Summary
نقدم أسلوب الذي يمكن تقديم المزيد من الأفكار في أحداث أوائل الكامنة وراء نيوروديجينيريشن واستنادا إلى تقنية الدماغ المنشأة السابقين فيفو ، الجمع بين مزايا تجارب في الجسم الحي وفي المختبر . وعلاوة على ذلك، فإنه يمثل فرصة فريدة لإجراء مقارنة مباشرة لفريق المعالجة وغير المعالجة في نفس الطائرة التشريحية.
Abstract
وعلى الرغم من العديد من الدراسات التي تسعى إلى تطوير نماذج حيوانية الموثوقة التي تعكس الأولية العمليات الأساسية نيوروديجينيريشن، عدد قليل جداً وقد قبلت على نطاق واسع. هنا، فإننا نقترح إجراء جديد مقتبس من المعروفين السابقين فيفو الدماغ شريحة تقنية، مما يوفر أوثق في فيفو--مثل السيناريو مما في المختبر الأعمال التحضيرية، للتحقيق في أحداث أوائل تسبب ضمور الخلية، كما ويلاحظ في مرض الزهايمر (AD). يتكون هذا الاختلاف من خطوات بسيطة واستنساخه بسهولة، التي تمكن من الحفاظ على سيتوارتشيتيكتوري التشريحية لمنطقة الدماغ المحددة والوظائف المحلية في بيئة فسيولوجية. يمكن الحصول على مختلف المناطق التشريحية من الدماغ نفسه، وإتاحة الفرصة للقيام بتجارب متعددة مع العلاجات المذكورة في الموقع-والجرعة-، وطريقة تعتمد على الوقت. القيود المحتملة التي يمكن أن تؤثر على النتائج ذات الصلة بهذه المنهجية المرتبطة بالمحافظة على النسيج، أي الحفاظ على سلامتها التشريحية خلال خطوات تشريح والحضانة وسمك الفرع، الذي يمكن أن تؤثر تحليل البيوكيميائية والمناعي. ويمكن استخدام هذا النهج لأغراض مختلفة، مثل استكشاف الآليات الجزيئية التي تشارك في الظروف الفسيولوجية أو المرضية، وفحص المخدرات، أو فحوصات الجرعة والاستجابة. وأخيراً، هذا البروتوكول يمكن أيضا خفض عدد الحيوانات المستخدمة في الدراسات السلوكية. تم مؤخرا ووصف التطبيق ذكرت هنا واختبارها لأول مرة على السابقين فيفو الفئران الدماغ الشرائح التي تحتوي على فوريبرين القاعدية (BF)، التي واحدة من المناطق الدماغية التي تؤثر أساسا في الإعلان. على وجه التحديد، وقد ثبت أن إدارة الببتيد السمية المستمدة من ج-محطة أستيلكولينستراز (وجع) يمكن أن يدفع الشخصية مثل الإعلان، تحريك، طول المحور الخلفي أنتيرو لفرنك بلجيكي، تعبير تفاضلي من البروتينات التي غيرت في الإعلان، مثل مستقبلات النيكوتين alpha7 (α7-ناشر)، فوسفوريلاتيد تاو (فتاو)، وبيتا اميلويد (Aβ).
Introduction
الإعلان علم أمراض مزمنة التي تتسم بضعف تدريجي الأعصاب التي تؤثر على مناطق الدماغ المختلفة، مثل قشرة انتورهينال (المفوضية الأوروبية)، فرنك بلجيكي، والحصين (المفوض السامي) ولمبة شمي (OB)1،2،3، 4،5. المراحل المتأخرة من تطوير الإعلان يؤدي إلى انخفاض المعرفي تدريجي، مما يجعل هذا المرض الأكثر شيوعاً للعته، تستأثر بحوالي 70 في المائة من جميع الحالات6. وعلى الرغم من محاولات واسعة النطاق لفهم المراحل الأولية مما تسبب في الإعلان، لا توجد حاليا إشارة تجريبية محددة بتوضيح لهم. وباﻹضافة إلى ذلك، النظرية الأكثر شعبية--"فرضية اميلويد"-شك متزايد نظراً لأنها لا تقدم صورة كاملة في شرح بل الإعلانية، ولا هدفا صيدلانية التي أثبتت فعالية7،8 ،9.
يوحي نظرية بديلة التي تحظى باهتمام متزايد بأن الآليات الأولية التي تحدث أثناء نيوروديجينيريشن ترتبط بكتلة الخلايا العصبية عرضه أساسا في الإعلان3،،من1011 , 12 , 13 , 14-هذا المحور الخلوية غير المتجانسة ضمن المشاريع فرنك بلجيكي، midbrain والدماغ، إلى مناطق متعددة، مثل المفوضية الأوروبية والمفوض السامي، والحريق المكشوف15،16. على الرغم من تنوعها في مورفولوجيا الخلايا العصبية وتوليف العصبي، تشاطر جوهر هذه الخلايا سمة مشتركة في الإعراب عن وجع، الذي يمكن أن يكون أيضا وظيفة غير الانزيمية17،18. هذا الدور غير الكلاسيكية كرواية إشارات جزيء يتوسط تدفق الكالسيوم (Ca2 +) إلى الخلايا العصبية التي يمكن أن تخضع لإحداث التغذوية أو السمية بالنسبة Ca2 + الجرعة وتوافرها والعصبية سن17،18 , 19.
أثناء نيوروديجينيريشن، لوحظت الخلوية قد تكون الخسارة ولذلك المنتسبة إلى هذه الدالة غير الانزيمية17،،من1820، الذي يعزى إلى ببتيد 30mer (T30) المشقوق من ألم ج-المحطة 20-تمشيا مع النتائج السابقة، التي تقوم على ثقافة الخلية والتصوير الضوئي21 18،الاستعدادات، أظهرنا، من خلال اتباع نهج جديد يستند إلى السابقين فيفو الفئران الدماغ الشرائح التي تحتوي على هياكل فرنك بلجيكي، T30 الناجمين عن الشخصية مثل الإعلان22. على وجه التحديد، وهذه المنهجية الجديدة يقدم سيناريو فسيولوجية أكثر من خلية ثقافة حيث أنها تحتفظ بالكثير من الخصائص أنسجة سليمة، بدءاً من التشريحية للحفاظ على الدوائر، أن كان لإطار زمني لساعات. قمنا بتطبيق هذا البروتوكول على استكشاف الأحداث التي تجري خلال المراحل الأولى من نيوروديجينيريشن، رصد الاستجابة الحادة عند تطبيق T30.
على الرغم من الكم الكبير من المؤلفات المتعلقة بالمخ باستخدام شرائح للتحقيق في المسارات الجزيئية ضمناً في تلف الخلايا العصبية أو الخلايا،من2324، هذا البروتوكول يوفر للمرة الأولى أكثر إلحاحا ومقارنة حساسة تلا باستخدام شرائح أورجانوتيبيك المشتركة. ومع ذلك، كما الحال بالنسبة أورجانوتيبيك أقسام الدماغ، هذا الإجراء شريحة الحاد يمكن أيضا اعتماد لأغراض عدة، مثل تقييم محصن أو جزيئات سمية عصبية، اكتشاف التغيرات الجزيئية الأساسية التي تحدث في عملية محددة، الأمراض المتصلة بالتحليل المناعي، وفحوصات الدوائية للجهاز العصبي المركزي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات الحيوانية ضمن البروتوكولات المعتمدة.
ملاحظة: في هذا القسم، تسلسل المراحل الرئيسية التي يتم إجراؤها أثناء الإجراء التجريبي والفاصل الزمني المقترح (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، ووصف خطوة بخطوة للبروتوكول يكمل لوحة توضيحية، تظهر الإجراءات الحاسمة التي تتراوح بين إزالة الدماغ تجانس الأنسجة بعد فترة الحضانة (الشكل 2). التفاصيل المتعلقة بالمواد والإرشادات لبناء جهاز، وفي المرحلة اللاحقة لتحليل البنك الدولي بوصفه سابقا22.
1-العمليات الجراحية الأدوات وإعدادات فيبرتوم وإعداد العلاج
ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية قبل بدء الإجراء التجريبي:
- إعداد اثنين مختلفة مصطنعة النخاعي السوائل (أكسفس)، واحد يستخدم لتقطيع المخ وأخرى للخطوة الحضانة كما تم وصفه سابقا29. باختصار، تركيزات العامل (في ملمول) أكسفس اثنين لقام "تشريح": 120 كلوريد الصوديوم، 5 بوكل، 20 ناكو3، 2.4 كاكل2، 2 MgSO4، 1.2 خ2ص4، والجلوكوز 10؛ 6.7 الملح حبيس و 3.3 حبيس حمض؛ الرقم الهيدروجيني: 7.1. بعض الوقت لقام "تسجيل": 124 كلوريد الصوديوم، 3.7 بوكل، 26 NaHCO3، 2 كاكل2، 1.3 MgSO4، 1.3 خ2ص4، والجلوكوز 10؛ الرقم الهيدروجيني: 7.1.
- مزيج جيد من الحلول ثم وضعت على الجليد والأوكسجين قام تشريح كي يكون الباردة أثناء إزالة الدماغ وتمزيقها لاحقاً. تبقى في درجة حرارة الغرفة (RT) وإمدادات الأوكسجين إلى قام تسجيل.
- وضع الصكوك تحت غطاء تشريح لإزالة قطع الرأس والدماغ و أي، ومقصلة، وأدوات التشريح الجراحي (مقص، ملقط، ريش)، وملعقة.
- إعداد معلمات فيبرتوم عن طريق تحديد سمك الشريحة (300 ميكرون في هذا الإعداد) والتردد في 7 والسرعة الساعة 6. إدراج الدائرة فيبرتوم في مساحة مناسبة وتحيط بها مع الجليد.
- فتح صمام كاربوجين (95% O2، 5% CO2) الأوكسجين "تشريح" (قام) أثناء تقطيع الدماغ. حدد معدل تدفق الدنيا، حوالي 2 مل/دقيقة.
- أن أنبوبين 15 مل تهيئة الظروف لاختبار. أضف في أنبوب واحد 10 مل من "تسجيل" قام وحدها (مجموعة المراقبة)، وفي غيرها، 10 مل قام "تسجيل" المخصب مع T30 بتركيز 2 ميكرومتر (المجموعة المعالجة). دوامة الأنابيب وإبقائهم على الجليد حتى استخدامها في مرحلة إعداد برنامج الإعداد (الفرع 3).
2-التخدير، استخراج الدماغ وتشريح
ملاحظة: في هذه الدراسة، استخدمت 9 نوع البرية P14 الذكور ويستار. استخراج الدماغ وتشريح اللاحقة تشكل جزءا حاسما من البروتوكول نظراً لأنهم يجب أن يتم بسرعة تنفيذ (في حدود 10 دقائق) من أجل منع أو على الأقل تبطئ عمليات ضمور الأنسجة.
- إضافة 1.5 مل من 100% w/w من إيسوفلوراني على طبقة القطن في قاعة التوجيهي، وضع الحيوان داخل، وأغلق الغطاء. انتظر حتى عمق تخديره الحيوان، مما يؤكد عدم وجود دواسة المعاكسة، وبعد ذلك قطع رأس الحيوان باستخدام المقصلة.
- الحفاظ على رأس الحيوان داخل الوعاء الذي يحتوي على الجليد تشريح قام خلال هذه الخطوة إزالة الدماغ (الشكل 2A -ج).
- جداً الجلد على الجمجمة بشفرة جراحية، ثم قطع الجمجمة باستخدام مقص بعد خط الوسط، من الجزء الخلفي والشروع في الأسفل حتى وصلت إلى العظم أعلاه OBs (الشكل 2A).
- سحب أفقياً جانبي الجمجمة باستخدام زوج من الملقط للوصول إلى الدماغ (الشكل 2). إدراج ملعقة بطنيا إلى الدماغ، بلطف حلج القطن بها، والحفاظ على أنها رطبة في قام "تشريح" المثلج لمدة 5 دقائق تقريبا (الشكل 2).
- التصرف في الدماغ على ورق الترشيح وقطع المخيخ باستخدام شفرة (الشكل 2D). الصق في الدماغ عمودياً على القرص فيبرتوم وإدراجه داخل قاعة تقطيع وملئه المثلج قام "تشريح" وتوفير الأوكسجين (الشكل 2E).
- ضبط الفاصل الزمني القطع، والمضي قدما في تقطيع المخ (الشكل 2 واو). تجميع المقاطع التي تحتوي على منطقة الفوائد، مثل حاجز وسطى (مللي ثانية)، الفرقة قطري بروكا (إلى)، والمادة إينوميناتا (SI)، كما هو موضح سابقا22. من أعلى إلى الأسفل، تتضمن ثلاث شرائح روسترال (R)، والمتوسط (ط)، والجزء (ج) والذيلية لفرنك بلجيكي (الشكل 2).
- تقسيم كل قسم على طول خط الوسط مع مقص صغير، الحصول على هيميسليسيس براق اثنين (الشكل 2 ح)، تستخدم منفردة كمراقبة وحالة المعالجة في نفس الطائرة التشريحية.
- الحفاظ هيميسيكشنز في قاعة فيبرتوم لمدة 5-10 دقيقة، ثم نقلها مع ماصة زجاجية في وعاء محتدما تتضمن قام تسجيل. الحفاظ على RT لمدة حوالي 30 دقيقة لاسترداد.
- ملء، وفي الوقت نفسه، ثلاث قنينات زجاجية مع 3 مل من تسجيل قام وحدها (معدّة مسبقاً في الخطوة 1، 6 للسيطرة على المجموعة) وقنينات الثلاثة مع 3 مل قام المخصب مع T30 (معدّة مسبقاً في الخطوة 1، 6) لمجموعة المعالجة.
3-إعداد إعداد
- نقل هيميسيكشنز إلى قارورة زجاج المقابلة (الشكل 2 طاء) كي يكون ثلاثة هيميسليسيس على التوالي (بما في ذلك منطقة فرنك بلجيكي روسترال والمتوسطة والذيلية) للسيطرة على المجموعة (الإطار الأخضر، الرقم 2J) وعلى مطابقة النظراء للمجموعة المعالجة (الإطار الأحمر، الرقم 2J).
- نقل أنسجة المخ مع فرش مختلفة اثنين، واحد هيميسليسيس التحكم وآخر للنظراء المعالجة، لمنع أي تلوث من بين الشروط.
- ختم كل قنينة زجاج مع غطاء المطابق، عرض الإبرة الأكسجين (21 ز) (2J الشكل). قم بتوصيل الأنبوب الرئيسي للجهاز المصدر كاربوجين (الشكل 2 ك). تسليم الأوكسجين إلى هيميسليسيس طوال فترة الحضانة مع معدل تدفق أقل من 2 مل/دقيقة بغية تجنب أي حركة لانسجة المخ واحتمال الأضرار الميكانيكية أثناء التجربة. بدء تشغيل في الحضانة ح 5. تنفيذ الخطوات 3.1-3.3 في 5 دقائق.
ملاحظة: الاختيار كثيرا (كل 15-20 دقيقة) ما إذا كان يتم تزويد الأكسجين إلى كافة القوارير وأن التدفق لا تتحرك الأنسجة من الأسفل.
4-عينة التجانس
- وقف تدفق الأوكسجين بعد الاحتضان وإزالة جميع الأغطية من القنينات. نقل هيميسليسيس، باستخدام الفرش المناسبة، إلى أنابيب 1.5 مل تحتوي على 250 ميليلتر من المخزن المؤقت تحلل، والحفاظ على هذه الأنابيب على الجليد (الشكل 2 لتر). جعل تحلل المخزن المؤقت، مزيج PBS 1 x مع الكوكتيل مثبطات الفوسفاتيز ومبطلات سواء المخفف في 1: 100، ومجانسة الأنسجة مع المدقات المختلفة لمنع التلوث بين العينات. إكمال هذه الإجراءات خلال 10-15 دقيقة.
- الطرد المركزي في الدماغ في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نقل المادة طافية في أنابيب جديدة والحفاظ العينات في-80 درجة مئوية.
5-قراءة تركيز البروتين وتحليل لطخة غربية
- تحديد تركيز البروتين من كل عينة وبعد ذلك إعداد مختبرين لتحليل لطخة غربية كما هو موضح سابقا22.
- إجراء التحليل الإحصائي لتقييم آثار المعالجة على التعبير البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البروتوكول المعروضة هنا يشير إلى أن إدارة الببتيد السامة، T30، ينظم بطريقة تعتمد على موقع التعبير عن α7-ناشر، فتاو، و Aβ في المقاطع التي تحتوي على فرنك بلجيكي (الشكل 3A). مستقبلات النيكوتين يظهر زيادة كبيرة في هيميسليسي روسترال معاملة مقارنة بنظيرتها في عنصر التحكم (شريحة 1, p = 0.0310) (الشكل 3B)، بينما الشريحة المتوسطة لا تدل على أي تغيير بين (شرطين شريحة 2, p = 0.1195) (الشكل 3). في القسم الخلفي موجود تخفيضاً كبيرا في جزء مكشوف T30 على جانبها التحكم (الشريحة 3، ف = 0.0476) (الشكل 3). بناء على طلب T30، مستويات فتاو هي زيادة كبيرة في المنطقة الأمامية ضد سيطرة مطابقة الجانب (شريحة 1, p = 0.0158) (الشكل 3). من ناحية أخرى، لا تظهر أي فرق كبير بين الظروف الأخرى المحتوية على فرنك بلجيكي القسمين (الشريحة 2، p = 0.1014؛ شريحة 3، ف = 0.6405) (الشكل 3). بعد التعرض T30، تتعزز Aβ إلى حد كبير في هيميسيكشنز روسترال والمتوسط بالمقارنة مع الأجزاء الخاصة بهم كونترالاتيرال غير المعالجة (شريحة 1، ف = 0.0136؛ شريحة 2، p = 0.0109) (3D الشكل). في شريحة والذيلية، لا يوجد أي تغيير بين المعالجتين (الشريحة 3، ف = 0.1231) (3D الشكل). تسلم جسم الأولية ضد فتاو حانمه التي تحتوي على بقايا Ser202 فوسفوريلاتيد. يكشف جسم الأولية ضد Aβ isoforms عدة، بدءاً من Aβ37 إلى Aβ42. وتم تحليل البيانات كما هو موضح سابقا22 استخدام اثنين الذيل إقران تي-اختبارات وتمثيله كنون sem. = (هيميسليسيس كل مجموعة، الجرذان) هو (27، 9).
رقم 1: تسلسل وتوقيت إرشادي للخطوات الرئيسية التي يتم إجراؤها أثناء الإجراء التجريبي. يمكن أن تختلف الفترة الزمنية لإكمال الخطوة الأولى والثالثة فيما يتعلق بمستوى الخبرة للمشغل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الخطوات المتسلسلة التي توضح تطور البروتوكول. (أ–د) استخراج المخ من الجمجمة وفصل المخيخ عن بقية المخ. (ﻫ) مرفق في الدماغ على قرص فيبرتوم ونقل إلى غرفة التشريح، وهو محاط بالجليد ومليئة بالبرد قام اﻷوكسيجين باستمرار خلال تشريح. (و) الدماغ الاكليلية تمزيقها. (ز) مجموعة من الشرائح، التي تحتوي على روسترال (R) ومتوسطة (أنا)، وهياكل (ج) والذيلية forebrain القاعدية. (ح) الفصل بين المقاطع في اثنين هيميسليسيس مطابقة. (أنا) كل هيميسيكشن يوضع في قنينة المقابلة لها. قارورة (ي) المتمركزة في الدعم، داخل المربع جهاز ومغلقة بشكل منفصل. (ك) حضانة فترة عند اتصال النظام إلى مصدر الأوكسجين (دائرة سوداء). (ل) تجانس العينات بعد العلاج. يتم تعديل هذا الرقم من22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: T30 بوساطة التعبير الخاصة بالموقع من α7-ناشر، فتاو، و Aβ على طول المحور فرنك بلجيكي rostro-والذيلية. (أ) تمثيل شرائح الاكليلية المخ بما في ذلك نواة forebrain القاعدية (الخطوط المنقطة البيضاء)، مقسمة إلى جزأين مكملة وتتعرض لظروف مختلفة. (ب) T30 بعد التعرض، مستقبلات النيكوتين يظهر زيادة كبيرة في تقسيم الأمامي (T30 1) وانخفاض ملحوظ في مؤخرة واحدة (T30 3) بالمقارنة مع الجانبين عنصر التحكم المطابق (ctrl 1 و ctrl 3). لا يتم عرض الشريحة المتوسطة أي تغيير بين الشرطين (ctrl 2، T30 2). (ج) فتاو التعبير أعلى بكثير في الجزء روسترال المعالجة (T30 1) على نظيرتها مطابقة التحكم (ctrl 1)، بينما شريحتين أخرى لا تكشف عن أي فرق في المجموعتين (شريحة 2 وشريحة 3). يعرض Aβ (د) زيادة كبيرة في الأمامية والمتوسطة تعامل التقسيمات الفرعية (T30 1 و T30 2) بالمقارنة مع الجانبين غير المعالجة المقابلة (ctrl 1 و ctrl 2). في المقاطع والذيلية، هناك لا اختلاف بين المجموعتين. أشرطة الخطأ تشير إلى sem. * ف < 0.05.n = (هيميسليسيس كل مجموعة، الجرذان) هو (27، 9). شريط مقياس من 1 مم. وقد تم تعديل هذا الرقم من22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجانب الرئيسي من هذا البروتوكول، استناداً إلى تقنية الدماغ راسخة السابقين فيفو ، يسمح بشكل متزامن اختبار اثنين هيميسليسيس براق، التي تم الحصول عليها من نفس الطائرة التشريحية، رصد استجابتها بعد تطبيق محدد الشرط (السيطرة أو معاملة)؛ ولهذا يقدم نموذج تجريبي لرقابة مشددة قدر الإمكان. إمكانية تقييم في الوقت والجرعة، وطريقة خاصة بالموقع neurochemicals مختلفة تتصل بضعف الخلايا العصبية، كما رأينا خلال الأحداث الأعصاب22، يمثل سمة أساسية. وتربط هذه المنهجية مزايا بيئة الفسيولوجية في فيفو مع تلك التي في المختبر الاستعدادات، مثل الدقة في الحصول على منطقة الفائدة وخلق سياق خارج الخلية مثالية. ويمثل هذا البروتوكول لتكيف من الدماغ شيوعاً التقطيع الداخلي المستخدمة على نطاق واسع السابقين فيفو التسجيلات الكهربية25،،من2627 و التصوير الضوئي28، 29،30، أو في المختبر أورجانوتيبيك الشرائح، التي تحاكي توثيق حالة في فيفو بتمكين الحفاظ على كلا التنظيم الهيكلي ومتشابك23،24 ،،من3132.
وعلاوة على ذلك، يمكن أن يساعد هذا الإجراء تقليل عدد الحيوانات المستخدمة في الدراسات السلوكية حيث أنه يتطابق جزئيا في فيفو-مثل حالة، التي يمكن اعتمادها لتأكيد في المختبر البيانات، مثل زراعة الخلايا و التحليل المناعي، وثم توقع في فيفو التجارب.
ويعرض المنهجية المقترحة أيضا بعض القيود، مثل سمك الباب والنزاهة التي، عندما لا يكون ذلك مناسباً، يمكن أن يغير النتيجة النهائية. وقت الحضانة أيضا أحد مكونات أساسية لهذا الأسلوب نظراً لأنها قد تؤثر على المقارنة بين مجموعة التحكم والمعالجة. وباﻹضافة إلى ذلك، سلسلة من المشاكل الإجرائية أو التقنية يمكن أن تواجهها أثناء جميع الخطوات للبروتوكول، مثل: (1) الأضرار الميكانيكية أثناء استخراج أو تمزيقها الدماغ، والتي يمكن تجنبها بمعالجة دقيقة ورقيقة من النسيج؛ (2) العائمة هيميسليسيس خلال الحضانة بسبب تدفق الأوكسجين مفرطة، التي يمكن أن تضر النسيج ميكانيكيا إذا أنها تمس الإبرة الأكسجين غارقة في قام، مما يؤثر على سلامته. وهذا يمكن الوقاية منها عن طريق ضبط معدل الحد الأدنى السطح؛ وغياب (3) أو تدفق الأوكسجين إينكونستانت، الذي يمكن أن يرتبط باسطوانة فارغة، أو الضرر أو انقطاع في نظام الأنابيب، وسد العجز في الإبرة الأكسجين، أو عندما فإنه يتم لا بشكل صحيح غارقة في قام. منذ الأوكسجين المستمر وتدفقها في جميع أنحاء هذا الإجراء يمثل أحد الجوانب الأكثر أهمية لهذا البروتوكول، من المهم كثيرا رصد جميع هذه المعلمات للإبقاء على شرط متجانسة بين مجموعات التحقيق.
تمثل خطوات حاسمة أخرى في البروتوكول بالإطارات الزمنية المطلوبة للقيام بكل العمل، يتبع عند إرادة الحفاظ على قدر ممكن السلامة، والأداء الوظيفي للأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، لتقييم هذه المعايير، يمكن إجراء التحليل المناعي للكشف عن علامات محددة تتصل ببقاء الخلايا العصبية والتسجيلات الكهربية كما هو موضح سابقا23،29.
تتجاوز النتائج المذكورة هنا، يمكن أن يكون هذا الأسلوب التصميم المخصص لتحقيقات محددة. على سبيل المثال، فإنه يمكن تطبيقها على: الدماغ رصد (1) ومقارنة نشاط مركبات مختلفة في عدة مجالات، تفرخ لهم مع الحل المحدد، مثل متوسط نيوروباسال؛ أو قام (2) إجراء دراسات على نقص، حيث يمكن التحكم تدفق الأوكسجين بشكل انتقائي في كل هيميسيكشن؛ (3) التحقيق في خصائص أنسجة الدماغ من نماذج الحيوانات المحورة وراثيا من أمراض مختلفة؛ (4) في أن واحد، على نفس المستوى التشريحية، استكشاف الآثار في فيفو حقن الدماغ الانفرادية ومقارنتها مع مراقبة نصف الكرة الأرضية؛ و (5) استكشاف الخصائص أو الأنسجة الأخرى، ولذلك يحتمل أن تيسير والحد من طول المخدرات مراقبة المحاكمات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن الكتاب تضارب المصالح المالية. سوزان غرينفيلد ألف هو مؤسس ورئيس العصبية الحيوية المحدودة وهي شركة مملوكة للقطاع الخاص، ويحمل أسهم في الشركة. Brai إيمانويل وكوجوني انطونيلا موظفون من العصبية الحيوية المحدودة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل بالعصبية الحيوية المحدودة. نود أن نشكر الدكتور سيرجيو Rotondo (العصبية-الحيوية) والدكتور جيوفاني فراتي للتعليقات والمشورة بشأن المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
References
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer's Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical? Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show? Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
