Summary
Presenteren we een methode die kan nadere inzichten in de vroege gebeurtenissen onderliggende neurodegeneratie en gebaseerd op de gevestigde ex-vivo hersenen techniek, combineren de voordelen van in vivo en in vitro experimenten. Bovendien heeft het een unieke kans voor directe vergelijking van behandelde en onbehandelde groep in hetzelfde anatomische vlak vertegenwoordigt.
Abstract
Ondanks talrijke studies die probeert te ontwikkelen betrouwbare diermodellen, welke als gevolg van de primaire onderliggende neurodegeneratie processen, zijn zeer weinigen algemeen aanvaard. Hier stellen wij een nieuwe procedure aangepast uit de bekende ex vivo hersenen segment techniek, die een dichter in vivo biedt-als scenario dan in vitro preparaten, voor het onderzoeken van de vroege gebeurtenissen triggering cel degeneratie, als waargenomen in de ziekte van Alzheimer (AD). Deze variatie bestaat uit eenvoudige en gemakkelijk reproduceerbaar stappen, waarmee behoud van de anatomische cytoarchitecture van de geselecteerde hersenen-regio en de lokale functionaliteit in een fysiologische milieu. Verschillende anatomische gebieden kunnen worden verkregen van de dezelfde hersenen, bieden de mogelijkheid voor het uitvoeren van meerdere experimenten met de behandelingen in kwestie in een site - dosis- en tijd-afhankelijke manier. Mogelijke beperkingen die invloed kunnen hebben op de resultaten die aan deze methode gerelateerde gerelateerd zijn aan het behoud van het weefsel, dat wil zeggen, de handhaving van de anatomische integriteit tijdens het snijden en incubatie stappen en de dikte van de sectie, die kunnen beïnvloeden de biochemische en immunohistochemische analyse. Deze aanpak kan worden gebruikt voor verschillende doeleinden, zoals het verkennen van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de fysiologische of pathologische voorwaarden, drug screening of testen van de dosis-respons. Dit protocol kan ten slotte ook verminderen het aantal dieren in loondienst in behavioral studies. De toepassing gemeld hier is onlangs beschreven en getest voor de eerste keer op ex vivo rat hersenen segmenten met de basale reukkolf (BF), die tot de cerebrale regio's voornamelijk beïnvloed in AD behoort. In het bijzonder is gebleken dat het beheer van een giftige peptide afgeleid van de C-terminus van acetylcholinesterase (AChE) zou kunnen een AD-achtige profiel vragen, triggering, langs de as antero-posterior van de BF, een differentiële expressie van eiwitten gewijzigd in AD, zoals de alpha7 nicotinerge receptor (α7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau) en bèta amyloid (Aβ).
Introduction
AD is dat een chronische pathologie gekenmerkt door geleidelijke neurodegeneratieve stoornis op het gebied van verschillende hersengebieden, zoals de Entorinale cortex (EG), BF, hippocampus (HC) en bulbus olfactorius (OB)1,2,3, 4,5. De late stadia van AD ontwikkeling leiden tot een geleidelijke daling van de cognitieve, waardoor deze ziekte de meest voorkomende vorm van dementie, ongeveer goed voor 70% van alle gevallen6. Ondanks uitgebreide pogingen om te begrijpen van de beginfase veroorzaakt AD, is er momenteel niet een gedefinieerde experimentele indicatie ophelderen van hen. Bovendien, de meest populaire theorie - de "amyloïde hypothese" - is steeds meer in twijfel getrokken omdat het voorziet niet in een compleet profiel in het verklaren van de AD-pathobiology, noch een farmaceutische doel dat heeft bewezen effectieve7,8 ,9.
Een alternatieve theorie, die steeds meer aandacht krijgt suggereert dat de oorspronkelijke mechanismen die zich voordoen tijdens neurodegeneratie zijn gerelateerd aan een neuronale cluster vooral gevoelig in AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. deze heterogene cellulaire hub omvatte binnen de BF, veroorzaakt en hersenstam, projecten aan veelvoudige gebieden, zoals de EG, HC en OB15,16. Ondanks haar diversiteit in neuronale morfologie en synthese van de neurotransmitter deelt deze kern van cellen een gemeenschappelijk kenmerk in het uiten van pijn, die ook een niet-enzymatische functie17,18kan hebben. Deze niet-klassieke rol als een roman signalering molecuul bemiddelt calcium (Ca2 +) stroom in neuronen die kan ondergaan trofische of giftige gebeurtenissen met betrekking tot Ca2 + dosis, beschikbaarheid en neuronale leeftijd17,18 , 19.
Tijdens neurodegeneratie, misschien de waargenomen cellulaire verlies wel daarom gekoppeld aan deze niet-enzymatische functie17,18,20, die te wijten is aan een 30mer peptide (T30) gekloofd uit de AChE C-terminus 20. in overeenstemming met de resultaten van de vorige, uitgevoerd op celcultuur en optische beeldvorming18,21 preparaten, we laten zien, door middel van een nieuwe benadering, gebaseerd op ex vivo rat hersenen segmenten met BF structuren, die T30 geïnduceerde een AD-achtige profiel22. Specifiek, biedt deze nieuwe methodiek een meer fysiologische scenario dan celkweek aangezien het onderhoudt veel van de kenmerken van een intact weefsel, variërend van anatomische aan circuits behoud, zij het om een tijdsinterval van uren. We toegepast dit protocol om te verkennen van de gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens de vroege stadia van neurodegeneratie, toezicht op het acute respons T30 voor de aanvraag.
Ondanks de grote hoeveelheid literatuur over het gebruik van hersenen segmenten te onderzoeken van moleculaire pathways geïmpliceerd in neuronale schade of neurogenese23,24, dit protocol voorziet in de eerste keer een meer directe en gevoelige voorgelezen in vergelijking het gemeenschappelijk gebruik van segmenten van de organotypic. Echter kan is het geval voor organotypic hersenen secties, deze acute segment procedure ook worden vastgesteld voor verschillende doeleinden, zoals de beoordeling van neuroprotectieve of neurotoxische moleculen, ontdekking van primaire moleculaire veranderingen in een specifiek proces, analyse van Immunohistochemical en farmacologische testen voor centraal zenuwstelsel gerelateerde aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn uitgevoerd onder goedgekeurde protocollen.
Opmerking: In deze sectie, de volgorde van de belangrijkste fasen uitgevoerd tijdens de experimentele procedure en de voorgestelde tijdsinterval wordt verstrekt (Figuur 1). Een stapsgewijze beschrijving van het protocol wordt bovendien aangevuld met een illustratieve paneel, tonen van kritische acties variërend van verwijdering van de hersenen tot weefsel homogenisering na de incubatieperiode (Figuur 2). De details over de materialen en de instructies te bouwen de apparatuur en de daaropvolgende fase voor de WB-analyse zijn eerder beschreven22.
1. chirurgische instrumenten, Vibratome instellingen en voorbereiding van de behandeling
Opmerking: Voer de volgende stappen uit voordat u begint van de experimentele procedure:
- Bereiden van twee verschillende kunstmatige cerebrospinaal vocht (aCSFs), gebruikt voor het snijden van de hersenen en de andere voor de incubatie stap29zoals hiervoor is beschreven. Kortom, de concentraties van de werken (in mmol) van de twee aCSFs zijn voor de "snijden" aCSF: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4en 10 glucose; 6.7 HEPES zout en 3.3 HEPES zuur; pH: 7.1. Wijl voor de "opname" aCSF: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH2PO4en 10 glucose; pH: 7.1.
- Meng goed de oplossingen op ijs gezet en het snijden aCSF zuurstof om het koude tijdens het verwijderen van de hersenen en de daaropvolgende segmenteren. Houd bij kamertemperatuur (RT) en levering zuurstof naar de aCSF van de opname.
- Plaats de instrumenten onder de motorkap van de dissectie voor de verwijdering van onthoofding en hersenen, d.w.z.guillotine, chirurgische dissectie kit (schaar, pincet, messen) en spatel.
- De vibratome parameters instellen door de dikte van het segment (300 µm in deze voorbereiding) en de frequentie op 7 en de snelheid 6 te selecteren. Plaats de vibratome kamer in een passende ruimte en eromheen met ijs.
- Open de klep van de carbogen (95% O2, 5% CO2) om de "snijden" (aCSF) tijdens de segmentering van de hersenen zuurstof. Selecteer het minimale debiet, rond 2 mL/min.
- Neem twee 15-mL buizen ter voorbereiding van de voorwaarden om te testen. Voeg in één buis 10 mL van de "opname" aCSF alleen (controlegroep) en in de andere 10 mL van de "opname" aCSF verrijkt met T30 bij een concentratie van 2 µM (behandelde groep). Vortex zowel buizen en houd ze op het ijs tot het gebruik ervan in de voorbereidingsfase van de installatie (sectie 3).
2. anesthesie, hersenen extractie en snijden
Opmerking: In deze studie, 9 wild type P14 mannelijke Wistar ratten werden gebruikt. Hersenen extractie en de daaropvolgende snijden vormen een cruciaal onderdeel van het protocol, aangezien ze snel (binnen 10 min) moeten worden uitgevoerd om te voorkomen of op zijn minst vertragen weefsel degeneratie processen.
- Voeg 1,5 mL 100% w/w van Isofluraan op een laag van katoen in de bedwelmingsruimte inductie, plaats het dier binnen en sluit het deksel. Wacht totdat het dier is diep verdoofd, bevestiging van de afwezigheid van de pedaal reflex, en vervolgens het onthoofden van het dier met behulp van de guillotine.
- Houd het hoofd van het dier in een pot met ijskoude aCSF snijden tijdens de hersenen verwijdering stap (figuur 2A -C).
- Incise van de huid over de schedel met een chirurgisch mes, dan snijd de schedel met behulp van schaar na de middellijn, vanaf de achterste gedeelte en anteriorly overgaan tot het bereiken van het bot boven de OBs (figuur 2A).
- Trek lateraal de twee zijkanten van de schedel met behulp van een paar pincet om toegang te krijgen naar de hersenen (figuur 2B). Invoegen van een spatel ventrally naar de hersenen, schep voorzichtig het uit, en houd die het gehydrateerd in ijskoude "snijden" aCSF voor ongeveer 5 min (figuur 2C).
- Vervreemden van de hersenen op filterpapier en knip het cerebellum met behulp van een mes (figuur 2D). Lijm de hersenen verticaal op de schijf van vibratome en plaatst u deze in de vectorafbeeldingsbestanden kamer, vul hem met ijskoud "snijden" aCSF en leveren van zuurstof (figuur 2E).
- Het interval voor snijden aanpassen, en ga verder met de hersenen segmenteren (figuur 2F). Het verzamelen van de secties met de regio van belang, zoals het mediale septum (MS), diagonale band van Broca (DBB) en substantia innominata (SI), als eerder beschreven22. Van boven naar beneden bevatten de drie segmenten de rostraal (R), intermediate (I) en caudal (C) gedeelte van de BF (Figuur 2 g).
- Verdelen langs de middellijn van elke sectie met een kleine schaar, verkrijgen van twee spiegelende hemislices (Figuur 2 H), individueel gebruikt als de controle en de behandelde aandoening op hetzelfde anatomische vlak.
- Houden de hemisections in de zaal van de vibratome voor 5-10 minuten, waarna ze met een glazen pipet vervolgens overbrengen naar een borrelende pot met opname aCSF. Houd op RT gedurende ongeveer 30 minuten om te herstellen.
- Vul, in de tussentijd, drie glazen flesjes met 3 mL opname aCSF alleen (eerder bereid in stap 1.6 voor de controlegroep) en drie flesjes met 3 mL aCSF verrijkt met T30 (eerder bereid in stap 1.6) voor de behandelde groep.
3. setup voorbereiding
- Breng de hemisections in hun bijbehorende glazen flesjes (figuur 2I) om drie opeenvolgende hemislices (met inbegrip van de rostraal, intermediate en caudal BF-regio) voor de controlegroep (groene frame, figuur 2J) en hun bijpassende tegenhangers voor de behandelde groep (onderstel rood, figuur 2J).
- Overdracht van het hersenweefsel met twee verschillende penselen, één voor de hemislices van de controle en een andere voor de behandelde tegenhangers, om te voorkomen dat elke besmetting tussen voorwaarden.
- Zegel van elke glazen ampul met de bijbehorende deksel, presentatie van de zuurstofverrijkende naald (21G) (figuur 2J). De belangrijkste buis van het apparaat verbinden met de bron van de carbogen (Figuur 2 K). Zuurstof aan de hemislices gedurende de incubatieperiode met een minimale stroomsnelheid van 2 mL/min leveren om te voorkomen dat elke beweging van het hersenweefsel en de mogelijke mechanische schade tijdens het experiment. Start de incubatie 5 h. Het uitvoeren van de stappen 3.1-3.3 binnen 5 min.
Opmerking: Check regelmatig (elke 15-20 min) of de zuurstof wordt geleverd in alle de flesjes en dat de stroom niet het weefsel is beweging van beneden.
4. monster homogenisering
- De zuurstof stroom stoppen na de incubatie en verwijder alle de deksels van de flesjes. Overdracht van de hemislices, met behulp van de juiste borstels, in 1,5 mL buizen met 250 µL van lysis buffer, behoud van de buizen op ijs (Figuur 2 L). Te maken van de lysis buffer, meng PBS 1 x met fosfatase en protease remmers cocktails zowel verdund op 1:100, en meng het weefsel met verschillende pestles om te voorkomen dat besmetting onder de monsters. Voltooi deze acties binnen 10-15 min.
- Centrifugeer de hersenen lysate bij 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Breng het supernatant in nieuwe buizen en houden van de monsters bij-80 ° C.
5. aflezen van de eiwitconcentratie en westelijke vlekkenanalyse
- De eiwitconcentratie van elk monster te bepalen en vervolgens de aliquots voorbereiden door westelijke vlekkenanalyse als eerder beschreven22.
- Statistische analyses om te evalueren van de effecten van de behandeling op eiwit expressie uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier gepresenteerde protocol geeft aan dat de administratie van een giftige peptide, T30, in een site-afhankelijke manier de uitdrukking van α7-nAChR, p moduleert-Tau en Aβ in BF-bevattende secties (figuur 3A). De nicotinerge receptor toont een aanzienlijke stijging in de rostraal-behandeld hemislice in tegenstelling tot zijn tegenhanger van de controle (segment 1, p = 0.0310) (figuur 3B), terwijl de tussenliggende segment wijzigingen tussen de twee voorwaarden (niet onthullen segment 2, p = 0.1195) (figuur 3B). In het achterste gedeelte is een significante vermindering van aanwezig in het gedeelte T30-blootgesteld over zijnerzijds controle (slice 3, p = 0.0476) (figuur 3B). Op verzoek van de T30, p-Tau niveaus zijn aanzienlijk verhoogd regio anterior tegen het besturingselement bijpassende kant (segment 1, p = 0.0158) (Figuur 3 c). Aan de andere kant, de andere twee BF-bevattende secties vertonen geen significant verschil tussen de voorwaarden (segment 2, p = 0.1014; Snijd 3, p = 0.6405) (Figuur 3 c). Na T30 blootstelling, Aβ is aanzienlijk verbeterd in de rostraal en tussenliggende hemisections in vergelijking met hun onbehandelde contralaterale gedeelten (segment 1, p = 0.0136; snijd 2, p = 0.0109) (figuur 3D). In het caudal segment, er is geen verandering tussen de twee behandelingen (slice 3, p = 0.1231) (figuur 3D). Het primaire antilichaam tegen p-Tau herkent de epitoop met de gefosforyleerd Ser202 residu. Het primaire antilichaam tegen Aβ detecteert diverse isoforms, variërend van Aβ37 tot Aβ42. Gegevens werden geanalyseerd zoals eerder beschreven22 met behulp van twee tailed gepaarde t-test en vertegenwoordigd als SEM. N = (hemislices per groep, ratten) is (27, 9).
Figuur 1: volgorde en indicatief tijdschema van de belangrijkste stappen die zijn uitgevoerd gedurende de experimentele procedure. Het tijdsverloop en het voltooien van de eerste en de derde stap kan variëren met betrekking tot de exploitant ervaringsniveau. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: opeenvolgende stappen illustreren de protocol progressie. (A-D) Extractie van de hersenen van de schedel en de scheiding van het cerebellum van de rest van de hersenen. (E) bevestiging van de hersenen op de vibratome schijf en de overdracht in de kamer van de dissectie, die is omgeven door ijs en gevuld met koude aCSF voortdurend zuurstof tijdens het snijden. (F) coronale hersenen segmenteren. Collectie van de (G) van de segmenten, met rostraal (R), intermediate (ik), en caudal (C) structuren van de basale reukkolf. (H) scheiding van de secties in twee bijpassende hemislices. (ik) elke hemisection in de overeenkomstige flacon is geplaatst. (J) flesjes geplaatst in de steun, in de doos van de apparatuur en afzonderlijk gesloten. (K)-incubatie periode bij de verbinding van het systeem naar de bron van zuurstof (zwarte cirkel). (L) homogenisering van de monsters na de behandeling. Dit cijfer wordt gewijzigd van22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: T30 gemedieerde site-specific uitdrukking van α7-nAChR, p-Tau en Aβ langs de BF rostro-caudal as. (A) vertegenwoordiging van hersenen coronale segmenten met inbegrip van basale reukkolf kernen (witte stippellijnen), verdeeld in twee complementaire delen en blootgesteld aan verschillende voorwaarden. (B) na T30 blootstelling, de nicotinerge receptor toont een aanzienlijke stijging in het anterior deelvak (T30 1) en een duidelijke vermindering in de posterior een (T30 3) in vergelijking met de overeenkomstige zijden van de control (ctrl 1 en ctrl 3). Het tussenliggende segment toont geen wijzigingen tussen de twee voorwaarden (CTRL + 2, T30 2). (C) p-Tau expressie is significant hoger in de behandelde rostraal gedeelte (T30 1) over de overeenkomende tegenhanger van de control (CTRL + 1), terwijl de andere twee segmenten niet enig verschil in de twee groepen (segment 2 en segment 3 onthullen). (D) Aβ toont een aanzienlijke stijging in de anterior en tussenliggende behandelde deelsectoren (T30 1 en T30 2) ten opzichte van hun bijbehorende onbehandelde zijden (ctrl 1 en ctrl 2). In de caudal secties is er geen variatie tussen de twee groepen. De foutbalken geven SEM. * p < 0.05.n = (hemislices per groep, ratten) is (27, 9). De bar van de schaal is 1 mm. Dit cijfer is gewijzigd van22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belangrijkste aspect van dit protocol, gebaseerd op de reeds lang gevestigde ex vivo hersenen techniek, maakt het mogelijk om synchroon test twee spiegelende hemislices, verkregen uit hetzelfde anatomische vlak, toezicht op hun reactie na de toepassing van een specifieke voorwaarde (controleren of behandeling); Dit biedt dus een experimentele paradigma zo strak mogelijk worden gecontroleerd. De mogelijkheid om in een tijd - dosis- en site-specifieke wijze verschillende neurotransmitters aan neuronale bijzondere waardevermindering, gerelateerde te evalueren, zoals gezien tijdens neurodegeneratieve gebeurtenissen22, vertegenwoordigt een essentieel kenmerk. Deze methode verbindt de voordelen van een in vivo fysiologische omgeving met die van de in vitro preparaten, zoals nauwkeurigheid bij het verkrijgen van de regio van belang en het creëren van de ideale extracellulaire context. Dit protocol vertegenwoordigt een aanpassing van de gemeenschappelijke hersenen snijden procedure op grote schaal gebruikt voor ex vivo elektrofysiologische opnamen25,26,27 en optische beeldvorming28, 29,30, of in vitro organotypic segmenten, die een dichter in vivo situatie simuleren doordat het behoud van zowel structurele en synaptische organisatie23,24 ,31,-32.
Voorts zou deze procedure kan helpen om het aantal proefdieren in behavioral studies omdat het gedeeltelijk een in vivo repliceertte verlagen-zoals aandoening, die kan worden aangenomen om te bevestigen in vitro gegevens, zoals de celcultuur en analyse van Immunohistochemical, en vervolgens anticiperen in vivo experimenten.
De voorgestelde methodologie presenteert ook enkele beperkingen, zoals de dikte van de sectie en de integriteit die, indien niet nodig, het eindresultaat kunt wijzigen. De incubatietijd is ook een fundamenteel onderdeel van deze techniek, omdat het invloed kan zijn op de vergelijking tussen de controlegroep en de behandelde. Daarnaast een aantal procedurele of technische problemen kan worden opgetreden tijdens alle stappen van het protocol, zoals: (1) mechanische schade terwijl het extraheren of het segmenteren van de hersenen, die kan worden vermeden door precieze en zachte behandeling van het weefsel; (2) drijvende van de hemislices tijdens de incubatie als gevolg van een overmatige zuurstof stroom, die mechanisch aan het weefsel schade kan als het raakt de zuurstofverrijkende naald ondergedompeld in de aCSF, dus die zijn integriteit. Dit kan worden voorkomen door aanpassing aan het minimumtarief het borrelen; en (3) het ontbreken of zuurstof stroom, die kan worden gerelateerd aan de lege bus, een beschadiging of de verbinding wordt verbroken in de buis systeem, een plug in de zuurstofverrijkende naald, of wanneer het niet goed is ondergedompeld in de aCSF. Aangezien de constante oxygenatie en haar stroom gedurende de hele procedure vertegenwoordigt een van de meest kritieke aspecten van dit protocol, is het belangrijk om te vaak controleren al deze parameters om een homogene voorwaarde tussen de onderzochte groepen.
Andere kritische stappen in het protocol zijn vertegenwoordigd door de tijd om windows moet u elke handeling uitvoert, die toen volgde wil behouden zo veel als mogelijk de integriteit en de functionaliteit van het weefsel. Bovendien, om te beoordelen deze parameters, kan immunohistochemische analyse worden uitgevoerd om te detecteren van specifieke markers gerelateerde neuronale levensvatbaarheid te elektrofysiologische opnamen als eerder beschreven23,29.
Buiten de resultaten die hier worden beschreven, zou deze methode ontworpen ad hoc voor specifieke onderzoeken. Bijvoorbeeld, het kan worden toegepast op: (1) monitor en vergelijk de activiteit van de verschillende stoffen in verschillende brain gebieden, ze aan het broeden met de geselecteerde oplossing, zoals aCSF of Neurobasal medium; (2) uitvoeren van studies op hypoxie, omdat de zuurstof stroom selectief kan worden gecontroleerd in elke hemisection; (3) onderzoeken hersenen weefsel eigenschappen van transgene diermodellen van verschillende ziekten; (4) tegelijkertijd verkennen, hetzelfde handelsstadium anatomische, de gevolgen van in vivo unilaterale hersenen injecties en vergelijk ze met het besturingselement halfrond; en (5) verkennen andere organen of weefsels eigenschappen, dus potentieel en te vergemakkelijken en de lengte van de drug screening proeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren concurrerende financiële belangen. Susan A. Greenfield is de oprichter en voorzitter van Neuro-Bio Limited, een particulier bedrijf, en bezit aandelen in de vennootschap. Emanuele Brai en Antonella Cogoni zijn werknemers van Neuro-Bio Ltd.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Neuro-Bio Ltd. Wij wil Dr. Giovanni Ferrati en Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) bedanken voor hun opmerkingen en advies over het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
References
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer's Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical? Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show? Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
