Summary
Här presenterar vi prekliniska screening av anticancer Kumariner använder 3D kultur och zebrafisk.
Abstract
In vitro och i vivo prekliniska screening av nya terapeutiska medel är ett viktigt verktyg i cancer drug discovery. Även om människors cancer cellinjer svara på terapeutiska föreningar i 2D (tvådimensionell) enskiktslager cellkulturer, har 3D kultur system utvecklats för att förstå effekten av läkemedel i mer fysiologiskt relevanta modeller. Under senare år observerades ett paradigmskifte i prekliniska forskning för att validera styrkan av nya molekyler i 3D kultur system, mer exakt härma den tumör mikromiljö. Dessa system karakterisera sjukdomstillstånd på ett mer fysiologiskt relevanta sätt och hjälpa till att få bättre mekanistisk insikt och förståelse för den farmakologiska potensen av en viss molekyl. Dessutom med den nuvarande trenden att förbättra in-vivo cancer modeller, zebrafisk har vuxit fram som ett viktigt ryggradsdjur modellerar att bedöma in-vivo tumörbildning och studera effekten av terapeutiska medel. Här, vi undersökte den terapeutiska effekten av hydroxycoumarin OT48 ensamt eller i kombination med BH3 mimetika i lung cancer cell fodrar A549 med hjälp av tre olika 3D kultur system inklusive kolonin bildandet analyser (CFA), sfäroid bildandet assay (SFA) och i vivo zebrafiskar xenograft.
Introduction
Cancer är orsakade av cellulär mutationer och följaktligen biokemiska signalvägar störs utlöser okontrollerad celldelning och motstånd till celldöd. Tumörer störa fysiologiska funktioner i matsmältningssystemet, nervsystemet, cirkulationssystem och därefter angränsande vävnader1. Trots omfattande forskningsinsatser fortfarande cancer den vanligaste livshotande sjukdomen i världen2. Precision medicin har erkänts som grunden för framtida cancer therapeutics. Nya molekylära enheter testas rutinmässigt i kombination med befintliga läkemedel för att förbättra kliniska resultat.
En av de betydande begränsningar som är associerade med utveckling av nya effektiva riktade terapier är dock vanliga analyser misslyckande att simulera exakta biologiska resultatet av drogen exponering3. Cancer läkemedelsutveckling bygger fortfarande mestadels på testa effekten av terapeutiska medel i cancer cellinjer odlade i 2D enskiktslager kulturer, som är svåra att validera i kliniska prövningar4. Därför finns det ett växande intresse att utveckla bättre cancer modeller som bättre efterliknar de inbyggda funktionerna i tumörer i vivo5. Under senare år resulterade ett ökande intresse för 3D kultur modeller i utvecklingen av förbättrade metoder att producera 3D tumör modeller5.
Här presenterar vi en strategi med tre olika 3D cell kultur tekniker gör det möjligt för att förbättra förståelsen av styrkan hos hydroxycoumarin OT486 i kombination med BH3 mimetika innan mer djup i vivo analyser. Vår metod består i att kombinera koloni och SFAs med en in-vivo tumör bildandet test utifrån en zebrafisk modellen att validera effekten av kombinationen av OT48 och BH3 mimetika i lungcancerceller och övervaka cancer progression i en levande organismen.
Kolonin bildandet analyser används rutinmässigt bedöma effekten av cytostatika för såväl fast som hematopoetisk cancer. Analysen avgör förmågan hos en cell att föröka på obestämd tid och bilda kolonier7. Effekten av en anticancer agent på den kolonibildande cellernas förmåga bestäms av minskning av antalet och/eller storleken på kolonierna.
Spheroids representerar i vitro tumör modeller och fungera som en låga kostnader screening plattform för cytostatika. Spheroids är aggregat av celler som växer i suspension eller inbäddade i en 3D matrix. Denna metod används ofta för drogkontroll och studier av tumör tillväxt, spridning och immun interaktion8.
För att fullt förstå egenskaperna för ett nytt läkemedel, är det viktigt att utföra in-vivo -experiment på gnagare. Konventionella metoden är dock dyrt och tidskrävande. Under de senaste åren blev zebrafiskar (Danio rerio) en allmänt studerade laboratorium organism som är billigare och snabbare att höja. Tumörer utvecklas i metoden zebrafiskar representerar en 3D cell kultur men inom inställningen in vivo av en vertebrate9.
Sammantaget använder vi här tre olika 3D kultur metoder inklusive CFAs, SFAs och zebrafiskar i vivo tumörbildning för att demonstrera mot cancer kapaciteten hos hydroxycoumarin OT48 i en lung cancer A549 cell modell i kombination med BH3 mimetika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kolonin bildandet analyser
- Kultur A549 celler vid en koncentration av 20 000 celler/cm2 i 15 mL RPMI1640 cell odlingsmedium som kompletteras med 10% FBS (fetalt bovint Serum) och 1% antibiotika i en 75 cm2 kolv i en CO2 inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- På dagen för experimentet, bestämma cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer. Samla in 50.000 celler genom centrifugering vid 400 x g i 7 min i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och resuspendera cellerna i 100 µL av 1 x steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (fosfat buffrad saltlösning) i 1,5 mL rör.
- Fördela 1,1 mL av halvfast metylcellulosa-baserade medium (MCBM) i 15 mL rör med en multipipette. Laga en röret för varje villkor.
- Lägga till 110 µL av FBS 1,1 mL MCBM med en P200 mikropipett.
- Frön-celler vid 1 000 celler/mL. Samla in 2,4 µL cellsuspension från stamlösning (50.000 celler i 100 µL av 1 x PBS) med en P2 mikropipett och lägga till 1,1 mL MCBM kompletteras med 10% FBS.
- Efter att lägga till cellerna, vortex rören för 1 min, hålla dem lodrätt med högsta hastighet att blanda MCBM och celler väl.
- Lägg till test föreningar (OT48 ensamt eller i kombination med A1210477). Förbereda en separat slang som en kontroll för lösningsmedel används (här dimetyl sulfoxid (DMSO)). Beroende på koncentrationen av föreningarna och volymen för varje villkor, bland lösningsmedel kontroll den högsta koncentrationen av lösningsmedel som används för utspädningarna av testet förening, för att bedöma för biverkningar orsakat av lösningsmedlet.
- Cyklontuber i 1 minut.
- För varje test, tillsätt 1 mL av blandningen med en P1000 mikropipett till stadens väl av en 12-väl cell kultur plattan.
- Fyll tomma brunnar med 1 mL sterilt vatten eller 1 x PBS att stabilisera luftfuktighet.
- Inkubera kultur plattor i 10 dagar i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2.
- Efter 10 dagars inkubation, tillsätt 200 µL av en MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromid) stamlösning (5 mg/mL) till varje brunn för att nå en slutlig koncentration av 1 mg/mL.
- Inkubera i 10 min i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2. Livskraftig kolonierna blir violett.
- Fånga bilden med en digitalkamera med vit bakgrund plattan (LAS vit dia bricka). Använd följande inställningar: metod, digitalisera; Exponering typ, precision; Exponeringstid, manuell, 1 sekund; Känslighet/upplösning och hög upplösning. Spara bilden i tiff-format.
- Kvantifiera livskraftig kolonier med hjälp av ImageJ programvara. Välj menyn ”bild | Typ | 8 bit ”. Välj menyn ”Justera | Tröskeln ”. Ange tröskelvärde för kontroll och hålla konstant för alla förhållanden. Välj menyn ”analysera | Analysera partiklar ”. Spara data och analysera med en statistik-program för grafisk representation.
2. sfäroid bildandet Assay
- Kultur A549 celler vid en koncentration av 20 000 celler/cm2 i 75 cm2 kolvar med 15 mL RPMI 1640 medium kompletteras med 10% FBS och 1% antibiotika.
- På dagen för experimentet, förbereda en 96 väl U-bottenplattan.
- Platta 10 000 celler i en brunn som redan innehåller sammansatta av intresse (här 50 µM av OT48) och/eller 20 µM av A1210477. Anpassa den slutliga volymen till 100 µL av cellodlingsmedium. Antalet celler som bildar enhetliga spheroids med en intakt yttre gräns anses tillräcklig för att formuläret spheroids.
- Inkubera under 3 dagar i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter 3 dagars inkubation, fånga bilder av de spheroids med ett ljusmikroskop med 4 x förstoring.
3. zebrafiskar Xenograft Assay
Obs: Detta tekniska tillvägagångssätt är visualiseras som en schematisk (figur 1).
-
Beredning av lager reagenser
- Förbereda 1 L 30 x Danieaus lösning: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (nr3)2och 150 mM HEPES. Justera pH-värdet i bufferten till 7,6 med hjälp av en pH-mätare.
- Bered 1% (50 x) tricaine lösning: Lös 20 mg etyl 3-aminobensoat methanesulfonate (tricaine) i 2 mL destillerat vatten.
- Bered 1% fenolrött-PBS lösning: Tillsätt 2 µL fenolrött natrium salt lösning till 198 µL steriliserad PBS lösning i en 1,5 µL tub.
- Förbered 3% metylcellulosa: Tillsätt 3 g metylcellulosa till 100 mL 1 x Danieaus lösning.
-
Zebrafiskar äggproduktion och inkubation
- Separat en kvinnlig och en manlig zebrafiskar i en partition tank fylld med UV-steriliseras och filtrerat kranvatten på 28,5 ° C i mörker. Efter 24 h av separation, blanda fisk av båda könen att inleda parning. Överföra befruktade ägg från parning tanken till en petriskål innehållande 5 mL färsk Danieaus lösning.
- Tvätta ägg tre gånger med 5 mL Danieaus lösning. För att tvätta, noggrant aspirera ägg med en pipett och överföring till 5 mL färsk lösning. Inkubera i 8 h på 28,5 ° C.
- Efter 8 h inkubation i Danieaus lösning, ändra till Danieaus lösning innehållande 0,03% 1-fenyl-2-tiourea (PTU) som hämmar pigmentering. Sortera ut ogenomskinlig ägg (obefruktat eller innehållande outvecklade embryon) för att förhindra kontaminering.
-
Embryo dechorionation
- 24 h efter befruktning (hpf), dechorionate zebrafiskar embryon med vassa pincetten. Inkubera kläckning embryon i Danieaus lösning med 0,03% PTU på 28,5 ° C tills 48 hpf.
-
Förening-behandlade cell förberedelse
- Frö A549 celler på 20 000 celler/cm2 i 25 cm2 kultur kolvar. Efter 24 h av sådd, lägga till föreningar (här OT48 vid 50 µM och eller A1210477 vid 20 µM) för 24 h i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2. Ställa in behandlingstiden för varje förening att upprätthålla livskraften i cellerna utan att begå dem mot celldöd. Denna tid punkt måste ställas in individuellt bygger på cellernas viabilitet, morfologi och molekylära markörer.
- 2 h före slutet av behandlingen, fläcken celler med 4 µM av fluorescerande cell tracker färga CM-Dil vid 37 ° C och 5% CO2. Efter 2 h inkubation, trypsinize celler med 0,05% trypsin-EDTA och späd 106 celler i 50 µL fenolrött-PBS lösning före injektion.
-
Micro-injektion av cancerceller för xenograft bildandet
- Söva zebrafiskar i en 0.02% tricaine lösning för 5 min tills de bosätta sig på en agarplatta.
- Dra en 1,0 mm (utanför diameter (OD) glas kapillär) av en mikropipett avdragare (programmet inställningar: P: 300, värme: 260, dra: 60, VEL: 50 och tid: 200). Skär microcapillary med en spruta för att producera en skarp kant. Ladda microcapillaries med 20 µL av cell/phenol Red-PBS lösning. Ställ in insprutningstryck och tid att avstå från 2 nL per injektion.
- Injicera 100 – 200 celler i gulesäcken genom injicering 6 till 10 nL via 3 till 5 injektioner. Efter injektionen, tillåta fisk att återvinna för 10 till 30 min i 5 mL av färska Danieaus lösning innehållande PTU lösning. Avsändande fisken i 24 brunnar med 1 mL Danieaus lösning innehållande PTU lösning och inkubera i 72 h på 28,5 ° C.
- Efter 72 h inkubation, söva fisken i en lösning med 0,02% i tricaine och immobilisera på en glasskiva med en droppe 3% metylcellulosa. Ta 5 x bilder av fluorescensmikroskopi vid en våglängd på 620 till 750 nm.
- Kvantifiera storleken på fluorescerande tumörer av ImageJ software. Välj menyn ”analysera | Åtgärd ”. Spara värden som motsvarar den fluorescerande signalen och analysera med en statistik-program för grafisk representation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2, lungcancer cellinje A549 var seedad i MCBM att bilda kolonier efter behandling med OT48 ensamt eller i kombination med BH3 mimetiska A1210477 vid de angivna koncentrationerna. Resultaten visade att kombinationen betydligt antal, storlek och totala yta av kolonierna efter 10 dagars inkubation.
I figur 3, A549 celler behandlades med OT48 ensamt eller i kombination med BH3 mimetiska A1210477 och tilläts bilda spheroids av U-botten plattan tekniken. Efter 3 dagars inkubation togs bilder på spheroids. Kvantifiering av spheroids var gjort med bild J och 3D bilder genererades.
I figur 4, A459 celler behandlades med OT48 ensamt eller i kombination med BH3 mimetiska A1210477 för 24 h och injiceras i zebrafiskar gulesäcken. Efter 72 h, kvantifiering av fluorescerande tumörer korrelerar till hämmande potential av föreningen.
Figur 1: Schematisk bild av den övergripande processen zebrafiskar xenograft analysens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: synergistisk hämning av A549 koloni bildandet av hydroxycoumarin OT48 och BH-3 mimetiska A1210477. (A) bilder av en A549 koloni bildandet analys behandlas med 50 µM av OT48 och/eller 20 µM av A1210477. (B-D) Kvantifiering av nummer, genomsnittlig storlek och totala yta av kolonier. Experiment realiserades i tre exemplar. Post hoc -analyser utfördes. Statistisk signifikans utvärderades på p-värden under 0.05 och representeras av följande legenden: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; post hoc analyser Dunnett; Sidak). Alla histogram representerar det medelvärde ± SD minst tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: effekt av OT48 och/eller A1210477 på kapaciteten av A549 celler till formuläret spheroids. Bilder av A549 tumör spheroids efter 3 dagar.
Figur 4: hämning av A549 tumör massa bildandet av en förening. (A) bilder visar den hämmande effekten av OT48 eller A1210477 på tumören bildar kapacitet av CM-Dil-färgade A549 celler. (B) kvantifiering av tumörbildning. Post hoc -analyser utfördes. Statistisk signifikans utvärderades på p-värden under 0.05 och representeras av följande legenden: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; post hoc analyser Dunnett; Sidak). Alla histogram representerar det medelvärde ± SD minst tio oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Av kolonin bildandet erhålls med MCBM beror på vilken cell. Vanligtvis, för icke-anhängare celler, antalet kolonier är mycket högre jämfört med vidhäftande celler. Vi observerade att A549 celler bildas 30 till 40 kolonier efter 10 dagar. Vi har tidigare rapporterat för olika leukemiceller att antalet kolonier är mellan 200 till 2509. Våra resultat visade att OT48 ensam inte producerar en betydande minskning av antalet kolonier ensam. Men i kombination med BH3 reducerades mimetiska A1210477 koloni bildar A549 cellernas förmåga synergistiskt. Tidigare rapporterade vi att en annan hydroxycoumarin derivatinstrument OT52 också synergized med BH3 mimetika hämma kolonin bilda förmågan av A549 celler. Den föreslagna sådd koncentrationen kan variera från 1 x 103 till 1,5 x 103. CFA använder MethoCult är en värdefull teknik som rutinmässigt används för att mäta tumourigenesis i olika cancer cellinjer, men det har vissa begränsningar. Ofta återvinning av livskraftiga kolonier efter experimentet är obekvämt, och cellerna växer inte väl en gång isolerade från MCBM och seedade i RPMI1640 medium. Det är dock en väl accepterade prekliniska teknik för att bättre förstå mekanismen av cancer progression i en 3D-miljö. 3D tillväxten villkorar representera korrekt den naturliga miljön av tumörbildning i en in-vivo -miljö. Men denna metod är långsam, arbetskrävande och inte lämpar sig för hög genomströmning screening10.
SFAs utförs med vidhäftande celler och breda popularitet i cancer drug discovery som uppvisar de fysiologiska egenskaper såsom ökad cellöverlevnad, tumör morfologi och en hypoxisk kärna som är mer representativ för en in-vivo situationen 11,12. Den totala storlek, konsistens och integritet spheroids erhålls genom U-botten plattan tekniken kan variera mellan cellinjer. Dessutom kan börjar koncentrationen av celler som används för att bilda spheroids också påverka dess övergripande utveckling. Våra resultat visade att OT48 i kombination med BH3 mimeticA1210477 hämmade sfäroid integritet och minskat sfäroid bildar A549 cellernas förmåga. Tidigare rapporterade vi hämning av A549 spheroids med en annan hydroxycoumarin derivat i kombination med BH3 mimetika9. Stora fördelar med denna teknik är reproducerbarhet och kostnads effektivitet. Andra tekniker såsom flytande overlay tekniken används också rutinmässigt att utveckla 3D spheroids av cancerceller. Den här tekniken växer cellerna på en icke-anhängare cell kultur maträtt. Cell klumpar då samlas in och placeras i suspension kultur till formuläret spheroids. En av de stora begränsningar som är associerade med denna teknik är dock överföringen av cell klumpar till suspension kultur, som inte tolereras väl av olika cellinjer. För att öka genomströmningen av sammansatta screening sådant 3D kultur system, utvecklar vissa företag särskilda substrat, låg fastsättning assay tallrikar och ställningar att förbättra bildandet av 3D-strukturer13. Med ytterligare tekniska framsteg, kommer att utvecklingen av en mer representativ 3D tumör-modell ge en bättre förståelse för farmakologi av nya föreningar för en viss typ av cancer.
Zebrafiskar xenograft betraktas som de mest kostnadseffektiva djur analyser som rutinmässigt används för anticancer läkemedel utveckling9,14. Vi har optimerat zebrafiskar i vivo systemet med olika typer av solid och hematologisk cancer samt patientderiverade celler. I området i närheten finns det flera fördelar med att använda zebrafiskar för drogkontroll. I princip droger kan läggas direkt i vattnet och behöver inte injiceras. Dessutom ger denna strategi också information om en läkemedelskandidat ADME (absorption, distribution, metabolism och utsöndring) egenskaper. En av de stora begränsningarna av denna teknik är dock vissa molekyler inte är vattenlösliga och därför lämpar sig inte omedelbart utredas av denna metod. För att kringgå den här begränsningen behandlades cancerceller med föreningar ex vivo att injiceras i zebrafiskar i ett skede där cellerna är engagerade, ändå upprätthålla livsduglighet. Våra resultat visade att A549 celler behandlas med OT-48 eller med BH3 mimetiska A1210477 ensam inte starkt minska tumören bildar A549 cellernas jämfört med en kombination av OT48 och A1210477 förmåga. Denna observation ytterligare våra validerade in vitro- CFA där kombinationen visade signifikant anti-cancer effekt jämfört med individuella behandlingar. Sammantaget kan denna teknik bidra till snabb screening av läkemedel i en preklinisk inställning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Forskning vid SNU stöds av den nationella Research Foundation (NRF) av Koreas MEST för tumör mikromiljö Global Core Research Center (GCRC) bidrag, [grant nummer 2011-0030001]; genom den Seoul National University forskningsbidrag och hjärnan Korea (BK21) PLUS program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
- Giancotti, F. G.
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S.
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
