Summary
Se presenta un método que puede proporcionar más información sobre los eventos principios subyacentes a la neurodegeneración y basado en la técnica de cerebro establecido ex vivo , combinando las ventajas de los experimentos en vivo y en vitro . Además, representa una oportunidad única para comparación directa del grupo tratado y no tratado en el mismo plano anatómico.
Abstract
A pesar de numerosos estudios que intentan desarrollar modelos animales confiables que refleja la primaria procesos de neurodegeneración subyacente, muy pocos han sido ampliamente aceptados. Aquí, proponemos un nuevo procedimiento de adaptación de la conocida ex vivo cerebro rebanada técnica, que ofrece un más de cerca en vivo-como escenario de preparativos en vitro , para investigar los acontecimientos tempranos provocando degeneración de célula, como observado en la enfermedad de Alzheimer (AD). Esta variación consiste en pasos simples y fácilmente reproducibles, que permiten la preservación de la Citoarquitectura anatómico de la región seleccionada del cerebro y su funcionalidad local en un medio fisiológico. Pueden obtenerse diferentes áreas anatómicas del cerebro mismo, brindando la oportunidad de realizar múltiples experimentos con los tratamientos en cuestión en un sitio, dosis y forma dependiente del tiempo. Limitaciones potenciales que puedan afectar a los resultados relacionados con esta metodología se relacionan con la conservación del tejido, es decir, el mantenimiento de su integridad anatómica durante los pasos de incubación y corte y el espesor de la sección, que puede influir en el bioquímico y el análisis immunohistochemical. Este enfoque puede ser empleado para diferentes fines, como explorar mecanismos moleculares implicados en condiciones fisiológicas o patológicas, detección de drogas o ensayos dosis-respuesta. Por último, este protocolo también podría reducir el número de animales empleados en estudios de comportamiento. La aplicación aquí ha sido recientemente descrita y probado por primera vez en vivo ex rebanadas de cerebro rata, que contiene el prosencéfalo basal (BF), que es una de las regiones cerebrales afectadas principalmente en AD. En concreto, se ha demostrado que la administración de un péptido tóxico derivado de la c-terminal de la acetilcolinesterasa (AChE) podría sugerirán el un anuncio como perfil, disparo, a lo largo del eje antero-posterior del BF, una expresión diferencial de las proteínas alteradas en DC, como el receptor nicotínico alpha7 (α7-nAChR), fosforilada (P-tau) del Tau y amiloide beta (Aβ).
Introduction
AD es que una patología crónica caracterizada por deterioro neurodegenerativo progresivo que afecta a diversas áreas del cerebro, tales como la corteza entorrinal (CE), BF, hipocampo (HC) y el bulbo olfatorio (OB)1,2,3, 4,5. Las etapas finales de desarrollo AD conducen a un deterioro cognitivo progresivo, que esta enfermedad la forma más común de demencia, representando aproximadamente el 70% de los casos6. A pesar de intentos amplia para entender las etapas iniciales que causan AD, no hay actualmente una indicación experimental definida elucidarlos. Además, la teoría más popular - la "hipótesis del amiloide" - es cada vez más puesta en duda ya que no provee un perfil completo en la explicación de la Patobiología de la AD, ni un objetivo farmacéutico que ha demostrado ser eficaz7,8 ,9.
Una teoría alternativa que está recibiendo atención cada vez mayor sugiere que los mecanismos iniciales que ocurren durante la neurodegeneración están relacionados con un grupo neuronal principalmente susceptible en AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. el rodete celular heterogéneo englobado dentro de los proyectos BF, mesencéfalo y médula oblonga, para varias regiones, tales como la CE, HC y OB15,16. A pesar de su diversidad en la morfología neuronal y la síntesis del neurotransmisor, este núcleo de células comparte una característica común en la expresión de dolor, que puede tener también una función no-enzimática17,18. Este papel no clásico como una novela de señalización molécula media flujo de calcio (Ca2 +) en las neuronas que puede someterse a eventos tóxicos o tróficos en relación con la dosis de Ca2 + y la disponibilidad neuronal edad17,18 , 19.
Durante la neurodegeneración, la pérdida celular observada podría ser, por tanto, asociada a esta función no enzimática17,18,20, que es atribuible a un péptido 30mer (T30) troceado de la C-terminal de dolor 20. en consonancia con los resultados anteriores, en cultivo celular y óptica de18,21 preparados, hemos demostrado, a través de un novedoso enfoque basado en ex vivo las rebanadas de cerebro de rata en que contienen estructuras BF, que T30 un perfil de AD-como22. En concreto, esta nueva metodología ofrece un escenario más fisiológico que la cultura de célula ya que mantiene muchas de las características de un tejido intacto, desde anatómicos a la preservación de los circuitos, aunque para una ventana de tiempo de horas. Hemos aplicado este protocolo para explorar los eventos que tienen lugar durante las primeras fases de la neurodegeneración, monitoreo de la respuesta aguda al T30 aplicación.
A pesar del gran cuerpo de literatura sobre el uso de cerebro rebanadas para investigar vías moleculares implicadas en el daño neuronal o neurogénesis23,24, este protocolo proporciona por primera vez una más inmediata y sensible a la lectura en comparación con para el uso común de organotypic rebanadas. Sin embargo, como es el caso de organotypic secciones del cerebro, este procedimiento de rebanada aguda puede también adoptar para varios propósitos, tales como la evaluación de neuroprotectores o moléculas neurotóxicas, descubrimiento de primarios cambios moleculares que ocurren en un proceso específico, el análisis de immunohistochemical y ensayos farmacológicos para el sistema nervioso central relacionados con patologías.
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Protocol
Todos los estudios en animales se han realizado bajo protocolos aprobados.
Nota: En esta sección, la secuencia de las fases principales realizadas durante el procedimiento experimental y el intervalo de tiempo sugerido se proporciona (figura 1). Por otra parte, una descripción paso a paso el protocolo se complementa con un panel ilustrativo, con acciones que van desde la extracción de cerebro a homogeneización de tejidos después de la incubación (figura 2). Los datos sobre los materiales y las instrucciones para construir el aparato y la fase posterior para el análisis de la WB son previamente descrito22.
1. quirúrgicos herramientas, configuración de Vibratome y preparación tratamiento
Nota: Ejecutar los siguientes pasos antes de comenzar el procedimiento experimental:
- Preparar dos diferentes artificiales líquidos cerebroespinales (aCSFs), se utiliza para el corte del cerebro y el otro para el paso de incubación como describió anteriormente29. Brevemente, las concentraciones de trabajo (en mmol) de las dos aCSFs son para la aCSF "rebanar": NaCl 120, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 de MgSO4, 1,2 KH2PO4y glucosa 10; 6.7 HEPES de sal y ácido 3,3 de HEPES; pH: 7,1. Mientras que para la aCSF "grabando": 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH2PO4y glucosa 10; pH: 7,1.
- Mezclar bien las soluciones y después en el hielo y oxigenar la aCSF corte para que el frío mientras se quitan el cerebro y la sección posterior. Mantener a temperatura ambiente (RT) y suministro de oxígeno a la aCSF grabación.
- Colocar los instrumentos bajo el capó de la disección para la eliminación de decapitación y cerebro, es decir, guillotina, kit de disección quirúrgica (tijeras, pinzas, cuchillas) y espátula.
- Configurar los parámetros de vibratome eligiendo el grosor de corte (300 μm en esta preparación) y la frecuencia en la 7 y la velocidad en 6. Introduzca la cámara vibratome en su espacio correspondiente y lo rodean con hielo.
- Abra la válvula de carbogen (95% O2, 5% CO2) para oxigenar el "corte" (aCSF) durante el seccionamiento del cerebro. Seleccione el caudal mínimo, alrededor de 2 mL/min.
- Tomar dos tubos de 15 mL para preparar las condiciones para probar. Añadir en un tubo de 10 mL de la "grabación" aCSF sola (grupo control) y en la otra, 10 mL de la aCSF "grabando" enriquecido con T30 en una concentración de 2 μm (grupo tratado). Mezclar ambos tubos y mantenerse en hielo hasta su uso en la fase de preparación de la configuración (sección 3).
2. anestesia, extracción de cerebro y rebanar
Nota: En este estudio, se utilizaron 9 ratas Wistar macho tipo salvaje P14. Extracción de cerebro y posterior corte constituyen una parte fundamental del protocolo ya que debe ser rápidamente realizados (dentro de 10 min) para evitar o al menos retardar procesos de degeneración del tejido.
- Añadir 1,5 mL de 100% w/w de isoflurano sobre una capa de algodón en la cámara de inducción, coloque al animal dentro y cierre la tapa. Espere hasta que el animal está profundamente anestesiado, confirmando la ausencia del reflejo pedal y luego decapitar el animal mediante la guillotina.
- Mantener la cabeza del animal dentro de un pote que contiene helada corte aCSF durante la etapa de extracción del cerebro (figura 2A -C).
- Haga una incisión en la piel sobre el cráneo con una cuchilla quirúrgica, luego cortar el cráneo con unas tijeras siguiendo la línea media, desde la parte posterior y continuar hacia delante hasta llegar al hueso por encima de las OBs (figura 2A).
- Tire lateralmente los dos lados del cráneo con un par de pinzas para tener acceso al cerebro (figura 2B). Introduzca una espátula ventralmente al cerebro, cuchara suavemente hacia fuera y mantener hidratada en helada aCSF "rebanar" durante aproximadamente 5 minutos (figura 2).
- Deseche el cerebro en papel de filtro y cortar el cerebelo con una hoja (Figura 2D). Pegue el cerebro verticalmente sobre el disco de vibratome Inserte dentro de la cámara de seccionamiento, rellenarlo con helado "rebanar" aCSF y proveer oxígeno (Figura 2E).
- Ajustar el intervalo de corte y proceder con el seccionamiento del cerebro (figura 2F). Recoger las secciones que contiene la región de interés, como el tabique medial (MS), banda diagonal de Broca (DBB) y sustancia innominada (SI), como se describió anteriormente22. De arriba hacia abajo, tres rebanadas contienen la rostral (R), intermedio (I) y porción caudal (C) de la BF (figura 2).
- Dividir a lo largo de la línea media de cada sección con pequeñas tijeras, obteniendo dos hemislices especulares (figura 2 H), utilizado individualmente como el control y la condición tratada en el mismo plano anatómico.
- Mantener la hemisections en la cámara de vibratome durante 5-10 minutos, luego transferir con una pipeta de vidrio en una olla burbujeante que contiene grabación aCSF. Mantener a temperatura ambiente por aproximadamente 30 min para recuperarse.
- Llenar, mientras tanto, tres frascos de vidrio con 3 mL de grabación aCSF solo (previamente preparado en el paso 1.6 para el grupo de control) y tres frascos con 3 mL de la aCSF enriquecido con T30 (previamente preparado en el paso 1.6) para el grupo tratado.
3. preparación de la instalación
- Transferencia de la hemisections en sus correspondientes frascos de vidrio (figura 2I) para tener tres hemislices consecutivos (incluyendo la región rostral, caudal e intermediaria de BF) para el grupo de control (marco verde, figura 2J) y su con contrapartes para el grupo tratado (recuadro rojo, figura 2J).
- Transferir el tejido cerebral con dos cepillos diferentes, uno para la hemislices de control y otro para las contrapartes tratadas, para evitar cualquier contaminación entre condiciones.
- Sello de cada frasco de cristal con la tapa correspondiente, presentando la oxigenación aguja (21G) (figura 2J). Conecte el tubo principal del aparato a la fuente de carbogen (figura 2 K). Suministrar oxígeno a la hemislices durante todo el período de incubación con un caudal mínimo de 2 mL/min para evitar cualquier movimiento del tejido cerebral y posibles daños mecánicos durante el experimento. Iniciar la incubación de 5 h. Ejecutar los pasos 3.1-3.3 dentro de 5 minutos.
Nota: Compruebe con frecuencia (cada 15-20 min) si el oxígeno se suministra en todos los frascos y que su caudal no mueve el tejido de la parte inferior.
4. homogeneización de la muestra
- Detener el flujo de oxígeno después de la incubación y quitar todas las tapas de los frascos. La transferencia de la hemislices, utilizando los pinceles adecuados, en tubos de 1,5 mL que contienen 250 μl de tampón de lisis, manteniendo los tubos en hielo (figura 2 L). Para hacer la lisis de tampón, mezclar PBS 1 x con cócteles inhibidores de fosfatasas y proteasas tanto diluido al 1: 100 y homogeneizar el tejido con diferentes morteros para prevenir la contaminación entre las muestras. Completar estas acciones dentro de 10-15 minutos.
- Centrifugue el cerebro lisado a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a tubos nuevos y mantener las muestras a-80 ° C.
5. lectura de la concentración de proteínas y el análisis de Western Blot
- Determinar la concentración de proteína de cada muestra y posteriormente preparar las alícuotas para el análisis de Western blot como se describió anteriormente22.
- Realizar el análisis estadístico para evaluar los efectos del tratamiento sobre la expresión de la proteína.
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Representative Results
El protocolo presentado aquí indica que la administración de un péptido tóxico, T30, modula de una manera dependiente del sitio de la expresión de α7-nAChR, p-Tau y Aß en secciones que contienen BF (Figura 3A). El receptor nicotínico muestra un aumento significativo en la hemislice rostral tratados en comparación con su contraparte de control (segmento 1, p = 0.0310) (figura 3B), mientras que el segmento intermedio no revela ningún cambio entre las dos condiciones ( segmento 2, p = 0.1195) (figura 3B). En la sección posterior está presente en la porción expuesta de T30 una reducción significativa en su lado de control (segmento 3, p = 0.0476) (figura 3B). Previa solicitud del T30, niveles de p-Tau se aumentan significativamente en la región anterior contra el mando de juego lateral (segmento 1, p = 0.0158) (figura 3). Por otra parte, las otras dos que contienen BF secciones no demostró diferencias significativas entre las condiciones (segmento 2, p = 0.1014; cortar 3, p = 0.6405) (figura 3). Después de la exposición de T30, Aβ es mejorado significativamente en la hemisections rostral e intermedio en comparación con sus porciones contralaterales no tratados (segmento 1, p = 0,0136; cortar 2, p = 0.0109) (figura 3D). En el segmento caudal, no hay ningún cambio entre los dos tratamientos (segmento 3, p = 0.1231) (figura 3D). El anticuerpo primario contra P-tau reconoce el epitopo que contiene el residuo Ser202 fosforilado. El anticuerpo primario contra Aβ detecta varias isoformas, que van desde Aβ37 a Aβ42. Los datos se analizaron como anteriormente descrito22 con dos colas apareadas t-pruebas y representado como SEM. N = (hemislices por grupo, ratas) es (27, 9).
Figura 1: secuencia y el calendario indicativo de los principales pasos realizados durante el procedimiento experimental. El intervalo de tiempo para completar el primer y tercer paso puede variar en relación con el nivel de experiencia del operador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: pasos secuenciales que ilustran la progresión protocolo. (A–D) Extracción del cerebro del cráneo y de la separación del cerebelo del resto del cerebro. (E) fijación del cerebro en el disco de vibratome y transferencia en la sala de disección, que es rodeada por el hielo y lleno de frío aCSF constantemente oxigenada durante el corte. (F) Coronal cerebro seccionado. (G) colección de las rebanadas, con rostral (R), intermedio () y caudal (C) estructuras del prosencéfalo basal. (H) separación de las secciones en dos hemislices que empareja. () Cada Hemisección se coloca en su frasco correspondiente. Frascos (J) coloca en el soporte, dentro de la caja del aparato y cerraron por separado. (K) incubación período sobre la conexión del sistema a la fuente de oxígeno (círculo negro). (L) homogeneización de las muestras después del tratamiento. Esta cifra se modifica del22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: T30 mediada por la expresión específica de α7-nAChR, p-Tau y Aß eje rostro caudal BF. (A) representación de rebanadas coronales de cerebro como núcleos del prosencéfalo basal (líneas punteadas blancas), dividido en dos partes complementarias y expuestos a diferentes condiciones. (B) exposición después de T30, el receptor nicotínico muestra un aumento significativo en la subdivisión anterior (T30 1) y una reducción marcada en la parte posterior (T30 3) comparado con los correspondientes lados de control (ctrl 1 y ctrl 3). El segmento intermedio no muestra ningún cambio entre las dos condiciones (ctrl 2, 2 T30). Expresión de p-Tau (C) es significativamente mayor en la porción rostral tratada (T30 1) sobre su homólogo correspondiente control (ctrl 1), mientras que las otras dos rebanadas no revelan ninguna diferencia en los dos grupos (sector 2 y sector 3). Aβ (D) muestra un aumento significativo en las anteriores e intermedias tratadas subdivisiones (T30 1 y 2 de T30) en comparación con sus correspondientes lados sin tratar (ctrl 1 y ctrl 2). En las secciones de caudales, no hay ninguna variación entre los dos grupos. Las barras de error indican SEM. * p < 0.05.n = (hemislices por grupo, ratas) es (27, 9). Barra de escala es de 1 mm. Esta figura ha sido modificada desde22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El aspecto principal de este protocolo, basado en la técnica de cerebro bien establecida ex vivo , permite probar sincrónicamente dos hemislices especulares, obtenidos en el mismo plano anatómico, monitoreo de la respuesta después de la aplicación de un específico condición de control o tratamiento; por lo tanto ofrece un paradigma experimental controlado tan ajustadamente como sea posible. La posibilidad de evaluar en un tiempo, dosis y forma específica diferentes neuroquímicos relacionados con el deterioro neuronal, como se ve en neurodegenerativas eventos22, representa una característica esencial. Esta metodología enlaza las ventajas de un ambiente fisiológico en vivo con los de en vitro preparaciones, tales como exactitud en la obtención de la región de interés y crear el contexto ideal del extracelular. Este protocolo representa una adaptación del cerebro común cortar procedimiento ampliamente utilizado para ex vivo las grabaciones electrofisiológicas25,26,27 y proyección de imagen óptica28, 29,30, o en vitro organotypic rebanadas, que simulan una situación de en vivo más cerca por lo que permite la preservación de ambos organización estructural y synaptic23,24 ,31,32.
Además, este procedimiento podría ayudar a disminuir el número de animales utilizado en estudios de comportamiento, ya que reproduce parcialmente un en vivo-como condición, que puede ser adoptada para confirmar datos en vitro , como cultivo de células y el análisis de immunohistochemical y luego experimentos en vivo .
La metodología propuesta presenta también algunas limitaciones, tales como el espesor de la sección y la integridad que, cuando no es adecuado, puede alterar el resultado final. El tiempo de incubación también es un componente fundamental de esta técnica, ya que podría influir en la comparación entre el grupo control y el tratamiento. Además, una serie de problemas técnicos o de procedimientos se encuentran en todos los pasos del Protocolo, tales como: (1) daño mecánico durante la extracción o secciones del cerebro, que puede ser evitado por la manipulación precisa y suave del tejido; (2) flotante de la hemislices durante la incubación debido a un flujo excesivo de oxígeno, que puede dañar mecánicamente el tejido si te toca la aguja oxigenante sumergida en la aCSF, afectando su integridad. Esto puede prevenirse mediante el ajuste a la tasa mínima del hervor; y (3) ausencia o flujo inconstante de oxígeno, que pueden estar relacionados con el depósito vacío, un daño o desconexión en el sistema de tubería, un enchufe en la oxigenación de la aguja, o cuando bien no se encuentra inmerso en la aCSF. Puesto que la oxigenación constante y su caudal durante todo el procedimiento representa uno de los aspectos más críticos de este protocolo, es importante vigilar con frecuencia todos estos parámetros para mantener una condición homogénea entre los grupos investigados.
Otros pasos críticos en el protocolo están representados por las ventanas de tiempo necesarias para realizar cada acción, que cuando siguió la voluntad de preservar la medida de lo posible la integridad y funcionalidad del tejido. Además, para evaluar estos parámetros, puede realizarse el análisis de immunohistochemical para detectar marcadores específicos relacionados con la viabilidad neuronal y las grabaciones electrofisiológicas como anteriormente descrito23,29.
Más allá de los resultados aquí descritos, este método podría ser diseñado ad hoc para investigaciones específicas. Por ejemplo, se puede aplicar a: (1) monitor y comparar la actividad de diferentes compuestos en varios cerebro áreas, incubando con la solución escogida, como aCSF o Neurobasal medio; (2) realizar estudios sobre hipoxia, ya que el flujo de oxígeno puede ser controlado selectivamente en cada Hemisección; (3) investigar propiedades del tejido de cerebro de modelos animales transgénicos de enfermedades diferentes; (4) al mismo tiempo explorar, en el mismo nivel anatómico, los efectos de inyecciones de cerebro unilateral en vivo y comparar con el hemisferio de control; y (5) explorar otras propiedades de órganos o tejidos, por lo tanto potencialmente facilitando y reduciendo la duración de los ensayos de detección de drogas.
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Disclosures
Los autores declaran a que compiten intereses financieros. Susan A. Greenfield es el fundador y Presidente de Neuro-Bio Limited, una compañía privado poseída y posee acciones de la compañía. Emanuele Brai y Antonella Cogoni son empleados de Neuro-Bio Ltd.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por Neuro-Bio Ltd. Nos gustaría agradecer al Dr. Giovanni Ferrati y Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) por sus comentarios y consejos sobre el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
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