Summary
يقيم جميع الأنواع الليشمانيا المسببة للأمراض وتكرارها داخل الضامة مضيفيهم الفقاريات. نقدم هنا، بروتوكولا لتصيب موريني الضامة المشتقة من نخاع العظام في الثقافة مع ليشمانيا، متبوعاً بالقياس الكمي الدقيق لحركية النمو داخل الخلايا. يعد هذا الأسلوب مفيداً لدراسة العوامل الفردية التأثير على التفاعل المضيف الممرض وضراوة الليشمانيا .
Abstract
دورة حياة الليشمانيا، المسبّب لداء الليشمانيات، التبديل بين المراحل بروماستيجوتي وأماستيجوتي داخل الحشرة والمضيفين الفقارية، على التوالي. بينما يمكن أن تختلف الأعراض المسببة لداء الليشمانيات على نطاق واسع، من آفات جلدية حميدة لأشكال المرض الحشوي فادح جداً تبعاً للأنواع المعدية، جميع أنواع الليشمانيا يقيمون داخل الضامة المضيف أثناء مرحلة الفقاريات حياتها. ليشمانيا العدوى ولذلك ارتباطاً مباشرا بقدرته على غزو، والبقاء على قيد الحياة وتكرارها داخل فاكوليس باراسيتوفوروس (PVs) داخل الضامة. وهكذا، تقييم قدرة الطفيليات تكرار إينتراسيلولارلي يخدم كوسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحديد ضراوة. دراسة تطوير داء الليشمانيات باستخدام نماذج حيوانية مضيعة للوقت وشاقة وغالباً ما تكون صعبة، لا سيما مع أشكال الحشوي باثوجينيكالي الهامة. يصف لنا هنا منهجية لمتابعة تطور ليشمانيا داخل الخلايا في نخاع العظام المستمدة الضامة (بنغلادش). أرقام الطفيليات داخل الخلايا مصممون على فترات ح 24 عن ح 72-96 بعد الإصابة. يسمح هذا الأسلوب لتحديد آثار مختلف العوامل الوراثية في الفوعة ليشمانيا موثوق بها. على سبيل مثال، نعرض كيفية حذف اليل واحد من الجينات ليشمانيا Mitochondrial الحديد الناقل (LMIT1) يضعف قدرة سلالة متحولة ليشمانيا أمازونينسيس LMIT1/ΔLmit1 تنمو داخل بنغلادش، مما يعكس انخفاض حاد في الفوعة بالمقارنة إلى البرية من نوع. كما يسمح هذا الفحص مراقبة دقيقة للظروف التجريبية، التي يمكن التلاعب بها على حدة لتحليل تأثير العوامل المختلفة (المواد الغذائية، والأنواع الأكسجين التفاعلية، إلخ.) على التفاعل الممرض المضيف. ولذلك، التنفيذ المناسب والتحديد الكمي للدراسات الإصابة بم توفير بديل غير الغازية، والسريع، واقتصادا، ومأمونة وموثوقة للدراسات النموذجية الحيوانية التقليدية.
Introduction
داء الليشمانيات يشير إلى طائفة واسعة من الأمراض البشرية التي تسببها الأنواع الطفيليات الأوالي من جنس الليشمانيا. ما يقرب من 12 مليون شخص مصابون حاليا الليشمانيا في جميع أنحاء العالم، وأكثر من 350 مليون معرضة للخطر. باثولوجيا المرض يعتمد على الأنواع الليشمانيا وعوامل المضيف، وأعراض تختلف من آفات الجلد الشفاء الذاتي حميدة إلى أشكال فيسسيراليزينج الفتاكة. إذا كان داء الليشمانيات الحشوي غير المعالجة، وفادح، الترتيب إلا بعد الملاريا كأشد الأمراض فتكاً البشرية الناجمة عن العدوى مع بروتوزوا1. وعلى الرغم من الاختلافات الواسعة النطاق في علم الأمراض الأمراض والأعراض، يكون جميع الأنواع الليشمانيا دورة حياة ديجينيك بالتناوب بين مراحل بروماستيجوتي وأماستيجوتي داخل الحشرات والفقاريات المضيفين، على التوالي. داخل الفقاريات، ليشمانيا استهداف الضامة المضيف للغزو والحث على تشكيل باراسيتوفوروس فاكوليس (PVs)، المقصورات الحمضية مع خصائص فاجوليسوسوميس فيها تكرار النماذج أماستيجوتي ضراوة شديدة. Amastigotes تستمر في أنسجة المضيف أثناء الالتهابات المزمنة ويمكن تمرير ويلكم إلى الأمام لمصابه، استكمال دورة انتقال. ولذلك، في سياق التنمية البشرية من المرض، amastigotes هي دورة حياة الليشمانيا أهم نموذج2. التحقيق في كيفية تكرار amastigotes داخل بلعم PVs أمر بالغ الأهمية لفهم ليشمانيا الفوعة3،،من45،،من67 تطوير العلاجات الناجعة الرواية.
يصف لنا هنا أسلوب يستخدم بانتظام لدينا مختبر لدراسة ليشمانيا العدوى وتكرارها في المشتقة من نخاع العظم الضامة (بنغلادش)، الذي ينطوي على تقييم كمي لعدد داخل الخلايا ليشمانيا على مر الزمن. وتنطوي العملية على حصاد وحيدات من نخاع العظام الماوس والتمايز الضامة في الثقافة، والعدوى في المختبر مع أشكال المعدية (بروماستيجوتيس ميتاسيكليك أو amastigotes) الليشمانيا والتحديد الكمي عدد الطفيليات داخل الخلايا في كل فاصل زمني 24 ساعة لمدة 72-96 ساعة بعد الإصابة. وقد استخدمت هذا التحليل في المختبر لتحديد تأثير عدد من العوامل البيئية والجينات الطفيلي، بما في ذلك تحديد الدور الحاسم للحديد في النهوض بضراوة أمازونينسيس L. كذلك التحقق من صحتها قبل قاطع الدراسات الإنمائية الآفة في الفئران6،،من89،10،11،،من1213،14،15 . منذ إنشاء جميع أنواع الليشمانيا المسببة للأمراض مكانها replicative داخل الضامة المضيف، يمكن استخدام هذا التحليل عالمياً لقرارات الفوعة في جميع الأنواع الليشمانيا .
أداء التهابات بم يسمح تحليل تفاعلات الطفيلي المضيف على مستوى الخلية الواحدة، وبالتالي فهم أكثر شمولاً لكيفية تفاعل طفيليات الليشمانيا مع بهم المكروية المضيف المفضل، PVs الضامة. استخدمت بلعم فحوصات الإصابة بنجاح قبل عدة مجموعات16،17،18،19،20،،من2122 لاستكشاف وظائف بلعم المضيف و ليشمانيا جينات محددة، ومشاركتها المحتملة في التفاعل المعقد الذي يميز العدوى داخل الخلايا. التهابات بم تسمح للتقدير الكمي لنمو الطفيلي كقراءة تأثير العوامل المضيفة التي تؤثر على البقاء داخل الخلايا، مثل إنتاج أكسيد النيتريك المبيدة وتوليد الأنواع الأكسجين التفاعلية وغيرها من الظروف المعاكسة واجه داخل PVs يحلول تشبه23. كما استخدمت بلعم فحوصات الإصابة لتحديد إمكانية اللايشماني مكافحة المخدرات يؤدي للتنمية العلاجية13،24.
طبيعة الإصابات بم في المختبر يوفر العديد من المزايا عبر طرق أخرى لتقييم ليشمانيا ضراوة. ومع ذلك، العديد من الدراسات السابقة دراسة آليات لبقاء الطفيليات داخل الخلايا مع مرور الوقت لا كمياً الإصابة بمعدل20،،من2124. وعلاوة على ذلك، العديد من الدراسات التي تركز على أثر الإصابات في فيفو على مر الزمن فعلت ذلك بقياس حجم الآفة الجلدية والأعراض الفسيولوجية الأخرى التي تتصل بشكل غير مباشر فقط الطفيلي النسخ المتماثل25،26 , 27-العدوى في فيفو نهجاً صارمة لتقييم الفوعة الطفيلي، ولكن قياسات حجم الآفة استناداً إلى قاطع تورم وحدها غالباً ما تكون غير كافية، كما أنها تعكس استجابة التهاب في الأنسجة المصابة ولا العدد المطلق للطفيليات. ولهذا السبب، قاطع الآفة التنمية فحوصات يجب أن يكون متبوعاً التحديد الكمي للتحميل الطفيلي في الأنسجة المصابة، وهو إجراء يتطلب إضعاف الحد مطولة فحوصات28. بالإضافة إلى ذلك، دراسات في فيفو غالباً ما تنطوي على التضحية بالحيوانات متعددة في نقاط مختلفة في الوقت المناسب لانتزاع الأنسجة لفائدة6،،من89،10، 11 , 13-على النقيض من ذلك، يمكن الحصول على إعداد كبيرة من بنغلادش من الحيوان واحدة فقط، ويمكن أن يكون مطلي بهذه الخلايا في ظل الظروف التي تسمح بتقييم الإصابة في نقاط مختلفة في الوقت المناسب. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع دراسات في فيفو ، أداء في المختبر العدوى بم يسمح سيطرة أكبر على الظروف التجريبية. التحديد الكمي الضامة تصاب جنبا إلى جنب مع الطفيليات نفسها يتيح مراقبة دقيقة لتعدد العدوى (وزارة الداخلية) وشروط الثقافة. يمكن التحكم الجيد في هذه العوامل الرئيسية في تحديد الخصائص للمسارات الخلوية المنفصلة وفهم تأثيرها على مسار العدوى.
ونظرا لهذه المزايا، فمن الدهشة أن مجموعات قليلة جداً دراسة الفوعة ليشمانيا اتخذت حتى الآن الاستفادة الكاملة من التقييم الكمي للنسخ المتماثل داخل الخلايا في الضامة. في هذه المقالة، نحن نناقش المزالق الشائعة التي قد تعوق استخدام أوسع نطاقا لهذا الفحص، ويوفر بروتوكول خطوة بخطوة لتسهيل التنفيذ السليم. النظر دقة وبراعة، المقايسة الإصابة بم يصف لنا هنا يمكن ليس فقط استخدامها لاستكشاف التفاعلات المضيف الممرض التأثير ليشمانيا الفوعة، ولكن أيضا لدراسة الكائنات المجهرية الأخرى التي النسخ المتماثل داخل الضامة29. الأهم من ذلك، يمكن أيضا تطوير هذا الفحص كأسلوب فحص السريري قبل سريعة واقتصادية للتنمية اللايشماني مكافحة المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أقرت إياكوك من جامعة ميريلاند في جميع الإجراءات التجريبية وأجريت وفقا للتوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "المعاهد الوطنية للصحة". كافة الخطوات الموضحة في الأقسام من 1 إلى 4 وينبغي أسيبتيكالي داخل خزانات الاندفاق الصفحي البيولوجية. ينبغي أن تستخدم الحماية الشخصية، وينبغي توخي الحذر أثناء التعامل مع طفيليات الليشمانيا يعيش جميع مراحل التجريب.
1-العزلة والتمايز المشتقة من نخاع العظم الضامة (بنغلادش)8،،من3031
- اليوم 0: التضحية 4-أنثى عمرها 6 الأسبوع C57BL/6 أو الماوس بالب/ج في دائرة2 CO وتأكيد الوفاة عن طريق خلع عنق الرحم. ضمان التعقيم من المقص والملقط بإبقائها غارقة في الإيثانول 70%. رذاذ قفازات مع الإيثانول 70% السماح العقيمة مناولة طوال عملية عزل خلايا نخاع العظام.
- تأمين الماوس يضحي بتشريح المجلس بتعلق به الأمامية وتعقيمها بالرش قطته مع الإيثانول 70%.
- إجراء شق صغير (حوالي 1 سم) مع مقص القريبة الورك. عناية إدراج المقص تحت الجلد لفصل العضلات الأساسية وقطع الجلد على طول الطريق حول الورك.
ملاحظة: قد تكون استدارة المجلس تشريح للسماح بالوصول المحسنة إلى الورك. - ديجلوفي الجلد من الساق عن طريق سحب نحو الكاحل وإزالة بعناية. قطع القدم في الكاحل، يجري حذراً جداً قطع في أو أسفل الكاحل مشتركة ترك الساق سليمة تماما.
ملاحظة: الشظية في هذه المرحلة هو تعلق فضفاضة ويمكن فصلها بسهولة مع الملقط. - يدوياً تحديد موقع الورك عن طريق التلاعب في عظم الفخذ تحديد نقطة التعاقب. بعناية استخدام مقص لقطع ساقه فوق الورك إلى ترك رأس عظم الفخذ الدانية سليمة.
- إزالة العضلات والنسيج الضام أكبر قدر ممكن من الساق مع المقص. إزالة أي الجلد المتبقية من الكاحل وأي مواد العظام الزائدة فوق الورك.
- ضع عظام الساق تنظيفها في ربمي العقيمة وتستكمل مع البنسلين/ستربتوميسين (1% تركيز نهائي) في صحن بتري على الجليد.
- كرر الخطوات من 1.4 عن طريق 1.6 لعزل الساق والفخذ من الساق هند الأخرى.
- إزالة أي العضلات والنسيج الضام المتبقية من عظام مغطس في ربمي استخدام الملقط المعقم والعقيمة #10 بليد.
- مكان العظام على غطاء طبق بيتري. قطع الساق بعناية مع شفرة مباشرة فوق الكاحل للوصول النخاع. إزالة الساق من بقية الساق بقطع أسفل الركبة مباشرة.
- رسم 10 مل ربمي العقيمة وتستكمل مع البنسلين/ستربتوميسين (1% تركيز النهائي) إلى حقنه 10 مل وإرفاق إبرة 25 جرام.
- عقد الساق بقوة مع الملقط، عمودياً عبر أنبوب مخروطي 50 مل على الجليد. استخدام المحاقن بلطف ضخ حوالي 5 مل ربمي في نهاية العظام لمسح نخاع العظام من الطرف الآخر في أنبوب مخروطي. مسح نخاع العظام مع ما مجموعة 10 مل ربمي حتى العظم يتحول أبيض.
ملاحظة: بعد مسح شامل، ينبغي تحويل العظم الأبيض. إذا لم يكن الأمر كذلك، متابعة التنظيف لإزالة نخاع. نهاية الساق البعيدة قد تحتاج إلى يتم اقتطاعها مرة أخرى مع بليد إذا كان ضيق جداً لإدخال الإبرة. - قطع عظم الفخذ مباشرة فوق الركبة وفورا تحت الورك لفضح كل من طرفي للوصول النخاع العظام. مسح نخاع العظم من عظم الفخذ مع ما مجموعة 10 مل ربمي بنفس الطريقة كما الساق.
- كرر التنظيف ومسح الخطوات 1.6 من خلال 1.13 مع العظام المتبقية وجمع خلايا نخاع العظام مسح في أنبوب مخروطي واحدة 50 مل
ملاحظة: إذا كان يكسر العظام عند أي نقطة أثناء التشريح قبل التنظيف العظام، لا تستخدم النخاع من عظم هذا. - مسح الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية تستخدم لجمع نخاع العظام من كل العظام الأربعة لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في 300 x ز.
- ضع 60 مل من العقيمة بم المتوسطة (ربمي بتركيز نهائي من 20% FBS، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 1.2 مم نا-بيروفات، 25 ميكروغرام/مل م البشرية-CSF) إلى 175 سم2 قارورة ثقافة الخليوي مع كاب تصفية.
- تجاهل الطرد المركزي التالي طافية وريسوسبيند بيليه الخلية بلطيف صعودا وهبوطاً بيبيتينج استخدام 5 مل متوسطة بم من قارورة.
- نقل تعليق خلية إلى قارورة الثقافة وشطف الأنبوبة المخروطية مرتين مع المتوسطة بم من قارورة الثقافة لضمان استرداد خلية القصوى. ضمان دقة يخلط تعليق خلية في المتوسط وتوزيع 30 مل من قارورة ثقافة الخليوي2 سم 175 الأولى إلى ثانية 175 سم2 خلية ثقافة قارورة مع كاب عامل التصفية.
- احتضان كل قوارير تحتوي على تعليق خلية 30 مل كل ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 للسماح بفصل أي تلويث الليفية والضامة المقيم، والخلايا الأخرى ملتصقة.
- يوم 1: نقل المادة طافية تحتوي على خلايا غير متمايزة نخاع العظام من قوارير إلى 100 ملم × 15 ملم-التعامل مع TC البوليستيرين بيتري الأطباق في حوالي 10 مل/طبق واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO2. تجاهل في قوارير.
- يوم 3 أو 4: إضافة وسيلة بم إضافية 5 مل (استعد مسبقاً إلى 37 درجة مئوية) لكل طبق بيتري وتستمر الحضانة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2.
2-طلاء بنغلادش في كوفيرسليبس للعدوى (يوم 7 أو 8)
- إعداد لوحات زراعة الأنسجة 6-جيدا بوضع 4 أربعة العقيمة 12 ملم الزجاج كوفيرسليبس (يعقم والمخزنة في حاوية مغلقة من زجاج) في الجزء السفلي من كل فارغة أيضا.
ملاحظة: التقاط كل ساترة العقيمة 12 ملم مع تلميح يسفط مزودة بخط فراغ. ضع كوفيرسليبس في الآبار دون التداخل، الإفراج عن عند الموضع المطلوب معسر أنبوب للمقاطعة الفراغ. - أسبيراتي وسائل الإعلام (وأي الخلايا غير ملتصقة) من أطباق بيتري مغلفة بنخاع العظام ملتصقة المستمدة الضامة بلطف الخلايا ملتصقة شطف x 2 مع العقيمة دولبيكو الفوسفات مخزنة المالحة دون كلوريد الكالسيوم والمغنيسيوم (برنامج تلفزيوني--/--) استعد مسبقاً إلى 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل معقمة 1 × برنامج تلفزيوني-/-بتركيز نهائي من 1 مم أدتا إلى كل طبق بيتري دروبويسي، واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية لفصل ملتصقة بنغلادش. تحقق من أن الخلايا هي منفصلة باستخدام مجهر.
- جمع كل فصل خلايا معلقة في PBS 1 x-/-تستكمل مع 1 مم يدتا في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. شطف كل طبق x 2 مع 5 مل برنامج تلفزيوني-/-وإضافة إلى تجمع تعليق خلية.
ملاحظة: قد تضعف تعليق خلية مع برنامج تلفزيوني إضافي-/-لحماية الضامة من سمية يدتا أثناء عملية تجميع. - أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الضامة في المتوسط بم 5-10 مل من بيبيتينج. مكان حراكه الخلايا على الجليد لمنع المرفقات إلى أنابيب والتثاقل.
- عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق في هيموسيتوميتير.
ملاحظة: لعد الخلايا بم حراكه في المتوسط 5 مل، تمييع مزيجاً من 25 تعليق خلية ميليلتر في برنامج تلفزيوني ميليلتر 445-/-والحل تريبان الأزرق 0.4% 30 ميليلتر عادة يسمح سهلة القياس الكمي في هيموسيتوميتير (مع مراعاة عامل إضعاف 20 x للحساب النهائي ). عد الخلايا فقط لا تحصل الملون مع تريبان الأزرق (خلايا قابلة للتطبيق). قد يكون تغيير حجم الخلية تعليق إذا كان هذا الخليط جداً مركزة أو مخففة. بشكل عام، وعائد بم كل إعداد تتراوح بين 2 × 107 و 5 × 107 خلايا من ماوس واحدة. - إعداد تعليق خلية في المتوسط بم الطلاء المطلوب تركيز (5 × 105/mL) وتفريق تعليق على 6 لوحات جيدا في المتوسط 2 مل كل بئر حتى أن بعضهم يتلقى أيضا الضامة 1 × 106 .
ملاحظة: هذا هو خطوة حاسمة تكفل كل يحصل جيدا عدد كاف من الضامة لتغطية كوفيرسليبس شكل موحد. تحقق من أن كوفيرسليبس في الآبار غير متداخلة أو العائمة في الأجل المتوسط. إذا كان الأمر كذلك، ضبط بلطف مع تلميح ماصة معقمة. - تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
3-تنقية المعدية أشكال أمازونينسيس ل.
ملاحظة: تعد ليشمانيا للالتهابات-تنقية بروماستيجوتيس ميتاسيكليك من بروماستيجوتي ثابتة الثقافات8،13، أو تفرق بروماستيجوتيس في الثقافة في نموذج أماستيجوتي باستخدام معيار أمازونينسيس ل. التمايز أكسينيك البروتوكول6،8.
-
استخدام تنقية ليشمانيا ميتاسيكليك بروماستيجوتيس media(Materials) الكثافة المتدرجة 33
- إعداد حل الأسهم 40% من كثافة وسائل الإعلام التدرج في مياه معقمة وخالية من الذيفان.
- تمييع الحل كثافة التدرج في 10 x M199 المتوسطة (دون المصل) لإعداد تركيز 10% في المتوسط M199.
- تصفية جميع الحلول من خلال 0.22 ميكرومتر التصفية.
ملاحظة: يمكن تخزين الحلول الأسهم في 4 سج في الظلام للم يعد من شهر 1. - إضافة 2 مل من 40% كثافة وسائل الإعلام التدرج الحل في الجزء السفلي من أنبوب 15 مل المخروطية أجهزة الطرد المركزي.
- الطبقة 2 مل من محلول وسائط التدرج 10% كثافة في M199 فوق طبقة وسائط التدرج كثافة 40% بعناية، باستخدام ماصة باستور تجنب أي خلط بين الطبقتين.
- جمع 1 × 109 الطفيليات من ثقافة ثابتة-المرحلة بالطرد المركزي في 1,900 س ز لمدة 10 دقائق.
- ريسوسبيند الخلايا في تعديل الأساسية المتوسطة (دميم 6 مل دولبيكو).
- الطبقة 2 مل تعليق خلية مباشرة أعلى 10% كثافة طبقة التدرج في وسائل الإعلام، بلطف، استخدام ماصة باستور تجنب الخلط بين الطبقات.
- الطرد المركزي التدرج لمدة 10 دقيقة في 1,300 س ز في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: بسبب الاختلافات في الخواص الفيزيائية بين الأنواع الليشمانيا ، شروط الطرد المركزي لكل قد تعدل قليلاً لضمان أقصى غلة. - جمع الطفيليات (التخصيب في شكل metacyclic promastigote) من الفرقة تشكلت في حدود التدرج الإعلامي الأعلى 10% كثافة (واجهة بين 0% و 10% كثافة وسائل الإعلام متدرجة الطبقات).
- تمييع الطفيليات مع حجم واحد من دميم وجمع بالطرد المركزي (ز س 1,900 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة).
- ريسوسبيند في 500 ميليلتر دميم المتوسطة والاعتماد في هيموسيتوميتير لقياس العائد.
-
جيل amastigotes أمازونينسيس L. تحت الظروف الثقافة أكسينيك (pH منخفضة/مرتفعة الحرارة)6،،من813
- استخدام 25 سم2 قوارير (متوسط إجمالي 10 مل) مل 5 ميكس المرحلة سجل promastigote الثقافة (درجة الحموضة 7.4 في 26 سج) مع حجم متساوية من أماستيجوتي المتوسطة (pH 4.5)، واحتضان عند 26 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- التحول قارورة من 26 درجة مئوية إلى 32 درجة مئوية.
- بعد 3 أو 4 أيام، تقسيم الثقافة 1:5 في وسائل الإعلام أماستيجوتي في 32 درجة مئوية.
- فحص الطفيليات في 3-4 خلال الأيام القادمة (7 أيام كحد أقصى) لمعرفة ما إذا كانت جاهزة للاستخدام في حالات العدوى.
ملاحظة: يجب أن يكون amastigotes أكسينيك صحية على شكل بيضاوي، دون سياط مرئية. وقد amastigotes متمايزة جزئيا شكل بيضاوي كبير بسياط قصيرة. الثقافة لا ينبغي أن يكون الكثير من كتل-العديد من كتل مؤشرا على عدم النمو، موت الطفيليات. يمكن تقسيم 1:5 ثقافة أماستيجوتي وصيانتها لمدة أقصاها 3 أسابيع.
4-العدوى مع أمازونينسيس ل.
- تمييع المعلقات الطفيلي ووفقا لوزارة الداخلية المطلوب (عادة 3-5 ميتاسيكليك بروماستيجوتيس الواحد بلعم [موي من 1:3 أو 1:5]) وأماستيجوتي 1 كل بلعم [موي 1:1]. إضافة الليشمانيا في برنامج تلفزيوني-/-في مجلد من 50-100 ميليلتر لكل بئر الفعل الذي يتضمن متوسطة 2 مل.
- احتضان بنغلادش ح 1 مع amastigotes وح 3 مع بروماستيجوتيس ميتاسيكليك في 34 سج للعدوى.
ملاحظة: قد تختلف درجات الحرارة المثلى الإصابة بالأنواع. - بعد الحضانة، دقة يغسل الطفيليات الحرة في كل س 3 جيدا مع 2 مل برنامج تلفزيوني-/-المعالجون مسبقاً إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تفريق برنامج تلفزيوني برفق التأكد من أن كوفيرسليبس لا تطفو فوق بعضها البعض. بلطف دوامة اللوحة وثم نضح بها السائل. استخدام تلميح يسفط منفصلة إذا كان استخدام سلالات متعددة من الطفيليات لتجنب التلوث المتبادل. - إصلاح ح 1 أو 3 ح عينات النقطة الزمنية التي تفرخ كل جيدا مع مل 1.5-2% 2 يغسل منهاج العمل في برنامج تلفزيوني-/-لأدنى 10 x 3 مع برنامج تلفزيوني-/-. لا نضح يغسل الماضي ولوحات تحتوي على كوفيرسليبس في برنامج تلفزيوني حتى تلطيخ في الثلاجة.
- إضافة 2 مل الطازجة بم المتوسطة لكل بئر على لوحات للمزيد من النقاط الزمنية واحتضان في 34 درجة مئوية.
- إصلاح النقاط الزمنية المتبقية المطلوبة كما هو موضح في الخطوة 4، 3، ولوحات في الثلاجة حتى تلطيخ.
5-DAPI تلطيخ وتصاعد ساترة
- نضح برنامج تلفزيوني من الآبار التي تحتوي على كوفيرسليبس وإضافة 1.5 مل برنامج تلفزيوني-/-مع المنظفات غير الأيونية 0.1%. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، تليها غسل 3 x مع 2 مل برنامج تلفزيوني-/-.
- أضف 1 مل برنامج تلفزيوني-/-مع 2 ميكروغرام/مل DAPI (المخفف من حل الأسهم 5 ملغ/مل في الماء) للآبار التي تحتوي على كوفيرسليبس واحتضانها لآخر ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: فترة الحضانة مع DAPI أمر حاسم للتصور السليم لطفيليات الليشمانيا داخل الخلايا. بلعم نويات وصمة عار سريعاً، نظراً لحجم أكبر والحمض النووي المحتوى ولكن تلطيخ نويات الطفيليات داخل الخلايا أبطأ. وبالتالي، تمديد الوقت حضانة يتجاوز ما هو مطلوب لتصور الأنوية بم ضروري للسماح DAPI أن تتخلل من خلال غشاء البلازما الطفيلي، والغشاء النووي الطفيلي. بمناسبة DAPI وصمة، كينيتوبلاست الميتوكوندريا الحمض النووي قرب جيب فلاجلر الطفيليات يمكن أيضا تصور، بالإضافة إلى الحمض النووي. - أغسل كل جيدا يحتوي على كوفيرسليبس 3 x 2 مل برنامج تلفزيوني-/-ورفع آنذاك وكوفيرسليبس الوجه بالملقط وضع الجانب خلية لأسفل وجبل على الزجاج المجهر الشرائح مع كاشف تصاعد أنتيفادي متاحة تجارياً.
ملاحظة: كوفيرسليبس هشة للغاية، وتحتاج إلى التعامل مع الحذر. تجنب الضغط عليها، لا سيما ضد جدار الآبار عند رفع. إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني-/-يقلل من التوتر السطحي بين ساترة وجيدا ويسهل عملية الرفع. يمكن استخدام إبرة مقياس جيد للمساعدة في التحديق في كوفيرسليبس من أسفل البئر. بعد وضع ساترة على الشريحة، اضغط برفق إلى أسفل مع الملقط على طرد أي فقاعات الهواء في وسائل الإعلام المتزايدة. إذا كانت ساترة مكسورة أو ربما قد انقلبت أثناء عملية الرفع، لا قم بإعادة تحميل؛ ببساطة استخدام ساترة الرابعة قطع الغيار. - بردت الشرائح حتى القياس الكمي.
6-الإصابة بالتحديد الكمي
- دراسة DAPI الملون الشرائح تحت مجهر الأسفار بالتركيز على استخدام عدسة الهدف X 100 مع زيت الغمر الضامة (الإثارة في 358 نانومتر؛ والانبعاثات الأمثل في 461 nm).
ضمان أن يتم التركيز على طبقة الضامة بين الشرائح الزجاجية وساترة. - التحديد الكمي لعدد الضامة (نواة كبيرة ملطخة DAPI) وعدد الأنوية أماستيجوتي أصغر تتجمع حول كل نواة بلعم (انظر الشكل 2 أ، DAPI) لكل مجال الرؤية، باستخدام عداد يدوي.
ملاحظة: نوى أماستيجوتي قد لا تكون كلها مرئية في طائرة واحدة من التركيز بسبب صغر حجمها. عد تلك التي تظهر عندما ركزت على نويات بلعم، وثم استخدم تركيز جيد للتحقق من وجود نويات الطفيلي في الطائرات المذكورة أعلاه وأدناه الأنوية بلعم. - الانتقال إلى آخر مجال الرؤية لتكرار القياس الكمي. استخدام مفتاح عداد منفصل لتعقب عدد الحقول التي تم عدها. التنقل خلال الحقول البصرية في صفوف موازية عبر كل ساترة، للحيلولة دون العد التداخل.
- تحديد الحد أدنى من 200 الضامة كل ساترة. تحديد حجم كل الوقت نقطة الإصابة في ثلاث نسخ (كوفيرسليبس 3). عد ساترة الرابعة إذا لم يكن أحد من السابق مناسبة لعد بسبب تداخل ساترة، تصاعد الفقراء، وكسر الزجاج، إلخ
ملاحظة: إذا كان لا يمكن عدها الضامة 200 في أي واحدة ساترة، عد قطع الغيار الرابع. - حساب معدلات الإصابة الضامة بلعم amastigotes/أو amastigotes/100 وتحديد نسبة الضامة المصابة من البيانات الخام القياس الكمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ليشمانيا بشكلين المعدية-بروماستيجوتيس ميتاسيكليك التي تميز من بروماستيجوتيس بروسيكليك في المرحلة ثابتة للثقافة، و amastigotes، وهي مراحل داخل الخلايا (الشكل 1). في بعض الأنواع الليشمانيا مثل ل. أمازونينسيس، amastigotes يمكن أيضا أن تكون متباينة في الثقافة أكسينيك بتحويل الخلايا بروماستيجوتي إلى انخفاض الأس الهيدروجيني (4.5) ودرجة حرارة مرتفعة (32 درجة مئوية) وظروف مماثلة لتلك التي عثر عليها داخل PVs بم 8 , 34-فقط قادرة على حمل تشكيل PVs وتكرار إينتراسيلولارلي بعد يجري اجتاحت ذلك المضيف الضامة35من ليشمانيا أشكال بروماستيجوتي أو أماستيجوتي ميتاسيكليك. بروماستيجوتيس المرحلة سجل غير متمايزة غير خبيثة وغير قادر على تشجيع تشكيل PV (الشكل 2).
وفي حالة الإصابات مع بروماستيجوتيس ميتاسيكليك، عادة ما يكون هناك مهلة 24 ساعة قبل زيادة عدد الطفيليات داخل الخلايا. وهذا يحدث لأن بروماستيجوتيس ميتاسيكليك أول من تفرق في amastigotes قبل أن تبدأ النسخ المتماثل. ولهذا السبب، الإصابات بدأت مع بروماستيجوتيس ميتاسيكليك سوف يستغرق وقتاً أطول تظهر زيادات في الأرقام الإجمالية الطفيليات داخل الخلايا، ولهذا السبب، قد تكون المحتضنة لنقاط زمنية أطول.
يمثل الشكل 2A متباينة عدوى ناجحة باستخدام أكسينيكالي amastigotes، عرض الترجمة داخل الخلايا من ليشمانيا (باللون الأحمر) بعد الإصابة الأولية (ح 1)، قبل تشكيل PVs بمزيج فاجوسوميس مع ليسوسوميس. في 48 ساعة، ويمكن ملاحظة PVs كبيرة متميزة تأوي الطفيليات متعددة. زيادة مطردة في عدد الطفيليات داخل PVs سمة من ضراوة ليشمانيا العدوى. سجل عدم ضراوة-المرحلة بروماستيجوتيس (الشكل 2)، على النقيض من ذلك، غير قادر على بدء التنمية PV (ح 48 نقطة الوقت)، تفشل النسخ المتماثل ويقتلون في نهاية المطاف داخل الضامة المضيف، حتى عند تناول الضامة المضيف في أرقام قابلة للمقارنة بروماستيجوتيس ميتاسيكليك أو amastigotes.
لإثبات فعالية هذا الأسلوب، قارنا البرية من نوع أمازونينسيس لام مع الطفيليات LMIT1/ΔLmit1 التي تحتوي على نسخة واحدة من LMIT1 (ايشمانيال مإيتوتشوندريال أنارون تي رانسبورتير 1) الجينات، مما يؤدي إلى الأضرار بالحديد المتقدرية استيراد13. فقدان أحد LMIT1 اليل لم تسفر عن تغييرات كبيرة النشاط الميتوكوندريا في بروماستيجوتيس LMIT1/ΔLmit1 أو تقليل عائد أشكال metacyclic المنقي عند مقارنتها بالبرية من نوع بروماستيجوتيس13. كانت نفس القدر من الفعالية في غزو بنغلادش، استناداً إلى عدد مماثل من الطفيليات داخل الخلايا كمياً ح 1 بعد الإصابة ( بروماستيجوتيس ميتاسيكليك المنقي من البرية من نوع (WT) والثقافات ثابتة LMIT1/ΔLmit1 الشكل 3A، ح 1). عقب الفارق الزمني أولى 24 ساعة، ما مطلوب بروماستيجوتيس ميتاسيكليك على التكيف وتفرق في أشكال أماستيجوتي، زيادة ثابتة في العدد من داخل الخلايا البرية من نوع الطفيليات (3-fold تقريبا بين 24 ساعة والنقاط الزمنية ح 72) كان ولاحظ. وفي المقابل، لوحظ النمو داخل الخلايا قليلاً أو لا للطفيليات LMIT1/ΔLmit1 (قارن النقاط الزمنية ح 1 وح 72)، مما يوحي بأن فقدان واحد LMIT1 اليل إلى حد كبير يؤثر على قدرة هذه السلالة تنمو داخل الضامة. التعبير ابيسومال من البروتين LMIT1 في سلالة يكمل (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) إنقاذ نمو الطفيليات داخل الخلايا لمستويات البرية من نوع، مما يؤكد أن LMIT1 أمر حاسم أماستيجوتي داخل الخلايا النسخ المتماثل وضراوة13.
بلعم الالتهابات التي نفذت مع amastigotes أكسينيك، التي تم إنشاؤها عن طريق تحويل الثقافات promastigote (في درجة الحموضة 7.4؛ 26 سج) لظروف النمو amastigotes (الرقم الهيدروجيني 4.5; 32 سج)34،36، أظهر تحقيق نمو داخل الخلايا نمط (الشكل 3B) مماثلة للتي لوحظت مع بروماستيجوتيس ميتاسيكليك (الشكل 3A). بعد مستويات مماثلة من امتصاص الأولى (الشكل 3B، ح 1) البرية من نوع (WT) ويكمل LMIT1 (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) amastigotes ونما باطراد، في حين amastigotes LMIT1/ΔLmit1 مرة أخرى فشل لإظهار النمو داخل الخلايا. كانت المعدية أكثر (موي 1:1 بالمقارنة مع 1:5 بروماستيجوتيس ميتاسيكليك) amastigotes أكسينيك وتكرارها أكثر كفاءة داخل Pv.
لدينا بيانات تثبت حدوث تأخير ح 24 أولية للعدوى بروماستيجوتي ميتاسيكليك، قبل أن يكون هناك زيادة في عدد الطفيليات داخل الخلايا (قارن بين النقاط الزمنية 24 ح في الشكل 3A و 3B). ويمثل الفارق الوقت اللازم بروماستيجوتيس ميتاسيكليك المدخلة تفرق أولاً في amastigotes قبل البدء في إجراء نسخ متماثل. واحد جعل الناس الخطأ الشائعة عند استخدام بروماستيجوتيس ميتاسيكليك لتصيب، ليس الانتظار طويلاً بما يكفي. في الحالات التي لا يكون فيها التغيير في الفوعة جذرية، أجريت تجارب أكثر من 96 ساعة بدلاً من 72 ح تنتج قرارات موثوق بها أكثر بكثير.
الشكل 1 : مسح الصور إلكترون صورة مجهرية لمختلف مراحل الحياة ل. أمازونينسيس . سجل-المرحلة بروماستيجوتي، بروماستيجوتي ميتاسيكليك من أماستيجوتي المرحلة ثابتة وأكسينيك. بار = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : توضيح ممثل للإصابة بم بضراوة amastigotes أكسينيك (A) وسجل غير ممرض-المرحلة بروماستيجوتيس (ب) من أمازونينسيس ل.- صور الفلورة الضامة المعزولة من الفئران بالب/ج ، ح 1 و 48 ساعة بعد الإصابة. تجهيز الفلورة الضامة المصابة كما هو موضح في البروتوكول. كانت ملطخة أغشية PV الفئران الماوس المضادة Lamp1 [مونوكلونل] جسم (1:1، 000 تمييع) ح 1، تليها الحضانة ح 1 مع أرنب المضادة مفتش الفلورسنت (تخفيف 1: 500). تلوين الطفيلي كان يؤديها في حضانة كوفيرسليبس مع الماوس [بولكلونل] أجسام ولدت ضد أكسينيك أمازونينسيس ل. amastigotes، متبوعاً بالماوس المضادة IgG الأحمر صبغ (1: 500 تمييع) 6. كذلك يعاملون جميع كوفيرسليبس مع DAPI لتلطيخ الأنوية. (أ) تشكيل PVs متميزة إيواء amastigotes متعددة في وقت ح 48 نقطة هو السمة لمرض الليشمانيا ناجحة مع amastigotes أكسينيك. (ب) عدم وجود تشكيل PV متميزة وتكرار amastigotes في النقطة الزمنية ح 48 يجسد انعدام الفوعة في بروماستيجوتيس من ثقافة المرحلة سجل. الأحمر يشير إلى مكافحة--ليشمانيا تلطيخ، الأخضر يشير إلى مكافحة Lamp1 والأزرق يشير إلى الحمض الخلوي الصبغي الملون DAPI والأصفر يشير إلى دمج لمكافحة Lamp1 والبقع DAPI. أشرطة، 5µm. لقد تم تعديل هذا الرقم من ميترا، باء- et al.، عام 2013. نشرت أصلاً في ميد ياء [ااكسب]. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : حذف أحد LMIT1 اليل شدة يعوق نمو متحولة LMIT1/Δlmit1 الطفيليات داخل الخلايا. بم كانت مصابة ليدل الأوقات مع L.amazonensis وأما إصلاحها فورا أو زيادة المحتضنة ل 24، 48 أو 72 ساعة قبل أنها كانت ثابتة، ملطخة DAPI، وتم تحديد العدد الطفيليات داخل الخلايا مجهريا. (أ) بنغلادش كانوا مصابين بتنقية البرية من نوع (WT)، واحد بالضربة القاضية (LMIT1/Δlmit1) واستكمال خروج المغلوب واحد (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) بروماستيجوتيس ميتاسيكليك (موي 1:5) ح 3 وإصلاحها فورا أو المحتضنة كذلك النقاط الزمنية المشار إليها، والعدد من الطفيليات داخل الخلايا مصممة مجهريا. البيانات تمثل ± يعني SD من ثلاث قرارات وهي الممثل لنتائج ثلاث تجارب مستقلة. وتشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة في العدوى بين الطفيليات WT و LMIT1/Δlmit1 (الطالب ثنائي الطرف تي-اختبار 48 ح، ف = 0.017; 72 ح، ف = 0، 008). (ب) amastigotes أكسينيك من البرية من نوع (WT) وواحد بالضربة القاضية (LMIT1/Δlmit1) واستكمال خروج المغلوب واحد (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) الثقافات تم اختبار لقدرتها على نقل العدوى إلى بنغلادش. بنغلادش أصيبوا ل 1 ح (موي 1:1)، وأما ثابت فورا (ح 1) أو بعد مزيد من الاحتضان 24، 48 أو 72 ساعة، والعدد من الطفيليات داخل الخلايا وقد يتقرر مجهريا. البيانات تمثل ± يعني SD من ثلاث قرارات وممثل من أكثر من ثلاث تجارب مستقلة. يتم الإشارة إلى فالقيم (الطالب ثنائي الطرف الاختبار t) بين المجموعات المعنية. لقد تم تعديل هذا الرقم من ميترا، باء- et al., 2016. نشرت أصلاً في لوس باثوج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البيانات الكمية المنتجة بفحص الإصابة بم الموصوفة أعلاه، يسمح للمحققين الحصول على معدلات الإصابة وتحديد التغيرات في خصائص الفوعة موثوق بها في فترة زمنية قصيرة نسبيا (الحد الأقصى 2 أسابيع، مقارنة إلى 2 أشهر المطلوبة لإجراء تجارب عليها في فيفو ). ويعتمد هذا الأسلوب على صبغ الحمض النووي محددة DAPI، على وجه التحديد البقع نويات بلعم والطفيلي، ويتيح التعرف السريع والتقدير الكمي للخلايا المصابة. وبالمقارنة، ربط البقع الأخرى مثل جيمسا لعدد كبير من المكونات الخلوية المختلفة بدرجات متفاوتة، إلى تعقيد التحليل المرئي37. يسمح استخدام DAPI الاعتراف بالطفيليات داخل الخلايا، وعلى تمييز واضح من الخلوية هياكل (فقط ملطخة نويات الخلايا المضيفة أيضا، وحجمها عدة أوامر من حجم أكبر من نويات الطفيلي)، يسمح أسهل وأسرع التحديد الكمي للعدوى.
كما هو الحال مع أي إجراء تجريبي، بهذا الأسلوب بعض القيود والعديد من الخطوات الحاسمة التي تتطلب التنفيذ الدقيق. ليشمانيا المجراة في العدوى ينطوي على الاستجابة المناعية الفطرية المعقدة قبل البلعمه، الذي يحدد مسار الإصابة38في نهاية المطاف. ولذلك، اختيار طراز الماوس السلالة، ذات أهمية حاسمة في تصميم الدراسة. C57BL/6 و بالب/ج من سلالة الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول الدب الطفرات في الجينات ترميز البروتين بلعم المرتبطة بالمقاومة الطبيعية (Nramp1)، مضخة بروتون افلوكس أن ترانسلوكاتيس Fe2 + و Mn2 + الأيونات من بلعم lysosomes/فاجوليسوسوميس إلى سيتوسول. هذا يؤدي إلى زيادة التعرض لمسببات الأمراض التي النسخ المتماثل داخل مقصورة اندوسيتيك الضامة8،،من3031. نجاح الاستعمار في الضامة يتوقف أيضا على قدرة فريدة للمعدية ليشمانيا الطفيليات للتلاعب بالاستجابة المناعية قمع البقاء بلعم التنشيط39،40. الضامة المتباينة التي تستخدم ليشمانيا بم الالتهابات تحاكي إلى حد ما حالة عدم تنشيط الضامة في الجسم الحي، ولكن التحليل لا تراعي مجموعة أكثر تعقيداً بكثير من العناصر المضيفة التي تؤثر في الفوعة في نماذج حيوانية.
العزلة أشكال ليشمانيا المعدية صحية هي الأخرى بالغة الأهمية الحاجة إلى تصميم الفوعة دقيقة. ليس كل بروماستيجوتيس من جميع سلالات الليشمانيا كفاءة تفرق في amastigotes عندما تعرض لانخفاض درجة الحموضة/ظروف ارتفاع درجة الحرارة41. ومن ثم، غالباً ما تنفذ العدوى مع بروماستيجوتيس ميتاسيكليك تنقيته من الثقافات بروماستيجوتي ثابتة. لعزل فعال بروماستيجوتيس ميتاسيكليك، بعض استراتيجيات تنقية الاستفادة من تغير تكوين جليكوكاليكس السطحي الطفيلي خلال مراحل الحياة المختلفة، بما في ذلك إدخال تعديلات واسعة النطاق على ليبوفوسفوجليكان (غاز البترول المسال) هيكل42،،من4344. على سبيل المثال، أجلوتينين الفول السوداني (السلطة الوطنية الفلسطينية)، يكتين الذي يربط بشكل انتقائي إلى بروسيكليك ولكن لم ميتاسيكليك غاز البترول المسال فعالية استخدمت في بروتوكولات الانتقاء السلبي نق ل الرئيسية بروماستيجوتيس ميتاسيكليك45. استراتيجية تنقية بروماستيجوتي ميتاسيكليك أمازونينسيس ل. وعادة ما ينطوي mAb3A.1 [مونوكلونل] جسم التي يمكن أجلوتيناتي بروماستيجوتيس بروسيكليك باستهداف البروتين السطحية محددة [ابيتوبس] لا يمكن الوصول إليها في ميتاسيكليك أشكال بسبب جليكوكاليكس السطحية التعديلات8،،من1332. استخدام وسائط التدرج كثافة لفصل بروماستيجوتيس ميتاسيكليك من بروماستيجوتيس على أساس الاختلافات الخاصة بالمرحلة في كثافة الطفو طريقة جذابة نظراً لأنها لا تعتمد على تنويعات إبلاغها في يغاندس السطحي الطفيلي. تم اعتماد هذا الأسلوب، وصفت في البداية لام الكبرى metacyclic promastigote تنقية33، بنجاح للعديد من أنواع الليشمانيا الأخرى أساسا من خلال إدخال تعديلات على شروط الطرد المركزي خلال الترسب الكثافة--التدرج46،47،،من4849.
من المهم أيضا أن يكون على بينه من القضايا التي قد تؤدي إلى تعقيد تنفيذ المقايسة، التي يمكن أن تحدث في عدة خطوات في هذه العملية. وقد تشمل هذه المشاكل التلوث أثناء استخراج بم، التفريق غير ناجحة في بنغلادش بعد استخراج، الطلاء بلعم غير متناسقة، وتنقية غير كاملة من أشكال الطفيليات المعدية، عدوى سيئة أو غير متناسقة، و صعوبات تركيب زجاج كوفيرسليبس على شرائح المجهر. هذه الاحتمالات قد عولجت في البروتوكول، وقد تحل بعناية تقييم كل خطوة من خطوات الإجراء العدوى للتعرف على المشكلة. على سبيل المثال، أن تلويث الثقافات بم أثناء عملية التمايز قد تشير إلى حاجة إلى تحسين أسلوب تعقيم أثناء استخراج. يجوز تصحيح عناية فائقة النقاء ونضارة لتنقية المواد الكاشفة والتنفيذ الدقيق للبروتوكول تنقية تنقية الناجحة أو غير مكتملة من أشكال الطفيلي المطلوب. قد يكون سبب العدوى ضعيفة أو غير متناسقة غير دقيقة التحديد الكمي للطفيليات أو موي عالية جداً أو منخفضة جداً للظروف التجريبية المحددة. بعد استخراج ومعالجة وتركيب كوفيرسليبس الزجاج هو يمكن القول أن هذه العملية من الناحية التقنية الأكثر تحديا في هذا الأسلوب؛ وقد تجد الأفراد أنهم يفضلون استخدام أدوات مختلفة لتسهيل معالجة كوفيرسليبس. تصور واضح ل DAPI الملون الأنوية أمر حاسم للطفيلي دقيقة عد تحت المجهر. تلطيخ باهتة والتركيز غير لائق باثنين من الجناة الرئيسيين وراء الكمي لا تتفق. ويمكن تأمين هذا بمراقبة الجودة DAPI تلطيخ خطوة والحد من وقت التعرض للضوء للحد من تبييض الصورة، وتغيير التركيز الموضوعي لمراعاة جميع الأنوية الطفيلي في الميدان بسرعة. يمكن أيضا تحسين الإضاءة الفلورية DAPI طريق ضمان permeabilization السليم من العينات مع المنظفات، وزيادة تركيز DAPI خلال تلطيخ. نهج بديلة التي يمكن أن تسهل من عملية التحديد الكمي للحصول على صور رقمية للعينات أثناء الفحص المجهري. الصور يمكن استخدامها للقياس الكمي في وقت لاحق، ويمكن التحقق من/كمياً من المحققين المستقلين. ومع ذلك، هناك الصعوبات التقنية المرتبطة بهذه العملية التي تتطلب دراسة متأنية. نظراً لطبيعة كروية الكهروضوئية، الطفيليات ليست دائماً على نفس المستوى البؤري. وهذا يقتضي أن تكون صور متعددة المكتسبة باستخدام طائرات تنسيق مختلف لكل حقل مجهرية، وفيما بعد تجميعها معا لحساب لجميع الطفيليات. خلاف ذلك، التحديد الكمي من الصور يمكن أن تكون مضللة للغاية. حسابات الضامة والميدان، و amastigotes والميدان أمرا حاسما لضمان تحقيق بلعم متسقة الطلاء وانتشار الطفيليات أثناء الإصابة. منذ بنغلادش خلايا متمايزة تماما، لا ينبغي زيادة عددها مع مرور الوقت. إذا زاد عدد الضامة المضيفة على مر الزمن، فهذا يعني أن الضامة كانت لا تزال غير ناضجة. وفي هذه الحالة، يجب التحقق من مصدر وتركيز السائل الدماغي النخاعي-م. تحديد نسبة الضامة المصابة أيضا يمكن أن تكون مفيدة في تقديم رؤية شاملة للمضيف الممرض الخلية التفاعل، لا سيما في الحالات التي لا تتبع فيها نسبة الإصابة والطفيلي تحميل مماثلة الاتجاهات20،21 .
قد يتم تعديل الأسلوب في المختبر العدوى بم مفصلة هنا لتناسب الاحتياجات التجريبية المحددة. يجوز إجراء تعديلات على أي من الخطوات الأساسية في هذه العملية--استخراج بم والتمايز، وتنقية أشكال الطفيليات المعدية، والتقدير الكمي المختبر في بلعم العدوى، فضلا عن الالتهابات المنفذة مع مختلف تحليل أشهر وضبط فترة الإصابة والنقاط الزمنية. مكونات وسائط الثقافة يمكن تعديلها بسهولة أيضا عن طريق مكملات أو استنفاد المغذيات المحددة، ويمكن تقييم سلالات مختلفة أو أشكال الطفيليات متعددة في وقت واحد. قد تتطلب هذه التعديلات تعديل إضافي للإجراءات التقنية؛ على سبيل المثال، إجراءات لإعداد أماستيجوتي وتنقية metacyclic promastigote يتوقع أن تختلف بين الأنواع الليشمانيا المختلفة. الأصباغ الفلورية إضافية إلى جانب DAPI، أو يمكن استخدام المعلمة فلوريسسينتلي المكونات الخلوية لتصور مجموعة شاملة من الطفيلي المضيف تفاعل العمليات6،24. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها لتنسيق نظم إنتاجية عالية (HTS)، التي تسمح بالفحص السريع لمجمع المكتبات لتحديد العملاء المتوقعين المخدرات جديدة وفعالة لعلاج داء الليشمانيات24هذا التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لديهم لا تضارب المصالح المالية،
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منحة RO1 AI067979 نوا.
يك هو المتلقي للزمالات الجامعية من هوارد هيوز الطبي معهد/جامعة "ماريلاند كوليدج بارك".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
