Summary
Все патогенных видов Leishmania проживают и репликацию внутри макрофагов их позвоночных хозяев. Здесь мы представляем протокол заразить мышиных макрофаги костного мозга, полученных в культуре с лейшманий, следуют точную количественную оценку роста внутриклеточных кинетики. Этот метод полезен для изучения отдельных факторов, влияющих на взаимодействие хост возбудителя и лейшмании вирулентности.
Abstract
Жизненный цикл лейшманий, возбудителя лейшманиоз, попеременно Промастиготы и amastigote этапов внутри насекомого и позвоночных хозяев, соответственно. Хотя патогенные симптомы лейшманиоза может широко варьировать, от доброкачественных кожных высоко смертельным заболеванием висцеральных форм в зависимости от видов инфекционный, всех видов Leishmania находятся внутри узла макрофаги этапе позвоночных их жизненный цикл. Таким образом, лейшмании инфективности напрямую связана с его способность вторгнуться, выжить и воспроизвести в пределах parasitophorous вакуоли (PVs) внутри макрофагов. Таким образом оценки паразита возможность реплицировать внутриклеточно служит надежный метод для определения вирулентности. Изучение развития лейшманиоз, с использованием животных моделей является длительным, утомительно и часто трудно, особенно с разработаны патогенетически важные висцеральные формы. Здесь мы описываем методологии следовать внутриклеточных развитие лейшманий в костный мозг производные макрофагов (BMMs). Внутриклеточный паразит чисел определяются интервалом 24 ч для 72-96 h после инфицирования. Этот метод позволяет для надежного определения воздействия различных генетических факторов на лейшманий вирулентности. В качестве примера мы покажем, как исключить один аллель гена лейшмании митохондриальной железа транспортера (LMIT1) ухудшает способность мутантный штамм лейшмании amazonensis LMIT1/ΔLmit1 расти внутри BMMs, отражая резкое сокращение в вирулентности, по сравнению с одичал типа. Этот assay также позволяет точно контролировать экспериментальных условиях, которые могут управляться индивидуально для анализа влияния различных факторов (питательные вещества, реактивнооксигенных видов, и т.д.) на хост возбудитель взаимодействия. Таким образом соотвествующего исполнения и количественной оценки BMM инфекции исследования обеспечивают неинвазивный, быстрым, экономичным, безопасный и надежный альтернативу обычным животной модели исследования.
Introduction
Лейшманиоз ссылается на широкий спектр человеческих заболеваний, вызванных простейших паразитов видов рода Leishmania. В настоящее время примерно 12 миллионов человек инфицированы лейшмании во всем мире, и более чем 350 миллионов подвергаются риску. Патологии болезни зависит от видов Leishmania и принимающих факторов, и симптомы варьируются от безобидных самовосстановления поражениях кожи смертоносных visceralizing формы. Если untreated, Висцеральный лейшманиоз является фатальным, рейтинг только после малярии как смертоносных болезней человека, вызванного инфекцией с простейших паразитов1. Несмотря на широкие различия в патологии заболеваний и симптомов всех видов Leishmania имеют жизненный цикл digenic, чередуя Промастиготы и amastigote этапов внутри насекомых и позвоночных хозяев, соответственно. Внутри позвоночных, лейшмании целевой хост макрофагов для вторжения и вызвать образование parasitophorous вакуоли (PVs), кислой отсеков с свойства фаголизосомах скопирована Высоко вирулентным amastigote формы. Amastigotes сохраняется в тканях хост во время хронической инфекции и может быть передан на неинфицированных москитов, завершая цикл передачи. Таким образом в контексте развития болезней человека, amastigotes являются наиболее важным лейшмании жизненного цикла формы2. Расследование, как amastigotes репликацию внутри макрофагов PVs имеет решающее значение для понимания лейшмании вирулентности3,4,5,6,7 и для Разработка новых эффективных терапии.
Здесь мы описываем метод регулярно используется в нашей лаборатории для изучения лейшмании инфекции и репликации в костный мозг производные макрофагов (BMMs), который включает количественную оценку числа внутриклеточных лейшмании со временем. Этот процесс включает сбор моноциты из костного мозга мыши и дифференцировку макрофагов в культуре, в vitro инфекцию с инфекционный формы (metacyclic promastigotes или amastigotes) Leishmania и количественной оценки количество внутриклеточных паразитов в каждом интервале 24 ч в течение 72-96 ч после инфицирования. В нашей лаборатории был использован этот assay для определения влияния нескольких экологических факторов и паразита генов, включая определение критической роли железа в содействии вирулентности L. amazonensis , который был также подтвержден зверолов исследований развития поражения в мышей6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Поскольку все патогенных видов Leishmania установить их репликативной нишу внутри узла макрофагов, этот assay может использоваться универсально для вирулентности определений всех видов Leishmania .
Выполнение BMM инфекций позволяет анализ основ паразито хозяинных взаимодействия на уровне отдельной ячейки и таким образом более широкое понимание как лейшмании паразитов взаимодействуют с их предпочтительным разместить микроокружения, PVs макрофагов. Макрофагов инфекцией assays успешно использовались несколько групп16,17,18,19,20,,2122 для изучения функции принимающей макрофагов и лейшмании специфических генов и их возможного участия в сложное взаимодействие, которое характеризует внутриклеточную инфекцию. БММ инфекции позволяют квантификации роста паразита как считывание влияния принимающей факторов, которые влияют внутриклеточных выживания, как производство оксида азота бактерицидных, генерации активных форм кислорода и других неблагоприятных условий с которыми внутри Лизосома как PVs23. Макрофагов инфекции анализов также были использованы для выявления потенциальных наркотиков приводит анти leishmanial для терапевтических развития13,24.
В vitro характер BMM инфекций обеспечивает несколько преимуществ перед другими методами для оценки лейшмании вирулентности. Однако несколько предыдущих исследований, изучения механизмов выживания внутриклеточный паразит со временем не количественно инфекции как ставка20,21,24. Кроме того многие исследования сосредоточены на после инфекции в естественных условиях со временем сделал это путем измерения размера кожные поражения и другие физиологические симптомы, которые лишь косвенно связаны с паразитом репликации25,26 , 27. в естественных условиях инфекции является строгий подход к оценке вирулентности возбудителя, но поражения размер измерения на основе зверолов, опухоль в одиночку часто являются неадекватными, поскольку они отражают воспалительной реакции в инфицированных тканях и не абсолютное количество паразитов. По этой причине развитие поражения зверолов анализов должны сопровождаться количественная оценка нагрузки паразита в инфицированных тканях, процедура, которая требует продолжительного ограничения разрежения assays28. Кроме того в vivo исследования часто связаны, жертвуя несколько животных в различные моменты времени для извлечения тканей интерес6,,8,9,,10, 11 , 13. В отличие от этого, большое количество BMMs могут быть получены только одно животное, и эти клетки могут быть покрытие в условиях, которые позволяют оценку инфекции в различные моменты времени. Кроме того по сравнению с в vivo исследований, выполняя в vitro BMM инфекций позволяет больший контроль над экспериментальных условиях. Количественная оценка макрофаги быть инфицированы наряду с паразитами, сами позволяет точный контроль кратности инфекции (МВД) и условий, культуры. Точный контроль над этими факторами могут быть ключом в определении характеристики дискретных сотовой пути и в понимании их влияния на ход инфекции.
С учетом этих преимуществ, это несколько удивительно, что очень немногие группы изучения лейшмании вирулентности пока полной мере воспользовались количественной оценки внутриклеточных репликации в макрофагах. В этой статье мы обсудим распространенных ошибок, которые могут быть затрудняет более широкое использование этот assay и предоставляют пошаговые протокол для облегчения ее надлежащего осуществления. Учитывая ее точность и универсальность пробирного BMM инфекции, которую мы опишем здесь могут не только быть использованы для изучения взаимодействия хост патогена, влияющие на лейшманий вирулентности, но и для изучения других микроорганизмов, которые реплицируют внутри макрофаги29. Важно отметить, что этот assay также могут быть разработаны как метод быстрый и экономичный доклинические скрининга для анти leishmanial разработки лекарственных препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с рекомендаций, содержащихся в руководстве для ухода и использования лабораторных животных, национальные институты здравоохранения и были одобрены IACUC университета штата Мэриленд. Все шаги, описанные в разделах с 1 по 4 должно осуществляться асептически внутри биологических ламинарные шкафы. Личная защита должна использоваться, и следует проявлять осторожность при обработке живой лейшмании паразитов на всех этапах экспериментов.
1. изоляция и дифференциации костного мозга-производные макрофагов (BMMs)8,,3031
- День 0: Жертву 4 - 6 week-old девушки C57BL/6 или мыши BALB/c в камере2 CO и подтвердить смерть через шейки матки дислокации. Стерилизации ножницы, щипцы, сохраняя их замачивают в 70% этиловом спирте. Spray перчатки с 70% этанола чтобы позволить стерильной обработки на протяжении всего процесса изоляции клеток костного мозга.
- Защитить жертву мышь, чтобы вскрытия Совет, закрепляя его передние конечности и дезинфекции, обильно поливая водой 70% этиловом спирте.
- Сделайте небольшой надрез (около 1 см) с ножницами вблизи тазобедренного сустава. Осторожно вставьте ножницы под кожу, чтобы отделить основные мышцы и вырезать кожу весь путь вокруг тазобедренного сустава.
Примечание: Рассечение Совета могут быть повернуты для улучшения доступа к тазобедренного сустава. - Тщательно deglove кожу от ГЭН, потянув к лодыжке и удалить. Отрезать ноги на лодыжке, стараясь сократить на уровне или ниже лодыжки совместных оставить голени полностью нетронутыми.
Примечание: Малоберцовой кости на данном этапе слабо подключен и может быть легко отделяется с щипцами. - Вручную найти тазобедренного сустава, манипулируя бедра для определения точки вращения. Внимательно используйте ножницы, чтобы разорвать ногу выше тазобедренного сустава оставить нетронутыми головку проксимального отдела бедренной кости.
- Удалите столько мышц и соединительной ткани как можно из ногу с ножницами. Удалите любые оставшиеся кожи от лодыжки и любой избыток костного материала выше тазобедренного сустава.
- Место уборка нога кости в стерильных RPMI дополнена пенициллина/стрептомицина (1% конечной концентрации) в чашку Петри на льду.
- Повторите шаги 1.4 через 1.6 изолировать голени и бедра от других заднюю ногу.
- Удалите оставшиеся мышц и соединительной ткани из костей, замачивания в RPMI, с использованием стерилизованные щипцы и стерильные лезвия #10.
- Место костей на крышке Петри. Тщательно вырежьте голени с лезвием непосредственно над голеностопного сустава для доступа к костного мозга. Удалите большеберцовой кости от остальной части ноги, резки непосредственно под коленный сустав.
- Нарисуйте 10 мл стерильной RPMI дополнена пенициллина/стрептомицина (1% конечной концентрации) в 10-мл шприц и прикрепить 25G иглы.
- Крепко голени с щипцами, вертикально над 50 мл конические на льду. Используйте шприц осторожно впрыснуть примерно 5 мл RPMI в конце кости для очистки костного из другой конец в коническую пробирку. Промойте костного мозга в общей сложности 10 мл RPMI, до тех пор, пока кость становится белым.
Примечание: После тщательной промывки, кости должны стать белым. Если нет, то продолжайте промывку для удаления костного мозга. Дистальный конец большеберцовой кости может потребоваться обрезать обратно с лезвием, если она является слишком узким, чтобы вставить иглу. - Вырежьте бедренной сразу выше коленного сустава и сразу же ниже тазобедренного сустава подвергать обоих концов кости для доступа к костного мозга. Флеш костного мозга от бедра с в общей сложности 10 мл RPMI таким же образом, как голени.
- Повторите очистка и промывка шаги 1.6 через 1.13 с оставшиеся кости и собирать клетки костного вспыхнул в единый 50 мл Конические трубки
Примечание: Если кости ломаются в любой точке во время рассечение до промывки кости, не используйте костного мозга от этой кости. - Центрифуга конические трубы используются для сбора костного покраснел от всех четырех костей за 10 мин при температуре 4 ° C на 300 x g.
- Место 60 мл стерильной BMM среды (RPMI с окончательной концентрацией 20% FBS, пенициллин 1% / стрептомицина, 1,2 мм Na пируват, 25 мкг/мл человека M-CSF) в 175 см2 клетки культуры колба с крышку фильтра.
- Отменить супернатанта следующие центрифугирования и Ресуспензируйте клетки Пелле, нежный вверх и вниз, дозирование, используя 5 мл BMM среды из колбы.
- Суспензию клеток передавать культуры колбу и промойте Конические трубки дважды с БММ среднего от культуры Фляга для обеспечения максимальной клеток восстановления. Убедитесь, что тщательно перемешать суспензию клеток в средних и распространять 30 мл для второй 175 см2 клетки культуры колбу крышкой фильтра от первоначального 175 см2 клетки культуры колбу.
- Инкубируйте обоих флаконы, содержащие 30 мл суспензии клеток каждую ночь при 37 ° C, 5% CO2 разрешить разделение любой загрязняющих фибробластов, резидентов макрофаги и другие адэрентных клеток.
- День 1: Передача супернатанта, содержащих недифференцированные костного клетки от колбы до 100 мм x 15 мм не лечить TC полистирола Петри в приблизительно 10 мл/блюдо и инкубировать при 37 ° C, 5% CO2. Выбросите колбы.
- День 3 или 4: Добавить еще 5 мл BMM среднего (предварительно разогретую до 37 ° C) в каждой чашке Петри и продолжить инкубации при 37 ° C, 5% CO2.
2. покрытие BMMs на Coverslips для инфекции (день 7 или 8)
- Подготовка 6-ну тканевые культуры пластин, поставив четыре (4) стерильные 12 мм стекло coverslips (газобетона и хранить в закрытой стеклянной посуде) в нижней части каждой пустой хорошо.
Примечание: Забрать каждый coverslip стерильный 12 мм с аспирационных наконечником для вакуумной магистрали. Место coverslips в скважины без перекрытия, выпустив в желаемое положение путем сжимать трубу для прерывания вакуум. - Аспирационная СМИ (и любой non сторонник клетки) из чашек Петри с приверженцами костного покрытием производным макрофагов и осторожно промыть приверженца клетки 2 x с стерильных Дульбекко фосфатный буфер без кальция и магния хлорид (PBS- / -) предварительно разогретую до 37 ° C.
- Каплям, добавить 5 мл стерильной 1 x PBS- / - с конечная концентрация 1 мм ЭДТА в каждой чашке Петри и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C для отсоединения сторонник BMMs. Убедитесь, что клетки отсоединяются с помощью микроскопа.
- Соберите все отдельные клетки, приостановлено в однократном ПБС- / - с 1 мм ЭДТА в 50 мл Конические трубки. Промойте каждое блюдо 2 x с 5 мл PBS- / - и добавить в ячейку подвеска пул.
Примечание: Суспензию клеток может быть разведен с дополнительным PBS- / - защитить макрофаги от токсичности ЭДТА в процессе сбора. - Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте макрофагов в 5-10 мл BMM среднего, закупорить. Место высокомобильна клетки на льду для предотвращения привязанность к трубы и слипания.
- Количество жизнеспособных клеток, с помощью исключения Трипановый синий в Горяева.
Примечание: Чтобы подсчитать ячейки BMM высокомобильна в 5 мл среды, разбавления микс 25 мкл суспензии клеток в 445 мкл PBS- / - и 30 мкл 0,4% раствор Трипановый синий обычно позволяет легко количественной оценки в Горяева (принимая во внимание коэффициент разбавления 20 x для окончательного расчета ). Учитываются только те ячейки, которые сделали не запачкаться с Трипановый синий (жизнеспособных клеток). Объем суспензии клеток могут быть изменены, если эта смесь слишком сконцентрированы или разбавленный. В общем доходность BMM за подготовку колеблется от 2 x 10-7 и 5 x 107 клеток из одной мыши. - Готовят суспензию клеток в среде BMM желаемого покрытия концентрации (5 x 105/мл) и разогнать подвеска 6 хорошо пластин в 2 мл средний за хорошо, так что каждый хорошо получает 1 x 10-6 макрофагов.
Примечание: Это важный шаг, который обеспечивает каждый хорошо получает достаточное количество макрофагов для покрытия coverslips равномерно. Проверьте не перекрывающиеся или плавающие в среде coverslips в скважинах. Если это так, аккуратно настройте с наконечником стерильной пипеткой. - Инкубируйте на ночь при 37 ° C, 5% CO2.
3. Очистка инфекционный форм л amazonensis
Примечание: Подготовиться лейшмании инфекции - очистить metacyclic promastigotes от стационарных Промастиготы культур8,13, или дифференцироваться в amastigote форме, с использованием стандартных л amazonensis promastigotes в культуре стерильных дифференциация протокол6,8.
-
Очистка лейшмании metacyclic promastigotes с использованием градиента плотности media(Materials) 33
- Подготовьте раствор 40% плотности градиента СМИ в стерильные, эндотоксинов свободной воды.
- Разбавьте градиента плотности раствора в 10 средних x M199 (без сыворотки) для подготовки 10% концентрации в среде M199.
- Фильтр все решения через 0,22 мкм фильтром.
Примечание: Фондовая решения могут храниться на 4 oC в темноте не более чем на 1 месяц. - Добавьте 2 мл 40% раствора плотностью градиента СМИ в нижней части трубки 15 мл конические центрифуги.
- Слой 2 мл 10% плотность раствора градиент СМИ в M199 поверх слоя градиента СМИ 40% плотность тщательно, не допускать любого смешивания между двумя слоями с помощью пипетки Пастера.
- Соберите 1 х 109 паразитов от стационарных фаза культуры центрифугированием в 1900 x g за 10 мин.
- Ресуспензируйте клетки в 6 мл Дульбекко изменение основных средних (DMEM).
- Слой 2 мл суспензии клеток прямо на вершине 10% плотности, которую градиента СМИ слоя, аккуратно, с помощью пипетки Пастера во избежание смешивания между слоями.
- Центрифуга градиент для 10 мин на 1300 x g при комнатной температуре.
Примечание: Из-за различия в физических свойствах видов Leishmania , центрифугирование условия для каждого возможно придется немного корректироваться для обеспечения максимальной доходности. - Соберите паразитов (обогащенный в форме metacyclic Промастиготы) группа, образованная на границе верхней 10% плотность градиента СМИ (интерфейс между 0% и 10% плотности градиента СМИ слоями).
- Разбавить паразитов с одного тома DMEM и собрать центрифугированием (1900 x g 10 мин при комнатной температуре).
- Ресуспензируйте в 500 мкл среде DMEM и рассчитывать в Горяева для количественной оценки урожайности.
-
Поколение л amazonensis amastigotes культуры в стерильных условиях (низкий рН / повышенных температуры)6,8,13
- Mix 5 мл лаг фазы Промастиготы культуры (рН 7,4 на 26 oC) с равным объемом amastigote среды (pH 4.5), с использованием 25 см2 фляги (всего 10 мл среды) и Инкубируйте на 26 ° C на ночь.
- Сдвиг колбу от 26 ° C до 32 ° C.
- После 3 или 4 дня Сплит культуры 1:5 в средствах массовой информации amastigote на 32 ° C.
- Проверьте паразитов в ближайшие 3-4 дней (максимум 7 дней) чтобы увидеть, если они готовы для использования в инфекции.
Примечание: Здоровый стерильных amastigotes должны иметь овальную форму, без видимых жгутиков. Частично дифференцированных amastigotes имеют большой овальной формы с короткой жгутиков. Культура не должны много сгустки - многие сгустки являются признаком межвегетационный, умирая паразитов. Amastigote культура можно разделить 1:5 и сохранить максимум 3 недели.
4. инфекции с amazonensis л
- Разбавьте паразита суспензий согласно желаемой MOI (обычно 3-5 metacyclic promastigotes за Макрофаг [MOI 1:3 или 1:5]) и 1 amastigote за Макрофаг [MOI 1:1]. Добавьте лейшманий в PBS- / - в объеме 50-100 мкл каждой скважины, уже содержащий среднего 2 мл.
- Проинкубируйте BMMs 1 ч с amastigotes и 3 h с metacyclic promastigotes на 34 oC на инфекции.
Примечание: Оптимальный инфекции температура зависит от вида. - После инкубации, тщательно смыть бесплатно паразитов в каждом хорошо 3 x с 2 мл PBS- / - подогретым до 37 ° C.
Примечание: Дисперсные PBS осторожно, чтобы обеспечить, что coverslips не плавают друг над другом. Аккуратно водоворот пластину и затем удалить из жидкости. Используете отдельный аспирационных кончик, если использовать несколько штаммов паразитов, чтобы избежать перекрестного загрязнения. - Исправить 1 h или 3 h-момент образцы по инкубации каждый хорошо с 1,5-2 мл 2% ПФА в PBS- / - за 10 минут Вымойте 3 x с PBS- / -. Не аспирационная последний мыть и охладите пластины, содержащие coverslips в PBS до окрашивания.
- Добавить 2 мл свежего BMM среднего для каждой скважины на пластины для дальнейшего раз точек и Инкубируйте на 34 ° C.
- Исправить остальные моменты времени как хотелось как описано в разделе Шаг 4.3 и охладите пластины до окрашивания.
5. DAPI окрашивание и Coverslip монтажа
- Аспирационная PBS из скважин, содержащих coverslips и добавить 1,5 мл PBS- / - с 0.1% неионные моющего средства. Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре, после чего промыть 3 x 2 мл PBS- / -.
- Добавьте 1 mL PBS- / - с 2 мкг/мл (разбавленный от 5 мг/мл Стоковый раствор в воде) DAPI скважин, содержащих coverslips и проинкубируйте еще 1 ч при комнатной температуре.
Примечание: Время инкубации с DAPI важно для правильной визуализации лейшмании внутриклеточных паразитов. Макрофагов ядер пятна быстро, из-за их большего размера и ДНК содержание, но окрашивания ядер внутриклеточных паразитов медленнее. Таким образом расширяя время инкубации за то, что требуется визуализировать BMM ядра необходимо позволить DAPI проникать через и паразита плазматической мембраны и мембраны ядерного паразита. С надлежащей DAPI пятно кинетопласта митохондриальной ДНК вблизи flagellar карман паразит может также быть визуализированы, помимо ядерной ДНК. - Мыть каждый хорошо содержащие coverslips 3 x с 2 мл PBS- / - и затем лифта и флип coverslips пинцетом место стороны ячейки вниз и смонтировать на стекле микроскопа слайды с реактивом коммерчески доступных antifade монтажа.
Примечание: Coverslips чрезвычайно хрупки и необходимости осторожного обращения. Избегайте давления на них, особенно против боковины скважин при подъеме. Добавление нескольких капель PBS- / - уменьшает поверхностное натяжение между coverslip и хорошо и облегчает процесс подъема. Тонкой иглы могут использоваться для оказания помощи в посторонних coverslips из нижней части колодца. После размещения coverslip на слайде, аккуратно нажмите вниз с щипцами для вытолкнуть воздушные пузыри в средствах массовой информации монтажа. Если coverslip нарушается или возможно отражено во время процесса подъема, не ремонта; просто используйте запасные четвертый coverslip. - Охладите слайды до количественной оценки.
6. инфекции количественная оценка
- Изучить DAPI-окрашенных слайды под флуоресцентным микроскопом, сосредоточив внимание на макрофагов с использованием 100 X объектив с погружения нефти (возбуждения на 358 Нм; оптимальное выбросов в 461 Нм).
Убедитесь, что фокус находится на слое макрофаги между стеклянное скольжение и coverslip. - Подсчитать количество макрофагов (крупными ядрами, окрашенных с DAPI) и количество небольших ядер amastigote, группируются вокруг каждого ядра макрофагов (см. рисунок 2A, DAPI) для каждого поля зрения, используя ручной счетчик.
Примечание: Amastigote ядрами могут не все будут видны в одной плоскости фокуса вследствие их малого размера. Граф тех, которые видны, когда уделялось ядер макрофагов, а затем использовать тонкой фокус для проверки паразита ядер в плоскостях выше и ниже макрофагов ядер. - Перейти в другое поле зрения повторить количественной оценки. Использовать ключ отдельный счетчик для отслеживания количества полей учитываются. Перемещения через поля зрения в параллельные ряды по каждой coverslip, чтобы предотвратить подсчета перекрытия.
- Количественно минимум 200 макрофагов в coverslip. Количественно каждый момент инфекции в трех экземплярах (3 coverslips). Граф четвертый coverslip, если одно из предыдущих не подходит для подсчета из-за перекрытия coverslip, плохой монтаж, стекла и т.д.
Примечание: Если 200 макрофаги не может быть подсчитанным на любой одной coverslip, граф запасных четвертый. - Расчет показателей инфицирования как amastigotes/макрофагов или amastigotes/100 макрофагов и определить процент инфицированных макрофагов из сырых количественной оценки данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лейшмании имеет две формы инфекционный - metacyclic promastigotes, что дифференцировать от procyclic promastigotes на стационарном этапе культуры и amastigotes, которые являются внутриклеточные стадии (рис. 1). В некоторых видов Leishmania , таких как л amazonensisamastigotes может также быть продифференцированным в стерильных культуры, сдвигая Промастиготы клетки для снижения pH (4.5) и при повышенной температуре (32 ° C), условия, аналогичные тем, которые найдены внутри BMM PVs 8 , 34. только metacyclic Промастиготы или amastigote формы лейшманий способны вызвать образование PVs и внутриклеточно репликации после быть охвачена принимающей макрофаги35. Недифференцированная лаг фазы promastigotes не опасной и не в состоянии содействовать формированию PV (рис. 2).
В случае инфекции с metacyclic promastigotes обычно это 24 часа задержки до увеличения числа внутриклеточных паразитов. Это происходит потому, что metacyclic promastigotes быть первым, чтобы дифференцироваться в amastigotes, прежде чем они начнут репликации. По этой причине инфекции, с metacyclic promastigotes займет больше времени, чтобы показать увеличение числа общей внутриклеточный паразит и по этой причине, возможно, придется быть инкубированы для длительного времени точек.
Представляет рисунок 2A успешные инфекции, используя axenically продифференцировано amastigotes, показаны внутриклеточной локализации лейшманий (в красном) после первоначальной инфекции (1 ч), до формирования PVs сплавливанием phagosomes с лизосомы. На 48 ч может наблюдаться собственный большой PVs, укрывательство несколько паразитов. Вирулентные инфекции лейшмании характерно неуклонное увеличение числа паразитов внутри PVs. Non вирулентные лаг фазы promastigotes (рис. 2B), напротив, не способны начать PV развития (48 h время точка), не удастся воспроизвести и в конечном итоге убил внутри узла макрофагов, даже когда принятые принимающей макрофаги в сопоставимых цифр metacyclic promastigotes или amastigotes.
Чтобы продемонстрировать эффективность этого метода, мы сравнили одичал тип л amazonensis с паразитами LMIT1/ΔLmit1 , содержащий одну копию LMIT1 (Leishmania Мitochondrial, яРон T ransporter 1) гена, который приводит к обесценение митохондриальной железа импорта13. Потеря одного LMIT1 аллели не привести значительные изменения митохондриальной активности в LMIT1/ΔLmit1 promastigotes или снижения урожайности очищенный metacyclic формы по сравнению с одичал тип promastigotes13. Очищенный metacyclic promastigotes от одичал тип (WT) и LMIT1/ΔLmit1 стационарные культур были столь же эффективным в вторжение BMMs, основанный на сопоставимых количество внутриклеточных паразитов, количественно 1 час после инфекции ( Рисунок 3A, ч. 1). После первоначального 24 h временной лаг, что требуется для metacyclic promastigotes для адаптации и дифференцироваться в amastigote формах, устойчивый рост числа внутриклеточных паразитов одичал типа (примерно 3 раза между 24 h и моменты времени 72 ч) был отмечено. В отличие от этого было отмечено мало или вообще не рост внутриклеточных паразитов LMIT1/ΔLmit1 (Сравните 1 h и 72 h время очки), предполагая, что потеря одного LMIT1 аллели значительно влияет на способность этого штамма расти внутри макрофаги. Episomal выражение LMIT1 белка в дополнение штамм (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) спасли роста внутриклеточных паразитов одичал тип уровни, подтверждающий, что LMIT1 имеет решающее значение для внутриклеточного amastigote Репликация и вирулентности13.
Макрофагов инфекции осуществляется с стерильных amastigotes, порожденных ветра Промастиготы культур (при рН 7.4; 26 oC) для условий роста amastigotes (рН 4,5; 32 oC)34,36, показал внутриклеточных рост шаблон (рис. 3B) схожа с metacyclic promastigotes (рис. 3A). Следующие сопоставимые уровни первоначального поглощения (рис. 3B, 1 ч) одичал типа (WT) и LMIT1 (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) amastigotes неуклонно росло, пока LMIT1/ΔLmit1 amastigotes снова не удалось показать внутриклеточных роста. Стерильных amastigotes были более инфекционный (MOI 1:1, по сравнению с 1:5 для metacyclic promastigotes) и реплицированы более эффективно внутри PVs.
Наши данные демонстрируют первоначальный 24 часа задержки для metacyclic Промастиготы инфекции, прежде чем происходит увеличение числа внутриклеточных паразитов (сравнение между моментами времени 24 h в Рисунок 3A и 3B). Задержка представляет собой время, необходимое для внутренней metacyclic promastigotes Сначала дифференцироваться в amastigotes перед началом репликации. Одна общая ошибка люди делают при использовании metacyclic promastigotes заразить, является не ждать достаточно долго. В тех случаях, когда изменения вирулентности не резким эксперименты свыше 96 h вместо 72 h производят намного более надежные решения.
Рисунок 1 : Сканирование электронная микрофотография изображений различных этапов жизни amazonensis л . Промастиготы лаг фазы, metacyclic Промастиготы от стационарной фазы и стерильных amastigote. Бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель Иллюстрация BMM инфицирования вирулентным стерильных amastigotes (A) и не вирулентные лаг фазы promastigotes (B) пункта amazonensis л. Иммунофлюоресценции изображения макрофагов, изолированных от мышей BALB/c , 1 h и 48 ч после инфицирования. Зараженные макрофаги были обработаны для иммунофлюоресценции, как описано в протоколе. PV мембраны окрашивали с крыса анти мыши Lamp1 моноклональные антитела (1:1, 000 разрежения) за 1 ч, после чего 1 ч инкубации с анти кролик флуоресцентные IgG (разбавления 1: 500). Пятнать паразита была исполнена инкубации с Поликлональные антитела мыши создается против стерильных л amazonensis coverslips amastigotes, следуют анти мыши IgG красный краситель (разбавления 1: 500) 6. Далее все coverslips лечили DAPI для окрашивания ядер. (A) формирование отдельных PVs, укрывательство несколько amastigotes в точке времени 48 h является характеристикой успешных лейшмании инфекции с стерильных amastigotes. B отсутствие отдельных PV формирования и тиражирование amastigotes в точке времени 48 h символизирует отсутствие вирулентности в promastigotes от лаг фазы культуры. Красный цвет означает наличие анти -лейшмании окрашивание, зеленый указывает анти Lamp1, синий указывает DAPI-окрашенных ДНК и желтый означает слияние анти Lamp1 и DAPI пятна. Бары, 5µm. Этот рисунок был изменен с Mittra, B. et al., 2013. Первоначально опубликовано в J. Exp. Med. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Удаление одной аллели LMIT1 сильно ухудшает внутриклеточных рост мутант паразитов LMIT1/Δlmit1 . Были инфицированы BMM для указанного раз с L.amazonensis и исправляются немедленно или дальнейшего инкубированы для 24, 48 или 72 часов, прежде чем они были исправлены, окрашенных с DAPI и микроскопически определялась количество внутриклеточных паразитов. (A) BMMs были заражены очищенный одичал типа (WT), один нокаут (LMIT1/Δlmit1) и дополняет один нокаут (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) metacyclic promastigotes (МВД 1:5) для 3 h и исправляются немедленно или инкубировали Далее для точки указанное время и количество внутриклеточных паразитов было определено микроскопически. Данные представляют собой среднее ± SD заключений в трех экземплярах и представитель результаты трех независимых экспериментов. Звездочки показывают существенные различия между WT и LMIT1/Δlmit1 паразитов в инфективности (Студенческая двустороннее t -тест 48 h, p = 0,017; 72 h, p = 0,008). (B) стерильных amastigotes от одичал тип (WT), Двухместный нокаут (LMIT1/Δlmit1) и дополняет один нокаут (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) культур были протестированы на их способность заразить BMMs. BMMs были инфицированы за 1 h (МВД 1:1) и либо фиксированной немедленно (1 ч) или после инкубации, 24, 48 или 72 часов и количество внутриклеточных паразитов было определено микроскопически. Данные представляют собой среднее ± SD заключений в трех экземплярах и представитель более трех независимых экспериментов. P-значения (двустороннее t критерия Стьюдента) между соответствующими группами указаны. Этот рисунок был изменен с Mittra, B. et al., 2016. Первоначально опубликовано в журнале PloS Pathog. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Количественные данные, подготовленные пробирного BMM инфекции, описанных выше, позволяет следователям получить показатели инфицирования и надежного определения изменения вирулентности свойств в относительно короткий период времени (максимум 2 недели, по сравнению с 2 месяцев, необходимых для экспериментов в естественных условиях ). Этот метод основывается на конкретных краситель ДНК DAPI, который специально пятна макрофагов и паразита ядер и позволяет быстрое выявление и количественная оценка инфицированных клеток. В сравнении другие пятна, такие как Гимза связывать большое количество различных клеточных компонентов с различной интенсивностью, осложняющих визуального анализа37. Использование DAPI позволяет признание внутриклеточных паразитов и их четкое различие от сотовых структур (только ядер клеток хозяина также витражи, и их размер является несколько порядков больше, чем паразита ядер), что позволяет проще и быстрее количественное определение инфекций.
Как и любой экспериментальной процедуры, этот метод имеет некоторые ограничения и несколько важных шагов, которые требуют тщательного исполнения. В естественных условиях лейшмании инфекции включает в себя комплекс врожденной иммунологической реакции до фагоцитоза, которая определяет окончательный курс инфекции38. Выбор модели мыши штамма, таким образом, имеет решающее значение в дизайн исследования. Штамм мышей C57BL/6 и BALB/c , используемые в этот протокол медведь мутации в гене шифруя протеин естественный сопротивление связанные макрофагов (Nramp1), измеряем протонного насоса, который translocates Fe2 + и Mn2 + ионы из макрофагов лизосомы/фаголизосомах в цитозоль. Это приводит к повышенной восприимчивости к патогенов, которые реплицируют внутри endocytic отсека макрофаги8,30,31. Успешной колонизации в макрофагах также зависит от уникальных заразные паразиты лейшмании способность манипулировать иммунного ответа, чтобы подавить и выжить макрофагов активации39,40. Дифференцированных макрофагов, используется для лейшмании BMM инфекций несколько мимических неактивированные состояние макрофагов в естественных условиях, но проба не учитывает гораздо более сложный набор хост компонентов, которые влияют вирулентности в Животные модели.
Изоляция здорового инфекционный лейшмании форм является другой абсолютно Критическое требование для определения точного вирулентности. Не все promastigotes всех лейшмании штаммов эффективно дифференцироваться в amastigotes при низких значениях рН / высокой температуры условия41. Следовательно инфекции часто проводятся с metacyclic promastigotes, очищенного от стационарных Промастиготы культур. Чтобы эффективно изолировать metacyclic promastigotes, некоторые стратегии очистки воспользуйтесь меняющегося состава поверхности Гликокаликс паразита в различных этапах жизни, включая обширные изменения lipophosphoglycan (СНГ) Структура42,,4344. Например арахиса агглютининов (PNA), Лектин, которая избирательно связывается с procyclic но не metacyclic LPG эффективно использовались в негативный выбор протоколов для очистки л основных metacyclic promastigotes45. Metacyclic Промастиготы очистки стратегия л amazonensis обычно включает mAb3A.1 моноклональное антитело, которое может склееных procyclic promastigotes ориентации epitopes конкретные поверхности белка, которые недоступны в metacyclic формы из-за поверхностного Гликокаликс модификации8,13,32. Использование градиента СМИ плотность отделить metacyclic promastigotes от promastigotes, основанный на стадии конкретных различий в плотности в плавучесть-привлекательный метод потому, что он не зависит от вегетационных вариации в паразита поверхности лигандами. Этот метод, первоначально описанных основных л metacyclic Промастиготы очистки33, была успешно принята нескольких других видов Leishmania главным образом путем изменения условий центрифугированием при градиент плотности седиментации46,47,48,49.
Важно также быть в курсе проблем, которые могут осложнить осуществление анализа, который может произойти в нескольких шагов в процессе. Эти проблемы могут включать в себя загрязнение во время извлечения BMM, неудачных дифференциация BMMs после извлечения, покрытий несовместимые макрофагов, неполной очистки форм инфекционный паразита, бедных или несовместимым инфекции, и трудности, монтаж стекла coverslips на скольжениях микроскопа. Эти возможности были рассмотрены в протоколе и могут быть решены путем тщательной оценки каждого шага процедуры инфекции для выявления проблемы. Например загрязнение BMM культур во время процесса дифференцировки может указывать на необходимость улучшения стерильных во время извлечения. Пристальное внимание к чистоте и свежести очистки реагентов и точное выполнение очистки протокола может исправить неудачных или неполной очистки форм желаемого паразита. Бедных или несовместимым инфекции может быть вызвана неточной квантификации паразитов или МВД, что является слишком высокой или слишком низкой для конкретных экспериментальных условиях. После извлечения, манипулирования и монтаж стекла coverslips является вероятно наиболее технически сложный процесс в этой технике; люди могут найти, что они предпочитают использовать различные инструменты для облегчения обработки coverslips. Четкой визуализации DAPI окрашенных ядер имеет решающее значение для точной паразита, считая под микроскопом. Слабый окрашивание и неправильной фокусировки являются двумя главными виновниками позади несовместимым количественной оценки. Это можно обеспечить путем контроля качества DAPI пятнать шаг, ограничение времени освещенности для уменьшения обесцвечивания фото, и быстро изменяя объективную фокус для учета всех ядер паразита в области. Яркости флуоресценции DAPI также могут быть улучшены путем обеспечения надлежащего permeabilization образцов с моющим средством и увеличения концентрации DAPI во время окрашивания. Альтернативный подход, который может облегчить процесс количественной оценки — для получения цифровых изображений образцов при микроскопическом исследовании. Изображения могут быть использованы для количественной оценки на более позднее время и может быть проверена/количественно независимых следователей. Однако есть технические трудности, связанные с этим процессом, который требует тщательного рассмотрения. Благодаря сферической природе П.В. паразиты, не всегда в одной фокальной плоскости. Это требует несколько изображений быть приобретены с использованием различных фокальной плоскости для каждого поля, микроскопические и впоследствии собраны вместе, чтобы учетная запись для всех паразитов. В противном случае Квантификация от фотографий может быть очень вводит в заблуждение. Вычисления макрофагов/поля и amastigotes/имеют решающее значение для обеспечения последовательного макрофагов покрытие и распространение паразитов было достигнуто во время инфекции. Так как BMMs полностью дифференцированных клеток, их количество не должно увеличиваться со временем. Если количество принимающих макрофаги увеличивается с течением времени, это означает, что макрофаги были еще незрелой. В этом случае источник и концентрация M-CSF должны быть проверены. Определение процента зараженные макрофаги также может быть полезным в предоставлении всеобъемлющее представление о принимающей ячейки возбудитель взаимодействия, особенно в тех случаях, когда процент нагрузки инфекции и паразитов не следуют аналогичные тенденции20,21 .
Метод заражения в vitro BMM подробно здесь могут быть изменены в соответствии с потребностями конкретных экспериментальных. Могут вноситься изменения в любой из основных этапов процесса - BMM извлечения и дифференциации, очистки форм инфекционный паразита, а количественная оценка в пробирке макрофагов инфекций, а также реализации инфекции с различными Проанализированы MOIs и корректировки в период инфекции и моменты времени. Компоненты культуры средств массовой информации также могут быть легко изменены через добавок или истощения определенных питательных веществ, и несколько различных штаммов или форм паразитов могут быть оценены одновременно. Эти изменения могут потребовать дополнительной корректировки технических процедур; например процедуры для подготовки amastigote и metacyclic Промастиготы очистки, как ожидается, варьируются от различных видов Leishmania . Дополнительные флуоресцентных красителей помимо DAPI или дневно тегами клетчатых компонентов могут быть использованы для визуализации широкий спектр паразито хозяинных взаимодействия процессов6,24. Кроме того этот assay может быть адаптирована к высокой пропускной способности систем (HTS) формат, который позволит для быстрого скрининга составные библиотек для идентификации приводит новый и эффективный препарат для лечения лейшманиоз24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов,
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грант RO1 AI067979 NWA.
YK является получателем Бакалавриат стипендии от Говард Хьюз медицинский институт/Университет Мэриленд, Колледж Парк.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
