הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts
Summary
כאן, אנו מציגים את הקרנת הסרט פרה coumarins נגד סרטן באמצעות תרבות תלת-ממד, דג זברה.
Abstract
הקרנת קליניים בתוך חוץ גופית ו ויוו של סוכני טיפולית הרומן הן כלי חיוני בגילוי סרטן סמים. למרות שורות תאים סרטניים אנושיים מגיבים תרכובות טיפולית תרביות תאים חד שכבתי (מימד) 2D, 3D תרבות מערכות פותחו כדי להבין את היעילות של תרופות יותר מבחינה פיזיולוגית הרלוונטיים במודלים. בשנים האחרונות, שינוי פרדיגמה נצפתה במחקרים קליניים כדי לאמת את העוצמה של מולקולות חדשות במערכות תרבות תלת-ממד, ליתר דיוק מחקה את microenvironment הגידול. מערכות אלה מאפיינים את המחלה באופן רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית ולעזור כדי לקבל יותר מכניסטית תובנה והבנה של הכדורים מינון תרופתי של מולקולה נתונה. יתר על כן, עם המגמה הנוכחית בשיפור ויוו סרטן מודלים, דג זברה התפתחה כמודל חוליות חשוב להעריך ויוו היווצרות הגידול וללמוד את ההשפעה של סוכני טיפולית. . חקרנו את היעילות הטיפולית של hydroxycoumarin OT48 לבד או בשילוב עם BH3 מימטיקה ב סרטן ריאות תאים בטור A549 באמצעות שלוש מערכות התרבות 3D שונים כולל מבחני היווצרות המושבה (CFA), ספרואיד היווצרות assay (SFA) ו אין ויוו xenografts דג זברה.
Introduction
סרטן נגרמת על ידי מוטציות תאיות, כתוצאה מכך הביוכימי איתות המסלולים הם שיבשו מפעילה חלוקת תאים בלתי מבוקרת והתנגדות מוות של תאים. גידולים להפריע פונקציות פיזיולוגיים של העיכול, לחוצה, הדם מערכות, רקמות שכנות לאחר מכן1. למרות מאמצי מחקר מקיף, הסרטן נשאר המחלה שכיחה ביותר מסכני העולם2. רפואה דיוק הוכר יסוד ותרופות לסרטן בעתיד. גופים מולקולריים חדשים נבחנים באופן שגרתי בשילוב עם תרופות קיימות כדי לשפר את התוצאה הקלינית.
אולם, אחת המגבלות משמעותיים הקשורים לפיתוח טיפולים ממוקדים יעיל החדש הוא הכישלון של מבחני נפוץ לדמות התוצאה ביולוגי מדויק של חשיפה לסמים3. גילוי תרופות הסרטן עדיין בעיקר מסתמך על בדיקת יעילותם של סוכני טיפולית בתוך שורות תאים סרטן בתרבית בתרבויות טפט 2D, אשר קשה לאמת בניסויים קליניים4. לכן, אין עניין הולך וגובר לפתח מודלים סרטן יותר עדיף לחקות את התכונות מקורית של גידולים ויוו5. בשנים האחרונות, הביא עניין הולך וגדל בתרבות תלת-ממד מודלים לפיתוח מתודולוגיות שיפור לייצר מודלים 3D הגידול5.
כאן, אנו מציגים גישה עם שלוש טכניקות תרבות שונים תא 3D המאפשר לשפר את ההבנה של עוצמת hydroxycoumarin OT486 בשילוב עם BH3 מימטיקה לפני יותר בעומק ויוו מבחני. השיטה שלנו מורכב המשלב המושבה לבין SFAs עם ויוו הגידול היווצרות מבחן המבוסס על מודל של דג זברה נוסף לאמת את היעילות של השילוב של OT48 ו BH3 מימטיקה בתאי סרטן ריאות, לעקוב אחר התקדמות סרטן ב חי . אורגניזם.
מבחני היווצרות המושבה משמשים באופן שגרתי כדי להעריך את היעילות של תרופות נגד סרטן סוכנים עבור סרטן הן מוצק כמו גם hematopoietic. וזמינותו קובעת את היכולת של תא כדי להתרבות ללא הגבלת זמן ויוצרים מושבות7. ההשפעה של סוכן נגד סרטן על המושבה ויוצרים את היכולת של תאי נקבעת על ידי ירידה של מספר ו/או גודל של המושבות.
Spheroids מייצגים במבחנה הגידול מודלים ומגישים כפלטפורמה ההקרנה בעלות נמוכה עבור סוכני נגד סרטן. Spheroids אגרגטים של תאי גידול ההשעיה או מוטבע בתוך מטריצה תלת-ממד. גישה זו הוא בשימוש נרחב והתרופות הקרנה ומחקרים של הגידול, התפשטות וצמיחה של החיסון אינטראקציה עם8.
כדי להבין באופן מלא את המאפיינים של תרופה חדשה, זה חיוני כדי ניסויים ויוו מכרסמים. עם זאת, שיטה זו המקובלת היא זמן רב ויקר. בשנים האחרונות, דג זברה (רזבורה rerio) הפך אורגניזם מעבדה נרחב למד כי הוא זול יותר ומהיר יותר לגדל. גידולים שפותחה בגישה דג זברה מייצגים תלת-ממד תא תרבות אך בתוך הגדרת ויוו של חוליות9.
בסך הכל, נשתמש כאן שלוש גישות התרבות 3D שונים לרבות פרנקים, SFAs דג זברה ויוו היווצרות הגידול כדי להדגים את הקיבולת נגד סרטן של hydroxycoumarin OT48 במודל התא סרטן A549 ריאות בשילוב עם BH3 מימטיקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיעור של היווצרות המושבה שהושג עם MCBM תלויה בסוג התא. בדרך כלל, עבור תאים שאינם מחסידי, מספר מושבות הוא הרבה יותר גבוה לעומת תאים חסיד. הבחנו כי תאים A549 הקימו מושבות 30 עד 40 לאחר 10 ימים. בעבר דיווחנו על תאי סרטן שונים כי מספר מושבות הוא בין 200 ל-2509. התוצאות שלנו הראה כי OT48 לבד לא לייצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר-סנו נתמך על ידי נבחרת מחקר קרן (ב- NRF) על ידי MEST של קוריאה למענק הגידול Microenvironment גלובל הליבה מחקר במרכז (GCRC), [גרנט מספר 2011-0030001]; המענק מחקר סיאול האוניברסיטה הלאומית ועל ידי המוח קוריאה (BK21), בנוסף לתוכנית.
Materials
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
