Summary
Alla patogena Leishmania arter uppehålla och replikera inuti makrofager av deras ryggradsdjur värdar. Här presenterar vi ett protokoll för att infektera murina benmärg-derived makrofager i kultur med Leishmania, följt av exakt kvantifiering av intracellulära tillväxt kinetik. Denna metod är användbar för att studera enskilda faktorer som påverkar värd-patogen interaktion och Leishmania virulens.
Abstract
Livscykeln för Leishmania, vilka smittämnen av leishmaniasis, växlar mellan promastigote och amastigote stadier inuti insekten och ryggradsdjur värdar, respektive. Medan patogena symtom av leishmaniasis kan variera kraftigt, från godartade kutana lesioner mycket dödlig visceral sjukdom former beroende på de smittbärande arterna, finnas alla Leishmania arter inuti värd makrofager under ryggradsdjur deras livscykel. Leishmania smittsamhet är därför direkt relaterad till dess förmåga att invadera, överleva och replikera inom parasitophorous vakuoler (PVs) inuti makrofager. Således fungerar att bedöma parasitens möjlighet att replikera intracellulärt som en pålitlig metod för att bestämma virulens. Att studera leishmaniasis utveckling med hjälp av djurmodeller är tidskrävande, tråkiga och ofta svårt, särskilt med pathogenically viktigt viscerala former. Här beskriver vi en metod för att följa intracellulära utvecklingen av Leishmania i benmärgen-derived makrofager (BMMs). Intracellulär parasit nummer bestäms vid 24 h intervall för 72-96 timmar efter infektion. Denna metod möjliggör en tillförlitlig bestämning av effekterna av olika genetiska faktorer på Leishmania virulens. Som ett exempel visar vi hur en enda allel borttagning av Leishmania mitokondriell järn transportör genen (LMIT1) försämrar den Leishmania amazonensis mutant stammen LMIT1/ΔLmit1 förmåga att växa inuti BMMs, återspeglar en drastisk minskning i virulens jämfört med vildtyp. Denna analys kan också exakt kontroll av experimentella betingelser, som individuellt kan manipuleras för att analysera påverkan av olika faktorer (näringsämnen, reaktiva syreradikaler, osv.) på värd-patogen interaktionen. Därför ger lämpligt genomförande och kvantifiering av BMM infektion studier en icke-invasiv, snabb, ekonomisk, säker och tillförlitlig alternativ till konventionella djurmodell studier.
Introduction
Leishmaniasis refererar till ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar orsakade av protozo parasitarter av släktet Leishmania. Cirka 12 miljoner människor är för närvarande infekterade med Leishmania världen över, och mer än 350 miljoner är i riskzonen. Sjukdom patologi beror på arterna som Leishmania och värd faktorer och symtom varierar från innocuous självläkande hudlesioner dödliga visceralizing former. Om obehandlat, visceral leishmaniasis är dödlig, förmånsrätt endast efter malaria som den dödligaste mänskliga sjukdomen orsakas av infektion med en protozo parasit1. Trots omfattande skillnaderna i sjukdom patologi och symtom har alla Leishmania arter en digenic livscykel alternerande mellan promastigote och amastigote stadier inuti insekter och ryggradsdjur värdar, respektive. Insidan ryggradsdjur, Leishmania target host makrofager för invasion och inducera bildandet av parasitophorous vakuoler (PVs), sura fack med egenskaperna hos phagolysosomes där de mycket virulent amastigote formerna replikera. Amastigotes kvarstår i värd vävnader under kroniska infektioner och kan föras framåt till oinfekterade sandflugor, slutföra överföringen cykeln. Därför, i samband med mänsklig sjukdomsutveckling, amastigotes är den viktigaste Leishmania lifecycle form2. Undersöka hur amastigotes replikera inuti makrofag PVs är kritisk för förståelse Leishmania virulens3,4,5,6,7 och för den utvecklingen av nya effektiva behandlingar.
Här beskriver vi en metod som används regelbundet av vårt laboratorium för att studera Leishmania -infektion och replikering i benmärgen-derived makrofager (BMMs), som innebär kvantitativ bedömning av numrera av intracellulära Leishmania över tid. Processen omfattar skörd av monocyter från mus benmärg och differentiering till makrofager i kultur, in vitro- infektion med infektiös former (metacyclic promastigotes eller amastigotes) av Leishmania och kvantifiering av de antal intracellulära parasiter på varje 24 h intervall under en 72-96 timmar efter infektion. Denna analys har använts i vårt laboratorium för att avgöra inverkan av flera miljöfaktorer och parasit gener, inklusive identifiering av järn kritiska roll att främja L. amazonensis virulens som ytterligare godkänts av footpad lesion utvecklingsstudier möss6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Eftersom alla patogena Leishmania arter etablera sin replikationsförmåga nisch inne värd makrofager, kan denna analys användas universellt för virulens bestämningar i alla Leishmania arter.
Utför BMM infektioner möjliggör analys av värd-parasit interaktioner på enstaka cellnivå, och därmed en mer omfattande förståelse för hur Leishmania parasiter interagerar med deras föredragna värden mikromiljö, PVs av makrofager. Makrofag infektion analyser har använts framgångsrikt av flera grupper16,17,18,19,20,21,22 att utforska funktioner i både värd makrofag Leishmania specifika gener och deras potentiella deltagande i det komplexa samspelet som kännetecknar intracellulära infektion. BMM infektioner möjliggöra kvantifiering av parasiten tillväxt som en avläsning av värd faktorer som påverka intracellulär överlevnad, såsom microbicidal kväveoxid produktion, generation av reaktiva syreradikaler och andra ogynnsamma effekter påträffade inuti den Lysosomen-liknande PVs23. Makrofag infektion analyser har också använts för att identifiera potentiella anti-leishmanial drug leads för terapeutisk utveckling13,24.
In vitro- beskaffenhet BMM infektioner ger flera fördelar jämfört med andra metoder för att bedöma Leishmania virulens. Flera tidigare studier att undersöka mekanismer för intracellulär parasit överlevnad över tid dock inte kvantifiera infektion som en kurs20,21,24. Dessutom gjorde många studier fokuserat på följande i vivo infektioner med tiden så genom att mäta kutan lesionsstorlek och andra fysiologiska symtom som endast indirekt avser parasit replikering25,26 , 27. in vivo -infektion är en stränga metod att bedöma parasit virulens, men lesionens storlek mätningar baserat på footpad svullnad ensam är ofta otillräckliga, eftersom de återspeglar den inflammatoriska reaktionen i infekterade vävnader och inte den absoluta antalet parasiter. Av denna anledning, footpad lesion utveckling analyser måste följas av kvantifiering av parasiten lasten i infekterade vävnader, analyser en procedur som kräver långa begränsande utspädning28. Dessutom, innebär in-vivo studier ofta att offra flera djur vid olika punkter i tiden för att extrahera vävnader av intresse6,8,9,10, 11 , 13. däremot stort antal BMMs kan erhållas från bara ett djur, och dessa celler kan beläggas under förhållanden som gör bedömningen av infektion på olika punkter i tiden. Dessutom tillåter utför in vitro- BMM infektioner jämfört med in-vivo studier, större kontroll över försöksbetingelser. Kvantifiera den makrofager att smittas tillsammans med parasiterna själva tillåter exakt kontroll av multiplicityen av infektion (MOI) och odlingsbetingelser. Fina kontroll över dessa faktorer kan vara avgörande att identifiera kännetecken för diskreta cellulära vägar och förstå deras inverkan på loppet av infektion.
Med tanke på dessa fördelar, är det något förvånande att mycket få grupper studerar Leishmania virulens hittills har tagit full nytta av kvantitativ bedömning av intracellulär replikering i makrofager. I den här artikeln diskuterar vi vanliga fallgropar som kan vara hämmar mer omfattande utnyttjande av denna analys, och tillhandahålla ett stegvisa protokoll för att underlätta genomförs korrekt. Med tanke på dess precision och mångsidighet, BMM infektion analysen beskriver vi här kan inte bara utnyttjas att utforska värd-patogen interaktioner påverkar Leishmania virulens, men också att studera andra mikroorganismer som replikerar inuti makrofager29. Viktigast av allt, kan denna analys också utvecklas som en snabb och ekonomisk prekliniska screeningmetod för anti-leishmanial läkemedelsutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner genomfördes i enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av laboratoriedjur av National Institutes of Health och godkändes av University of Maryland's IACUC. Alla steg som beskrivs i avsnitt 1 till 4 bör utföras aseptiskt inuti biologiska laminär skåp. Personligt skydd bör användas, och försiktighet bör iakttas vid hantering av levande Leishmania parasiter genom alla skeden av experimenterande.
1. isolering och differentiering av benmärgen-derived makrofager (BMMs)8,30,31
- Dag 0: Offra 4 - 6 veckor gamla kvinnliga C57BL/6 eller BALB/c mus i en CO2 kammare och bekräfta död via cervikal dislokation. Se till sterilisering av sax och pincett genom att hålla dem indränkt i 70% etanol. Spray handskar med 70% etanol att tillåta steril hantering genom hela benmärgen cell isolering.
- Säkra offrade mus dissekering styrelsen genom att fästa dess framben och desinficera genom att Spraya rikligt med 70% etanol.
- Göra ett litet snitt (ca 1 cm) med sax nära höftleden. Sätt försiktigt sax under huden att separera den underliggande muskeln och skära huden hela vägen runt höftleden.
Obs: Dissekering styrelsen kan roteras för att ge förbättrad tillgång till höftleden. - Noggrant deglove hud från benet genom att dra mot fotleden och ta bort. Avskurna foten vid vristen, vara mycket noga med att skära vid eller under ankeln gemensamma lämna skenbenet helt intakt.
Obs: Fibula i detta skede sitter löst och lätt kan separeras med hjälp av tången. - Hitta manuellt höftleden genom att manipulera lårbenet för att identifiera punkten av rotation. Försiktigt använda sax för att bryta benet ovanför höftleden lämna proximala huvudet av lårbenet intakt.
- Ta bort så mycket muskler och bindväv som möjligt från benet med sax. Ta bort alla återstående hud från fotleden och eventuella överskjutande benmaterial ovanför höftleden.
- Placera de rengjorda ben ben i sterila RPMI kompletteras med penicillin/streptomycin (slutliga koncentration av 1%) i en petriskål på is.
- Upprepa steg 1.4 genom 1.6 att isolera skenbenet och lårbenet från den andra bakben.
- Ta bort alla återstående muskler och bindväv från Ben blötläggning i RPMI använder steriliserad pincett och sterila #10 blad.
- Placera ben på petriskål locket. Skär skenbenet försiktigt med bladet omedelbart ovanför fotleden att komma åt märgen. Ta bort skenbenet från resten av benet genom att skära omedelbart nedanför knäleden.
- Rita 10 mL steril RPMI kompletteras med penicillin/streptomycin (slutliga koncentration av 1%) i en 10 mL-spruta och bifoga en 25G nål.
- Håll skenbenet ordentligt med pincett, vertikalt över en 50 mL konisk slang på is. Använd sprutan för att injicera försiktigt cirka 5 mL RPMI i slutet av benet att spola benmärgen ur den andra änden i koniska röret. Skölj benmärgen med sammanlagt 10 mL RPMI tills benet blir vit.
Obs: Efter grundlig spolning, benet bör vända vitt. Om inte, Fortsätt spolning för att ta bort märg. Den distala änden av skenbenet kan behöva beskäras tillbaka med bladet om det är för smal för att nålen. - Skär lårbenet omedelbart ovanför knäleden och omedelbart nedanför höftleden att exponera båda ändarna av benet att komma åt märgen. Spola benmärg från lårbenet med sammanlagt 10 mL RPMI på samma sätt som skenbenet.
- Upprepa rengöring och spolning steg 1,6 via 1.13 med återstående benen och samla spolas benmärgsceller i ett enda 50 mL koniska rör
Obs: Om ett ben går sönder när som helst under dissektion innan ben spolning, Använd inte märgen från detta ben. - Centrifugera koniska röret används för att samla benmärgen spolas från alla fyra ben för 10 minuter vid 4 ° C vid 300 x g.
- Placera 60 mL steril BMM medium (RPMI med en slutlig koncentration av 20% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1,2 mM Na-pyruvat, 25 µg/mL humant M-CSF) i en 175 cm2 cell kultur kolv med filterkåpan.
- Kassera den supernatant efter centrifugeringen och resuspendera cellpelleten av milda upp och ner pipettering med 5 mL av BMM medium från kolven.
- Överföra cellsuspension till kultur kolven och skölj den koniska rör två gånger med BMM medium från kultur kolven att säkerställa maximal cell återhämtning. Säkerställa cellsuspension blandas då grundligt till medium och distribuera 30 mL från inledande 175 cm2 cell kultur kolven till en andra 175 cm2 cell kultur kolv med filterkåpan.
- Inkubera båda kolvarna som innehåller 30 mL cellsuspension varje övernattning vid 37 ° C, 5% CO2 att tillåta separation av eventuella kontaminerande fibroblaster, bosatta makrofager och andra fastsittande celler.
- Dag 1: Överför supernatanten innehållande odifferentierade benmärgsceller från kolvar till 100 x 15 mm icke-TC-behandlade av polystyren petriskålar för cirka 10 ml/skålen och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2. Kassera kolvar.
- Dag 3 eller 4: Lägga till ett ytterligare 5 mL BMM medium (pre värmas till 37 ° C) i varje petriskål och fortsätta inkubation vid 37 ° C, 5% CO2.
2. plätering BMMs på Coverslips för infektion (dag 7 eller 8)
- Laga 6-väl vävnadsodling plattor genom att placera fyra (4) steril 12 mm glas coverslips (autoklaveras och lagras i en sluten glasbehållare) i botten av varje tom väl.
Obs: Plocka varje sterila 12 mm täckglas upp med en utvärderingsenheten spets monterade på en vakuum linje. Placera coverslips i brunnar utan överlappning, släppa på önskad position genom att nypa röret för att avbryta vakuum. - Aspirera media (och icke-anhängare celler) från petriskålar belagd med vidhäftande benmärgen härrör makrofager och försiktigt skölj anhängare celler 2 x med steril Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning utan kalcium och magnesium klorid (PBS- / -) före värmde till 37 ° C.
- Tillsätt droppvis 5 mL steril 1 x PBS- / - med en slutlig koncentration på 1 mM EDTA till varje petriskål och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C att lösgöra anhängare BMMs. Verifiera att cellerna är fristående med Mikroskop.
- Samla alla fristående celler upphängd i 1 x PBS- / - kompletteras med 1 mM EDTA i en 50 mL konisk tub. Skölj varje maträtt 2 x 5 ml PBS- / - och Lägg till cell suspension pool.
Obs: Cellsuspension kan spädas med ytterligare PBS- / - att skydda makrofager från EDTA toxicitet under inkassoprocessen. - Centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera makrofager i 5-10 mL BMM medium genom pipettering. Plats resuspended celler på is för att förhindra bilaga till rören och klumpar.
- Räkna viabla celler med Trypan blå utslagning i hemocytometer.
Obs: För att räkna BMM celler resuspended i 5 mL medium, en utspädning-mix av 25 µL cellsuspension i 445 µL PBS- /- och 30 µL 0,4% Trypan blå lösning vanligtvis tillåter enkel kvantifiering i en hemocytometer (med hänsyn till en 20 x utspädningsfaktorn för den slutliga beräkningen ). Räkna endast celler som inte få färgas med Trypan blå (viabla celler). Volymen av cellsuspensionen får ändras om denna blandning är alltför koncentrerad eller utspädd. I allmänhet varierar avkastningen av BMM per förberedelse mellan 2 x 107 och 5 x 107 celler från ett enda musklick. - Förbereda cellsuspensionen i BMM medium vid önskad plätering koncentration (5 x 105/ml) och sprida suspensionen till 6 plattor i 2 mL medium per brunn så att var och en får väl 1 x 106 makrofager.
Obs: Detta är ett kritiskt steg som garanterar varje väl blir det tillräckligt antalet makrofager att täcka coverslips jämnt. Kontrollera att coverslips i brunnar inte är överlappande eller flytande medium. I så fall justera försiktigt med en steril pipettspetsen. - Inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO2.
3. rening av infektiös former av L. amazonensis
Obs: Förbereda Leishmania för infektioner - rena metacyclic promastigotes från stationära promastigote kulturer8,13, eller skilja promastigotes i kulturen i amastigote form med hjälp av standard L. amazonensis axenic differentiering protokoll6,8.
-
Rening av Leishmania metacyclic promastigotes med täthet lutning media(Materials) 33
- Förbereda 40% stamlösning av täthet lutning media i sterila endotoxinfria vatten.
- Späd täthet lutning lösning i 10 x M199 medium (utan serum) för att förbereda M199 medium koncentration på 10%.
- Filtrera alla lösningar genom 0,22 µm filter.
Obs: Lager lösningar kan lagras på 4 oC i mörker längre än 1 månad. - Tillsätt 2 mL av 40% täthet lutning media lösning i botten av en 15 mL koniskt centrifugrör.
- Lager 2 mL 10% täthet lutning media lösning i M199 ovanpå 40% täthet lutning media lagret noggrant, med en Pasteur-pipett för att undvika någon blandning mellan de två lagrarna.
- Samla in 1 x 109 parasiter från stillastående-fas kultur genom centrifugering vid 1 900 x g i 10 min.
- Att resuspendera cellerna i 6 mL Dulbeccos modifierade viktigt Medium (DMEM).
- Lager 2 mL cellsuspension direkt ovanpå 10% täthet lutning media lagret, försiktigt, med en Pasteur-pipett för att undvika blandning mellan lager.
- Centrifugera övertoningen under 10 minuter vid 1300 x g vid rumstemperatur.
Obs: På grund av skillnader i fysiska egenskaper mellan Leishmania arter, centrifugering villkor för varje kan behöva justeras något för att säkerställa maximal avkastning. - Samla in parasiter (berikad i metacyclic promastigote form) från bandet bildade vid övre 10% täthet lutning media gränsen (gränssnitt mellan 0% och 10% täthet lutning media lager).
- Späd parasiter med en volym av DMEM och samlar in genom centrifugering (1.900 x g under 10 minuter vid rumstemperatur).
- Återsuspendera i 500 µL DMEM medium och räkna i en hemocytometer att kvantifiera avkastning.
-
Generation av L. amazonensis amastigotes axenic kultur villkor (lågt pH / förhöjd temperatur)6,8,13
- Blanda 5 mL log-fas promastigote kultur (pH 7,4 på 26 oC) med en lika stor volym av amastigote medium (pH 4,5), med 25 cm2 kolvar (totalt 10 mL medium) och inkubera vid 26 ° C över natten.
- Flytta kolven från 26 ° C till 32 ° C.
- Efter 3 eller 4 dagar, split kultur 1:5 i amastigote media vid 32 ° C.
- Kontrollera parasiterna i nästa 3-4 dagar (max 7 dagar) att se om de är redo för användning i infektioner.
Obs: Friska axenic amastigotes bör ha en oval form, utan synliga flageller. Delvis differentierade amastigotes har en stor oval form med kort flageller. Kulturen bör inte ha en massa klumpar - många klumpar är en indikation på icke-växer, dör parasiter. Den amastigote kulturen kan split 1:5 och underhålls för högst 3 veckor.
4. infektion med L. amazonensis
- Späd parasit suspensioner enligt önskad MOI (vanligtvis 3-5 metacyclic promastigotes per makrofag [MOI 1:3 eller 1:5]) och 1 amastigote per makrofag [MOI 1:1]. Tillsätt Leishmania i PBS- / - i en volym på 50-100 µL till varje brunn som redan innehåller 2 mL medium.
- Inkubera BMMs för 1 h med amastigotes och 3 h med metacyclic promastigotes på 34 oC för infektion.
Obs: Optimal infektion temperatur varierar mellan arter. - Efter inkubation, tvätta bort gratis parasiter i varje väl 3 x med 2 mL PBS- / - pre värms till 37 ° C.
Obs: Skingra PBS försiktigt för att säkerställa att coverslips inte flyta över varandra. Snurra försiktigt på plattan och sedan aspirera ut vätskan. Använda separata utvärderingsenheten tip använder flera stammar av parasiter för att undvika korskontaminering. - Fixa 1 h eller 3 h tidpunkt prover genom ruvning var väl med 1,5-2 mL 2% PFA i PBS- / - för 10 min. Tvätta 3 x med PBS- / -. Inte aspirera sista tvättningen och kyla plattor som innehåller coverslips i PBS till färgning.
- Tillsätt 2 mL färsk BMM medium till varje brunn på tallrikar för ytterligare tidpunkter och inkubera vid 34 ° C.
- Fix återstående tidpunkter som önskat som beskrivs i steg 4,3 och kyla plattorna tills färgning.
5. DAPI färgning och täckglas montering
- Aspirera PBS från brunnar innehållande coverslips och tillsätt 1,5 mL PBS- / - med 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur, följt av 3 x tvätt med 2 mL PBS- / -.
- Tillsätt 1 mL PBS- / - med 2 µg/mL DAPI (utspädd från 5 mg/mL stamlösning i vatten) till brunnar innehållande coverslips och inkubera i en annan 1 tim i rumstemperatur.
Obs: Inkubationstiden med DAPI är avgörande för korrekt visualisering av intracellulära Leishmania parasiter. Makrofag atomkärnor fläcken snabbt, på grund av sin större storlek och DNA innehåll men färgning av kärnor av intracellulära parasiter är långsammare. Således är det nödvändigt att tillåta DAPI genomsyra genom och parasit plasmamembranet och parasit nukleära membranet att förlänga inkubationstiden utöver vad som krävs för att visualisera BMM atomkärnor. Med ordentlig DAPI fläcken, kan mitokondriella DNA kinetoplasten nära flagellar fickan parasiten också visualiseras, förutom nuclear DNA. - Tvätta varje brunn innehållande coverslips 3 x med 2 mL PBS- / - och sedan lyft och flip coverslips med pincett att placera cellen sida ner och montera på glas Mikroskop diabilder med en kommersiellt tillgänglig antifade montering reagens.
Obs: Coverslips är ytterst sårbara och behöver försiktig hantering. Undvik att sätta press på dem, särskilt mot sidoväggen av brunnar vid lyft. Att lägga till några droppar av PBS- / - minskar ytspänningen mellan täckglas och väl och underlättar lyft processen. En fin gauge nål kan användas för att hjälpa nyfikna coverslips från botten av brunnen. Efter att placera ett täckglas på bilden, tryck du försiktigt ner med pincett för att driva ut eventuella luftbubblor i montering media. Om ett täckglas är bruten eller har möjligen vänt under processen lyftande, inte montera; helt enkelt använda det extra fjärde täckglaset. - Kylskåp diabilder till kvantifiering.
6. infektion kvantifiering
- Undersöka DAPI-färgade bilder i fluorescens Mikroskop genom att fokusera på makrofager med 100 X-objektiv med nedsänkning olja (magnetiseringen på 358 nm; optimala utsläpp på 461 nm).
Se till att fokus är på lagret av makrofager mellan objektglas och täckglas. - Kvantifiera antalet makrofager (stora kärnor fläckade DAPI) och antalet mindre amastigote kärnor hopade runt varje makrofag nucleus (se figur 2A, DAPI) för varje synfält, med hjälp av en manuell räknare.
Obs: Amastigote atomkärnor kan inte alla vara synliga i ett plan i fokus på grund av sin ringa storlek. Räknas de som är synlig när du fokuserar på makrofag atomkärnor, och sedan använda fina fokus för att kontrollera för parasit kärnor i plan ovanför och nedanför makrofag atomkärnor. - Flytta till en annan synfält att upprepa kvantifiering. Använd en separat disk för att spåra antalet fält som räknas. Flytta genom visuella fält i parallella rader över varje täckglas, att förhindra räknar överlappning.
- Kvantifiera minst 200 makrofager per täckglas. Kvantifiera tidpunkt-infektion i tre exemplar (3 coverslips). Räkna det fjärde täckglaset om en av de tidigare inte är lämplig för inventering på grund av dålig montering, glas går sönder, täckglas överlappning, etc.
Obs: Om 200 makrofager inte kan räknas på någon ett täckglas, räkna reservdelar fjärde. - Beräkna infektionsnivåerna som amastigotes/makrofag eller amastigotes/100 makrofager och avgöra procent infekterade makrofagerna från raw kvantifiering data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leishmania har två smittsam - metacyclic promastigotes som skiljer från procykliskt promastigotes på den stationära fasen av kultur och amastigotes, som är de intracellulära stadierna (figur 1). I vissa Leishmania arter såsom L. amazonensis, kan amastigotes också differentieras i axenic kultur genom att skifta promastigote cellerna lägre pH (4.5) och förhöjd temperatur (32 ° C), villkor som liknar de som finns inuti BMM PVs 8 , 34. endast metacyclic promastigote eller amastigote former av Leishmania är kunna inducera bildandet av PVs och replikerar intracellulärt efter att uppslukas av värd makrofager35. Odifferentierad log-fas promastigotes är icke-virulent och oförmögna att främja PV bildandet (figur 2).
När det gäller infektioner med metacyclic promastigotes finns det vanligtvis en 24 h fördröjning innan en ökning av intracellulär parasit nummer. Detta beror på att de metacyclic promastigotes har första differentieras till amastigotes innan de börjar att replikera. Av denna anledning, infektioner som inleddes med metacyclic promastigotes tar längre tid att Visa ökar i totala intracellulär parasit nummer, och därför kan behöva inkuberas under längre tidpunkter.
Figur 2A representerar en framgångsrik infektion med axenically differentierade amastigotes, visar intracellulära lokalisering av Leishmania (i rött) efter första infektionen (1 h), före bildandet av PVs av fusion av phagosomes med lysosomer. På 48 h, kan distinkta stora PVs hysa flera parasiter observeras. En stadig ökning av antalet parasiter inuti PVs är kännetecken av virulent Leishmania infektioner. Icke-virulent log-fas promastigotes (figur 2B), däremot inte kan initiera PV utveckling (48 h tidpunkt), misslyckas att replikera och dödas så småningom släpper värd makrofager, även när tas upp av makrofager värd på jämförbara siffror metacyclic promastigotes eller amastigotes.
För att demonstrera effekten av denna metod, Vi jämförde vildtyp L. amazonensis med LMIT1/ΔLmit1 parasiter som innehåller en enda kopia av den LMIT1 (Leishmania Mitochondrial jagron T saxtransportör 1) genen, vilket resulterar i nedsatt mitokondriell järn importera13. Förlust av en LMIT1 -allel inte resulterar i betydande förändringar av mitokondriell aktivitet i LMIT1/ΔLmit1 promastigotes eller minska avkastningen av renat metacyclic former i jämförelse med vildtyp promastigotes13. Renade metacyclic promastigotes från både vildtyp (WT) och LMIT1/ΔLmit1 stationära kulturer var lika effektiva i invaderar BMMs, baserat på jämförbara antalet intracellulära parasiter kvantifieras 1 h efter infektion ( Figur 3A, 1 h). Efter en inledande 24 h fördröjning, som krävs för metacyclic promastigotes att anpassa sig och differentieras till amastigote former, en stadig ökning av antalet intracellulära vildtyp parasiter (ca 3-faldig mellan 24 h och 72 h tidpunkter) var observerats. Däremot observerades liten eller ingen intracellulära tillväxt av LMIT1/ΔLmit1 parasiter (jämför 1 och 72 h tidpunkter), vilket tyder på att förlust av enstaka LMIT1 allel avsevärt påverkar möjligheten för denna stam att växa inuti makrofager. Episomal uttryck av LMIT1 protein i kompletteras stam (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) räddade intracellulär parasit tillväxt till vildtyp nivåer, bekräftar att LMIT1 är kritiska för amastigote intracellulära replikering och virulens13.
Makrofag infektioner som utförs med axenic amastigotes, genereras av skiftande promastigote kulturer (vid pH 7,4; 26 oC) till amastigotes tillväxt villkorar (pH 4,5; 32 oC)34,36, visade en intracellulär tillväxt mönster (figur 3B) liknande den som observerats med metacyclic promastigotes (figur 3A). Följande jämförbara nivåer av inledande upptag (figur 3B, 1 h) vildtyp (WT) och LMIT1 kompletteras (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) amastigotes växte stadigt, samtidigt som LMIT1/ΔLmit1 amastigotes igen Det gick inte att Visa intracellulära tillväxt. Axenic amastigotes var mer smittsam (MOI 1:1 jämfört med 1:5 för metacyclic promastigotes) och replikeras mer effektivt släpper PVs.
Våra data visar en inledande 24 h försening för metacyclic promastigote infektioner, innan det finns en ökning av intracellulär parasit nummer (jämför mellan 24 h tidpunkter i figur 3A och 3B). Lag-gruppen representerar den tid som krävs för internaliserade metacyclic promastigotes först differentieras till amastigotes innan du börjar att replikera. Ett vanligt misstag folk gör när du använder metacyclic promastigotes för att infektera, är inte vänta tillräckligt länge. I fall där en förändrad virulens inte är drastiska utfördes experiment över 96 h snarare än 72 h producerar mycket mer tillförlitliga bestämningar.
Figur 1 : Scanning Electron Mikrograf bilder av olika L. amazonensis livsstadier. Log-fas promastigote, metacyclic promastigote från stationära-fas och axenic amastigote. Bar = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : En representativ illustration av BMM infektion med virulent axenic amastigotes (A) och icke-virulent log-fas promastigotes (B) av L. amazonensis. Immunofluorescens bilder av makrofager som isolerats från BALB/c -möss, 1 och 48 h efter infektion. Infekterade makrofagerna bearbetades för immunofluorescens som beskrivs i protokollet. PV membran var fläckad med råtta antimus Lamp1 monoklonal antikropp (1:1, 000 utspädning) för 1 h, följt av 1 h inkubation med anti-kanin fluorescerande IgG (1: 500 utspädning). Parasiten färgning utfördes av ruvning coverslips med musen polyklonala antikroppar genereras mot axenic L. amazonensis amastigotes, följt av antimus IgG rött färga (1: 500 utspädning) 6. Alla coverslips behandlades ytterligare med DAPI för färgning atomkärnor. A bildandet av distinkta PVs hysa flera amastigotes 48 h tidpunkt är kännetecknande för en framgångsrik Leishmania -infektion med axenic amastigotes. (B) frånvaro av distinkta PV bildandet och replikera amastigotes 48 h tidpunkt kännetecknar avsaknaden av virulens i promastigotes från logg-fas kultur. Rött anger -Leishmania färgning, grön indikerar anti-Lamp1, blått anger DAPI-färgade DNA och gult indikerar sammanfogning av anti-Lamp1 och DAPI fläckar. Barer, 5µm. Denna siffra har ändrats från Björnsson, B. et al., 2013. Ursprungligen publicerad i J. Exp. Med. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Borttagning av en LMIT1 -allel allvarligt försämrar intracellulära tillväxten av muterade LMIT1/Δlmit1 parasiter. BMM smittades för den angivna tiden med L.amazonensis och antingen fasta omedelbart eller ytterligare inkuberas i 24, 48 eller 72 h innan de fastställdes, fläckade DAPI, och numrera av intracellulära parasiter var beslutsam mikroskopiskt. (A) BMMs var infekterade med renat vildtyp (WT), enda knockout (LMIT1/Δlmit1) och kompletteras enda knockout (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) metacyclic promastigotes (MOI 1:5) för 3 h och fasta omedelbart eller inkuberas ytterligare fastställdes för angivna tidpunkter, och antalet intracellulära parasiter mikroskopiskt. Uppgifterna representerar det medelvärde ± SD tre exemplar bestämningar och är representativa för resultaten av tre oberoende experiment. Asteriskerna visar signifikanta skillnader i smittsamhet mellan WT och LMIT1/Δlmit1 parasiter (Students tvåsidiga t -test 48 h, p = 0,017; 72 h, p = 0,008). (B) Axenic amastigotes från vildtyp (WT), enda knockout (LMIT1/Δlmit1) och kompletteras enda knockout (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) kulturer testades för sin förmåga att infektera BMMs. BMMs smittades för 1 h (MOI 1:1) och antingen fasta omedelbart (1 h) eller efter ytterligare inkubation för 24, 48 eller 72 h och antalet intracellulära parasiter bestämdes mikroskopiskt. Uppgifterna representerar det medelvärde ± SD tre exemplar bestämningar och är representativa för mer än tre oberoende experiment. P-värden (Students tvåsidiga t-test) mellan respektive grupp anges. Denna siffra har ändrats från Björnsson, B. et al., 2016. Ursprungligen publicerad i PloS Pathog. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantitativa data produceras av BMM infektion analysen beskrivs ovan, kan utredarna att få priser för infektion och en tillförlitlig bestämning av förändringar i virulens boenden i relativt kortare period (högst 2 veckor, jämfört med 2 månader som krävs för i vivo experiment). Denna metod förlitar sig på DNA specifika färgämnet DAPI, som specifikt fläckar makrofag och parasit kärnor, och tillåter snabb identifiering och kvantifiering av infekterade celler. I jämförelse binder andra fläckar såsom Giemsa till ett stort antal olika cellulära komponenter med varierande intensitet, komplicerande visuell analys37. Användningen av DAPI kan erkännande av intracellulära parasiter och deras tydlig åtskillnad från cellulära strukturer (endast kärnor av värdceller färgas också, och deras storlek är flera storleksordningar större än parasit kärnor), möjliggör enklare och snabbare kvantifiering av infektioner.
Som med alla experimentella ingrepp, har denna metod vissa begränsningar och flera kritiska steg som kräver noggrann utförande. Invivo Leishmania -infektion innebär komplexa medfödda immunologiska svar före fagocytos, som bestämmer den ultimata course infektion38. Valet av modell mus stam, är därför av avgörande betydelse i studiens utformning. Såväl BALB/c som C57BL/6 möss stam används i detta protokoll Björn mutationer i den gen som kodar för proteinet naturliga resistensassocierade makrofag (Nramp1), en proton efflux-pump som translocates Fe2 + och Mn2 + joner från makrofag lysosomer/phagolysosomes i cytosolen. Detta resulterar i ökad mottaglighet för patogener som replikerar inuti endocytic facket makrofager8,30,31. Lyckade kolonisationen i makrofager beror också på infektiös Leishmania parasiter unika förmåga att manipulera immunsvaret för att undertrycka/överleva makrofag aktivering39,40. Den differentierade makrofager som används för Leishmania BMM infektioner något härma tillståndet icke-aktiverade makrofager i vivo, men analysen tar inte hänsyn till de mycket mer komplex uppsättningen värd komponenter som påverkar virulens i djurmodeller.
Isolering av friska infektiös Leishmania former är andra helt avgörande kravet för korrekt virulens bestämning. Inte alla promastigotes alla Leishmania stammar effektivt differentieras till amastigotes när de utsätts för låga pH / hög temperatur förhållanden41. Därför utförs infektioner ofta med metacyclic promastigotes renas från stillastående promastigote kulturer. För att effektivt isolera metacyclic promastigotes, dra några rening strategier nytta av den förändra sammansättningen av den parasit ytan glykokalyx under olika levnadsstadier, inklusive omfattande ändringar av lipophosphoglycan (LPG) struktur42,43,44. Exempelvis har jordnötter agglutinin (PNA), en lektin som binder selektivt till procykliskt men inte metacyclic LPG effektivt använts i negativa urval protokoll för att rena L. stora metacyclic promastigotes45. Metacyclic promastigote rening strategi för L. amazonensis innebär vanligtvis en monoklonal antikropp mAb3A.1 som kan agglutinera procykliskt promastigotes genom att rikta specifika ytan protein epitoper som är otillgängliga i metacyclic former på grund av ytan glykokalyx ändringar8,13,32. Användning av en täthet lutning media att separera metacyclic promastigotes från promastigotes baserat på scenen-specifika skillnader i buoyant densitet är en attraktiv metod eftersom det inte beror på artspecifika variationer i parasit ytan ligander. Denna metod, som inledningsvis beskrivs för L. stora metacyclic promastigote rening33, har framgångsrikt antagits för flera andra Leishmania arter främst genom ändringar av centrifugering villkor under täthetlutning sedimentering46,47,48,49.
Det är också viktigt att vara medveten om problem som kan försvåra genomförandet av analysen, som kan uppstå på flera steg i processen. Dessa problem kan innefatta kontaminering under BMM utvinning, misslyckade differentiering av BMMs efter utvinning, inkonsekvent makrofag plätering, ofullständig rening av smittsam parasit former, fattiga eller inkonsekventa infektion, och svårigheter montera glas coverslips på objektglas. Dessa möjligheter har tagits upp i protokollet, och kan lösas genom att noggrant bedöma varje steg av förfarandet infektion att identifiera problemet. Exempelvis tyda kontamination av BMM kulturer under processen differentiering ett behov av förbättrad steril teknik under extraktionen. Noggrann uppmärksamhet på renhet och friskhet av rening reagenser och exakta genomförandet av protokollet rening får rätta misslyckad eller ofullständig rening av formulären önskad parasit. Dålig eller inkonsekvent infektioner kan orsakas av felaktig kvantifiering av parasiter eller en MOI som är för hög eller för låg för de specifika försöksbetingelser. Efter utvinning, bearbetning och montering av glas coverslips är utan tvekan den mest tekniskt utmanande processen i denna teknik; individer kan hitta de föredrar att använda olika verktyg för att underlätta hanteringen av coverslips. Tydlig visualisering av DAPI missfärgade kärnor är avgörande för korrekt parasit räknar under mikroskopet. Svag färgning och felaktig fokusering är två största bovarna bakom inkonsekvent kvantifiering. Detta kan säkerställas genom kvalitetskontroll av DAPI färgning steg, begränsa ljusexponering tiden att minska foto-blekning, och snabbt byta objektiv fokus för att beakta alla parasit kärnor i fältet. DAPI fluorescens ljusstyrka kan också förbättras genom att säkerställa korrekt permeabilisering av proverna med rengöringsmedel, och öka koncentrationen av DAPI under färgningen. En alternativ metod som kan underlätta kvantifiering är att få digitala bilder av proverna under mikroskopisk undersökning. Bilderna kan användas för kvantifiering vid ett senare tillfälle och kan vara verifierade/kvantifieras av oberoende utredare. Dock finns det tekniska svårigheter i samband med denna process som kräver noggrant övervägande. Sfäriska pågrund av PV är parasiter inte alltid på samma fokalplan. Detta kräver att flera bilder vara förvärvade använder olika focal plan för varje mikroskopiska fält och sedan monteras ihop till konto för alla parasiter. Annars, kvantifiering från fotografier kan vara mycket vilseledande. Beräkningar av makrofager/fält och amastigotes/fält är avgörande för att säkerställa konsekvent makrofag plätering och spridning av parasiter uppnåddes under infektion. Eftersom BMMs fullt differentierade celler, bör deras antal inte öka över tid. Om antalet värd makrofager ökar över tiden, betyder det att makrofager var fortfarande omogen. I så fall bör källan och koncentration av M-CSF kontrolleras. Bestämning av procent infekterade makrofagerna kan också vara användbart att ge en helhetsbild av mottagande cellen-patogen interaktion, särskilt i fall där procent infektion och parasit laddar inte följer liknande trender20,21 .
Metoden för in vitro- BMM infektion beskrivs här kan ändras för att passa specifika experimentella behov. Ändringar kan göras till någon av de grundläggande stegen i processen - BMM utvinning och differentiering, rening av smittsam parasit former och kvantifiering av in vitro makrofag infektioner, liksom genomförande infektioner med olika MOIs och justera perioden av infektion och tidpunkter analyseras. Kultur media komponenter kan också ändras enkelt via antingen tillskott eller utarmning av specifika näringsämnen och flera olika stammar eller former av parasiter kan bedömas samtidigt. Dessa ändringar kan kräva ytterligare justering av tekniska förfaranden. till exempel förväntas förfaranden för amastigote beredning och metacyclic promastigote rening variera mellan olika Leishmania arter. Extra fluorescerande färgämnen förutom DAPI, eller fluorescently märkta cellulära komponenter kan användas för att visualisera ett omfattande sortiment av värd-parasit interaktion processer6,24. Denna analys kan dessutom anpassas till en hög genomströmning system (HTS) format, som skulle möjliggöra för snabb screening av sammansatta bibliotek för att identifiera nya och effektiva läkemedel leads för behandling av leishmaniasis24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar de har inga konkurrerande finansiella intressen,
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Institutes of Health grant RO1 AI067979 till NWA.
YK är mottagaren av grundutbildning fellowship från Howard Hughes Medical Institute/universitetet i Maryland College Park.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
