L.amazonensis et sont fixées immédiatement ou encore incubé pendant 24, 48 ou 72 h avant ils ont été résolus, colorées au DAPI, et le nombre de parasites intracellulaires a été déterminé au microscope. (A) BMMs étaient infectés par purifiée sauvage (WT), seul knockout (LMIT1/Δlmit1) et complété seul knockout (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) promastigotes métacycliques (MOI 1:5) pour 3 h et fixé immédiatement ou incubées supplémentaires pour les points de l’heure indiquée et le nombre de parasites intracellulaires a été déterminée au microscope. Les données représentent la moyenne ± écart-type des déterminations en triple et sont représentatifs des résultats de trois expériences indépendantes. Les astérisques indiquent des différences significatives dans l’infectivité entre parasites WT et LMIT1/Δlmit1 (à deux t - de l’étudianttest 48 h, p = 0,017 ; 72 h, p = 0,008). (B) les amastigotes axéniques de type sauvage (WT), seul knockout (LMIT1/Δlmit1) et cultures complétée knockout unique (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) ont été testés pour leur capacité à infecter BMMs. BMMs étaient infectées pour 1 h (MOI 1:1) et soit fixée immédiatement (1 h) ou après une incubation pendant 24, 48 ou 72 h et le nombre de parasites intracellulaires a été déterminée au microscope. Les données représentent la moyenne ± écart-type des déterminations en triple et sont représentatifs de plus de trois expériences indépendantes. Valeurs de P (test de Student bilatéral t) entre les groupes respectifs sont indiqués. Ce chiffre a été modifié par Mittra, b. et coll., 2016. Article publié dans PloS pathognomo. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les données quantitatives produites par l’essai d’infection BMM décrit ci-dessus, permet aux enquêteurs d’obtenir des taux d’infection et une détermination fiable des changements dans les propriétés de virulence dans un laps de temps relativement court (maximum 2 semaines, par rapport à la 2 mois nécessaires pour des expériences in vivo ). Cette méthode s’appuie sur le colorant spécifique de l’ADN DAPI, qui précisément les taches noyaux macrophage et parasite et permet une identification rapide et la quantification des cellules infectées. En comparaison, autres taches comme le Giemsa lient à un grand nombre de composants cellulaires différents avec une intensité variable, ce qui complique l’analyse visuelle,37. L’utilisation du DAPI permet la reconnaissance des parasites intracellulaires et leur distinction claire de cellulaire structures (seulement les noyaux des cellules de l’hôte sont également colorées, et leur taille est de plusieurs ordres de grandeur plus grands que les noyaux de parasite), ce qui permet plus facilement et rapidement quantification des infections.
Comme pour toute procédure expérimentale, cette méthode a quelques limitations et plusieurs étapes critiques qui exigent une exécution minutieuse. In vivo Leishmania infection implique complexe réponse immunitaire innée avant la phagocytose, qui détermine le cours ultime de l’infection,38. Choix de la souche de souris modèle, est donc d’une importance capitale dans la conception de l’étude. Souche de souris des C57BL/6 et BALB/c utilisée dans ce protocole ours des mutations dans le gène codant la protéine naturel macrophages associées à la résistance (Nramp1), une pompe d’efflux de protons qui translocation Fe2 + et Mn2 + ions de macrophage lysosomes/phagolysosomes dans le cytosol. Cela se traduit par une susceptibilité accrue aux agents pathogènes qui reproduisent à l’intérieur du compartiment endocytose macrophages8,30,31. Colonisation réussie dans les macrophages dépend aussi de la capacité unique de Leishmania infectieux pour manipuler la réponse immunitaire pour supprimer/survivre macrophage activation39,40. Les macrophages différenciés utilisés pour Leishmania BMM infections un peu imitent l’état non-activé de macrophages in vivo, mais l’analyse ne tient pas compte pour le jeu beaucoup plus complex de composants hôte qui influencent la virulence dans modèles animaux.
Isolement des formes de leishmaniose infectieux sains est l’autre exigence absolument essentiel pour la détermination de la virulence précis. Pas tous les promastigotes de toutes les souches de Leishmania différencier efficacement en amastigotes lorsqu’ils sont soumis à un faible pH / haute température conditions41. Par conséquent, les infections sont souvent réalisées avec les promastigotes métacycliques purifiées à partir de cultures promastigote stationnaire. Pour isoler efficacement les promastigotes métacycliques, certaines stratégies de purification tirer parti de la composition changeante de la glycocalice surface du parasite au cours des différents stades de vie, y compris des modifications importantes de la lipophosphoglycan (LPG) structure42,43,44. Par exemple, agglutinine d’arachide (PNA), une lectine qui se lie sélectivement au procycliques mais pas métacyclique LPG a été utilisé efficacement dans les protocoles de sélection négative pour purifier L. major promastigotes métacycliques45. Stratégie de purification des promastigotes métacycliques pour L. amazonensis implique généralement un mAb3A.1 d’un anticorps monoclonal qui peut agglutiner les promastigotes procycliques en ciblant les épitopes de la protéine de surface spécifique qui sont inaccessibles en métacyclique formes en raison de modifications de surface glycocalyx8,13,32. L’utilisation d’un média gradient de densité pour séparer les promastigotes métacycliques promastigotes basés sur scène des différences dans la densité de flottaison est une méthode intéressante car elle ne dépend pas des variations propres à chaque espèce de ligands surface parasite. Cette méthode, initialement décrite par L. major promastigotes métacycliques purification33, a été adoptée avec succès pour plusieurs autres espèces de Leishmania principalement par le biais de modifications des conditions de centrifugation pendant sédimentation de gradient de densité46,47,48,49.
Il est également important d’être conscient des problèmes qui peuvent compliquer la mise en œuvre de l’analyse, qui peut se produire à plusieurs étapes du processus. Ces problèmes peuvent inclure la contamination pendant l’essorage BMM, différenciation infructueuse de BMMs après extraction, électrodéposition de macrophage incompatible, purification incomplète des formes de parasites infectieux infection pauvre ou incompatible, et difficultés de montage des lamelles de verre sur lames de microscope. Ces possibilités ont été abordées dans le protocole et peuvent être résolues en évaluant soigneusement chaque étape de la procédure de l’infection pour identifier le problème. Par exemple, la contamination des cultures BMM au cours du processus de différenciation peut indiquer un besoin d’amélioration technique stérile pendant l’essorage. Une attention particulière à la pureté et la fraîcheur des réactifs de purification et précise mise en œuvre du protocole de purification peut rectifier la purification infructueuse ou incomplète des formes parasite désirée. Infections pauvres ou incompatibles peuvent être dus inexacte quantification des parasites ou un MOI qui est trop élevée ou trop basse pour les conditions expérimentales spécifiques. Après l’extraction, de manipuler et de fixation du couvre-objet en verre sont sans doute le plus techniquement difficile processus dans cette technique ; les particuliers peuvent trouver qu'ils préfèrent utiliser différents outils pour faciliter la manipulation des lamelles. Visualisation claire de DAPI teinté de noyaux est critique pour le parasite précise comptage au microscope. Coloration pâle et une mauvaise mise au point sont les deux principaux coupables derrière quantification incompatible. Cela peut être assurée par le contrôle de la qualité du DAPI étape de coloration, limiter le temps d’exposition à la lumière pour réduire le blanchiment photo et changer rapidement la mise au point objective pour tenir compte de tous les noyaux de parasite dans le domaine. Luminosité de fluorescence DAPI peut également être améliorée en assurant la bonne perméabilisation des échantillons avec un détergent et en augmentant la concentration de DAPI pendant la coloration. Une autre approche qui peut faciliter le processus de quantification est d’obtenir des images numériques des échantillons au cours de l’examen microscopique. Les images peuvent être utilisés pour la quantification à une date ultérieure et peuvent être vérifié/quantifié par des chercheurs indépendants. Cependant, il y a des difficultés techniques associées à ce processus qui nécessite un examen attentif. En raison de la nature sphérique de la PV, les parasites ne sont pas toujours sur le même plan focal. Cela nécessite que plusieurs images soient recueillies à l’aide des plans focaux différents pour chaque champ microscopique et assemblés par la suite pour tenir compte de tous les parasites. Dans le cas contraire, la quantification des photographies peut être très trompeuse. Calculs des macrophages/champ et amastigotes/champ sont essentiels pour s’assurer que les macrophages cohérent d’électrodéposition et la propagation des parasites a été atteint au cours de l’infection. BMMs étant complètement différenciées des cellules, leur nombre ne devrait pas augmenter au fil du temps. Si le nombre de macrophages de l’hôte augmente au fil du temps, cela signifie que les macrophages sont encore immatures. Dans ce cas, la source et la concentration de la M-CSF doivent être vérifiées. Détermination du pourcentage macrophages infectés peut également être utile en fournissant un aperçu complet de l’hôte l’interaction cellule-pathogène, notamment dans les cas où la charge pourcentage de maladies infectieuses et parasites ne suivent pas similaires tendances20,21 .
La méthode de l’infection in vitro BMM détaillée ici peut-être être modifiée en fonction des besoins expérimentaux spécifiques. Modifications peuvent être apportées à l’une des étapes fondamentales du processus - extraction de BMM et la différenciation, la purification des formes de parasites infectieux et la quantification des infections de macrophages in vitro , ainsi que des infections d’application avec différents MOIs et en ajustant la période d’infection et de points dans le temps analysé. Composants de milieux de culture peuvent être facilement modifiées par supplémentation ou épuisement des nutriments spécifiques, et plusieurs souches différentes ou formes de parasites peuvent être évalués simultanément. Ces modifications peuvent nécessiter un ajustement supplémentaire de procédés techniques ; par exemple, procédures de préparation de l’amastigote et promastigotes métacycliques purification devraient varier entre différentes espèces de Leishmania . Fluorescentes additionnelles colorants outre DAPI ou fluorescent étiquetés composants cellulaires peuvent être utilisées pour visualiser une gamme complète de hôte-parasite interaction des processus6,24. En outre, ce test peut être adapté à un format haut débit systèmes (HTS), ce qui permettrait d’identifier les fils de médicaments nouveaux et efficaces pour le traitement de la leishmaniose24pour le dépistage rapide des banques de composés.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes,
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de la subvention RO1 AI067979 de la santé à RNF.
YK est récipiendaire de la bourse de premier cycle de l’Howard Hughes Medical Institute de l’Université du Maryland à College Park.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
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