Summary
Biz daha fazla ateş altında yatan erken etkinlik kazandırabileceğini kurulan eski-vivo beyin tekniğine dayalı bir yöntemini in vivo ve in vitro deneyler avantajlarını birleştiren mevcut. Ayrıca, tedavi ve tedavi edilmezse grubun aynı anatomik düzlemde doğrudan karşılaştırma için eşsiz bir fırsat temsil eder.
Abstract
Hangi birincil yansıtan temel ateş işler güvenilir hayvan modelleri geliştirmek için çalışan çok sayıda çalışma rağmen çok az yaygın olarak kabul etmiştir. Burada, biz daha yakın vivo içindesunan iyi bilinen ex vivo beyin dilim tekniği, uyarlanmış yeni bir yordam teklif- vitro hücre dejenerasyonu, uyarının harekete geçirilmesine karşılık olarak erken olayları araştıran için hazırlıklar, daha senaryo gibi Alzheimer hastalığı içinde (Ah) görülmektedir. Bu varyasyon seçili beyin bölgesi ve yerel işlevselliğini fizyolojik ortamında bir anatomik cytoarchitecture korunması etkinleştirme basit ve kolayca tekrarlanabilir adımlar oluşur. Farklı anatomik alanlarda birden fazla deneyler söz konusu tedavileri ile bir site-, doz- ve saat-bağımlı bir şekilde gerçekleştirmek için fırsat sağlayan aynı beyin elde edilebilir. Bu metodoloji ile ilgili sonuçları etkileyebilecek potansiyel sınırlamalar doku, Yani, anatomik bütünlüğünü sırasında dilimleme ve kuluçka adımları ve bölüm kalınlık bakımından korunması için ile ilgili hangi biyokimyasal ve immunohistokimyasal analiz etkileyebilir. Bu yaklaşım moleküler mekanizmaları fizyolojik ve patolojik koşulları, uyuşturucu tarama veya doz-yanıt deneyleri dahil keşfetmek gibi farklı amaçlar için istihdam edilebilir. Son olarak, bu iletişim kuralını da hayvan davranış çalışmalarda istihdam sayısını azaltabilir. Rapor burada uygulama son zamanlarda açıklanan ve ex vivo sıçan beyin dilimler içeren bir reklam öncelikle etkilenen beyin bölgelerinden biri olan Bazal ön (BF), tarihinde ilk kez test. Asetilkolinesteraz (AChE) C-terminus elde edilen zehirli bir peptid yönetim tetikleme, BF, antero-posterior ekseni boyunca farklı bir ifade bir reklam gibi profil sor kanıtlanmıştır özellikle, Reklamda, alpha7 nikotinik reseptör (α7-nAChR), gibi değişmiş proteinlerin Tau (p-Tau) ve amiloid beta (Aβ) fosforile.
Introduction
Kronik bir patoloji entorhinal korteks (EC), BF, Hipokampus (HC) ve olfaktör ampul gibi farklı beyin bölgeleri etkileyen kademeli nörodejeneratif bozukluğu (OB)1,2,3ile karakterize reklamdır, 4,5. Reklam gelişimin geç yaklaşık % 70'ini tüm durumlarda6muhasebe demans en sık görülen bu hastalık yapma ilerici bir bilişsel gerileme yol. Reklam neden ilk etap anlamak için yoğun girişimlerine rağmen bir şey yok şu anda tanımlanmış bir deneysel gösterge onları elucidating. Reklam pathobiology, ne de etkili7,8 kanıtlamıştır bir ilaç hedef açıklayan tam bir profil sağlamaz beri Ayrıca, en popüler teori - "amiloid hipotezi" - giderek sorgulanmaktadır ,9.
Ateş sırasında meydana gelen ilk mekanizmaları nöronal küme reklam3,10,11 ' öncelikle duyarlı ilişkili artan ilgi alma alternatif bir teori önerir , 12 , 13 , 14. bu türdeş olmayan hücresel Merkez AK, HC ve OB15,16gibi birden çok bölgeye BF, orta ve beyin sapı, projeler içinde kapsıyordu. Nöronal morfoloji ve nörotransmitter sentez çeşitliliği rağmen bu çekirdek hücrelerin enzimatik olmayan işlev17,18de içerebilir ağrısı ifade içinde ortak bir özelliği paylaşır. Molekül trofik veya toksik olayları ile ilgili olarak Ca2 + doz, kullanılabilirlik ve nöronal yaş17,18 geçirmek için nöronlar kalsiyum (Ca2 +) akışına aracılık sinyal bir roman olarak klasik olmayan bu rolü , 19.
Ateş sırasında gözlenen hücresel kaybı bu nedenle ağrısı C-terminus i ciddi bir 30mer peptid (T30) atfedilebilecek olduğu bu enzimatik olmayan işlev17,18,20' ye, ilişkili olabilir 20. hücre kültürü ve optik görüntüleme18,21 hazırlıklar, önceki sonuçları doğrultusunda biz, ex vivo sıçan beyin dilimleri T30 indüklenen BF yapıları içeren dayalı yeni bir yaklaşım ile gösterdi bir reklam gibi profil22. Özellikle, birçok anatomik devre koruma için bir zaman penceresi saat de olsa için arasında değişen bir sağlam doku özelliklerini korur beri bu yeni yöntem daha fizyolojik bir senaryo hücre kültürü daha sunuyor. Biz ateş, erken aşamalarında yer alan olayları keşfetmek için bu iletişim kurallarını T30 başvurusu üzerine akut yanıt izleme uygulanır.
Beyin kullanma edebiyatının büyük beden rağmen moleküler yolları araştırmak için dilimler nöronal hasar örtük veya neurogenesis23,24, bu protokolü ilk kez daha acil sağlar ve okumak duyarlı karşılaştırıldığında organotypic dilimleri yaygın kullanımı için. Beyin bölümleri organotypic için olduğu gibi Ancak, bu akut dilim yordamı da değerlendirilmesi nöroprotektif veya Nörotoksik molekülleri, belirli bir süreç içinde birincil moleküler değişimleri keşfi gibi çeşitli amaçlar için kabul edilebilir, immunohistokimyasal analizleri ve merkezi sinir sistemi için farmakolojik deneyleri patolojiler ilgili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları onaylı protokolleri altında gerçekleştirilmiş.
Not: Bu bölümde ana aşamadan dizisi deneysel işlem sırasında gerçekleştirilen ve önerilen zaman aralığı (şekil 1) sağlanır. Ayrıca, protokol, adım adım açıklamasını kritik eylemler doku homojenizasyon kuluçka dönemi (Şekil 2) sonra beyin kaldırılması arasında gösterilen açıklayıcı bir panel tarafından desteklenmiştir. Yukarıda açıklanan22ile ilgili malzeme ve cihazları ve sonraki aşama WB analiz için oluşturmak için yönergeleri ayrıntılardır.
1. cerrahi aletler, Vibratome ayarları ve tedavi hazırlık
Not: deneysel bir işlem başlatmadan önce aşağıdaki adımları yürütün:
- İki farklı yapay serebrospinal sıvı (aCSFs), bir beyin Dilimleme için kullanılan hazırlamak ve diğer kuluçka adım için daha önce29açıklandığı gibi. Kısaca, "Dilimleme" aCSF için iki aCSFs (içinde mmol) çalışma konsantrasyonları şunlardır: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4ve 10 glikoz; 6,7 HEPES tuz ve 3.3 HEPES asit; pH: 7.1. "Kayıt" aCSF süre: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH2PO4ve 10 glikoz; pH: 7.1.
- Mix iyi çözümleri ve buza koy ve dilimleme aCSF için bu soğuk beyin ve sonraki kesit kaldırma sırasında oksijen. Oda sıcaklığında (RT) ve tedarik oksijen kayıt aCSF tutun.
- Diseksiyon başlık altında aletleri işten çıkarma ve beyin kaldırma, Yani, giyotin, cerrahi disseksiyon seti (makas, pens, bıçaklar) ve spatula için yerleştirin.
- Vibratome parametreleri dilim kalınlığı (Bu hazırlık 300 µm) ve 7 frekans ve 6 hızda seçerek ayarlayın. Vibratome odası uygun, boşluk ve buz ile surround.
- "Dilimleme" (aCSF) beyin kesit sırasında oksijen carbogen (% 95'i O2, % 5 CO2) Vanayı aç. 2 mL/dk civarında en düşük akış hızı seçin.
- Test etmek için koşulları hazırlamak için iki 15 mL tüp al. Ekle bir tüp 10 mL "kayıt" aCSF yalnız (kontrol grubu) ve diğer, "kayıt" aCSF 10 mL 2 µM (tedavi grubu) bir konsantrasyon T30 ile zenginleştirilmiş. Girdap hem tüpler ve kullanımları kurulum hazırlama aşaması (Bölüm 3) kadar buz üzerinde tutun.
2. anestezi, beyin çıkarma ve dilimleme
Not: Bu çalışmada, 9 vahşi türü P14 erkek Wistar rats kullanılmıştır. Onlar hızlı bir şekilde (10 dk içinde) önlemek veya en az doku dejenerasyonu süreçleri yavaşlatmak için gerçekleştirilmesi gereken bu yana beyin ayıklama ve sonraki Dilimleme protokolün kritik bir parçası oluşturur.
- % 100 w/w isoflurane 1,5 mL bir pamuk katmanda indüksiyon odasına ekleyin, hayvan içine yerleştirin ve kapağını kapatın. Hayvan derinden pedal refleks, yokluğunda teyit anestezi kadar bekleyin ve Giyotin kullanarak hayvan başını kesmek.
- Buz gibi baş hayvan içeren bir kap içinde aCSF beyin kaldırma adımı sırasında Dilimleme tutmak (şekil 2A -C).
- Cilt üzerinde kafatası, cerrahi bıçak deşmek sonra kafatasının orta hat posterior bölümünden takip makas kullanarak kesmek ve anteriorly kemik OBs (şekil 2A) yukarıda erişene dek devam edin.
- Beyin (şekil 2B) erişim sağlamak için bir çift forseps kullanarak kafatası yan yana iki tarafına çek. Bir spatula ventrally beyin için eklemek, yavaşça dışarı ve buz gibi "Dilimleme" aCSF için yaklaşık 5 dk (şekil 2C) içinde nemli tutmak Kepçe.
- Beyin filtre kağıdı üzerine atın ve bir bıçak (şekil 2B) kullanarak beyincik kesti. Dikey olarak vibratome disk beyin tutkal ve parça odası ekleyin, buz gibi "Dilimleme" aCSF ile doldurun ve oksijen (şekil 2E) sağlar.
- Kesme aralığını ayarlamak ve beyin (şekil 2F) kesit ile devam edin. Medial septum (MS), Broca (DBB) ve gözlemliyorum innominata (SI), çapraz grup gibi ilgi bölge içeren bölümler yukarıda açıklanan22toplamak. Yukarıdan-aşağıya üç dilim rostral (R), orta (I) ve (Şekil 2 g) BF Kaudal (C) bölümünü içerir.
- Orta çizgi her bölüm küçük makasla bölmek tek tek kontrol ve tedavi durum aynı anatomik uçağı olarak kullanılan iki aynasal hemislices (Resim 2 H), alma.
- Hemisections 5-10 dakika vibratome odasında tutmak, o zaman onlara bir cam pipet ile kayıt aCSF içeren bir kabarcıklanma pota transfer. Yeniden elde etmek için yaklaşık 30 dakika RT devam et.
- Bu arada, üç cam şişeleri ile kayıt aCSF yalnız 3 (Adım 1.6 kontrol grubu için önceden hazırlanmış) mL ve T30 (1.6 adımda önceden hazırlanmış) ile tedavi grubu için zenginleştirilmiş aCSF 3 mL ile üç şişeleri doldurun.
3. Kurulum hazırlama
- Hemisections kontrol grubu (yeşil çerçeve, şekil 2J) (rostral, ara ve Kaudal BF bölge dahil) üç ardışık hemislices için karşılık gelen cam şişe (şekil 2I) aktarmak ve onların tedavi grubu (kırmızı çerçeve, şekil 2J) için meslektaşları eşleştirme.
- Koşullar arasında herhangi bir kontaminasyonu önlemek için iki farklı fırçalar, bir denetim hemislices ve başka için tedavi meslektaşları ile beyin dokusu aktarın.
- Her cam şişe oxygenating iğne (21 G) (şekil 2J) sunma karşılık gelen kapak ile kapatın. Cihazları ana tüp carbogen kaynak (Şekil 2 K) bağlayın. Deneme sırasında beyin dokusu ve mekanik zarar herhangi bir hareketi önlemek için hemislices 2 mL/dak bir minimum akış hızı ile kuluçka süresi boyunca için oksijen sağlamak. 5 h kuluçka başlatın. 5 dakika içinde 3.1-3.3 adımları yürütün.
Not: Onay sık (her 15-20 dk) oksijen tüpleri sağlanan ve akışını aşağıdan doku kıpırdamıyor.
4. örnek homojenizasyon
- Kuluçka sonra oksijen akışını durdurmak ve tüpleri tüm kapakları kaldırın. 250 µL üzerine buz (Şekil 2 L) boruları Bakımı lizis tamponunun içeren 1,5 mL tüpler içine uygun fırçalar kullanarak hemislices aktarın. Arabellek, PBS 1 mix lizis yapmak x fosfataz ve proteaz inhibitörleri kokteyller ile hem 1: 100 seyreltilmiş ve doku örnekleri arasında önlemek amacıyla farklı dibekler ile homojenize. 10-15 dk içinde bu eylemleri tamamlayın.
- 1000 x g 4 ° C'de 5 min için de lysate beyin santrifüj kapasitesi Süpernatant yeni tüpler içine aktarmak ve örnekleri-80 ° C'de tutmak
5. okuma Protein konsantrasyonu ve Western Blot analizi
- Her örnek protein konsantrasyonu belirlemek ve daha sonra yukarıda açıklanan22olarak Western blot analizi için aliquots hazırlamak.
- Protein ifadesi üzerinde tedavinin etkilerini değerlendirmek için istatistiksel çözümleme gerçekleştirme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan Protokolü toksik bir peptid, T30, yönetim α7-nAChR, p ifadesi bir site bağlı şekilde modüle gösterir-Tau ve Aβ BF içeren bölümler (şekil 3A) içinde. Nikotinik reseptör denetim muadili karşılaştırıldığında rostral tedavi hemislice önemli bir artış gösterir (dilim 1, p = 0.0310) (ara dilim arasında iki koşul (herhangi bir değişiklik ortaya koymuyor ikenşekil 3B), dilim 2, p 0.1195 =) (şekil 3B). Arka bölümünde belirgin bir şekilde azaltılmasına, Denetim yan tarafa T30 Günese maruz kalan bölümünde mevcuttur (dilimi 3, p 0.0476 =) (şekil 3B). T30 başvuru üzerine, p-Tau düzeyleri önemli ölçüde karşı tarafı eşleşen denetim ön bölgede artırılır (dilim 1, p 0.0158 =) (şekil 3 c). Öte yandan, diğer iki BF-içeren bölümler koşulları arasında anlamlı bir fark gösterme (dilim 2, p 0.1014 =; 3, dilim p 0.6405 =) (şekil 3 c). T30 maruz kaldıktan sonra Aβ önemli ölçüde onların tedavi edilmezse kontralateral bölümleri için karşılaştırıldığında rostral ve ara hemisections içinde Gelişmiş (dilim 1, p 0.0136 =; 2, dilim p 0.0109 =) (şekil 3D). Kaudal dilimi iki tedaviler arasında hiçbir değişiklik yok (dilimi 3, p 0.1231 =) (şekil 3D). P-Tau karşı birincil antikor fosforile Ser202 kalıntı içeren epitope tanır. Aβ karşı birincil antikor Aβ37 Aβ42 için arasında değişen çeşitli izoformlarının algılar. Yukarıda açıklanan22 iki kullanarak eşleştirilmiş tkuyruklu olarak veri analiz-sınar ve SEM N temsil = (hemislices, grup başına fareler) olduğunu (27, 9).
Şekil 1: sırası ve ana adımları göstergesi zamanlaması gerçekleştirilen deneysel işlem sırasında. Birinci ve üçüncü adımı tamamlamak için zaman aralığı operatörün deneyim düzeyi ile ilgili olarak değişebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: iletişim kuralı ilerleme gösteren sıralı adımları. (A-D) Kafatası ve beyincik ayrılması beyin geri kalan beynin çıkarma. (E) eki beyin vibratome disk ve transfer içine buz tarafından çevrili ve soğuk aCSF Dilimleme sırasında sürekli oksijenli dolu diseksiyon odası. (F) Koronal beyin kesit. Rostral (R), orta (Ben) ve Bazal ön Kaudal (C) yapıları içeren dilimleri, (G) koleksiyonu. (H) iki eşleşen hemislices bölümlerde ayrılması. (Ben) her hemisection onun karşılık gelen şişe yerleştirilir. (J) tüpleri aparatı kutusunun içinde destek yerleştirilmiş ve ayrı ayrı kapalı. (K) kuluçka sistemi (Siyah Daire) oksijen kaynağına bağlantı kurulduğunda dönem. Tedavi sonrası (L) homojenizasyon örnekleri. Bu rakam22değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: T30 aracılı siteye özgü ifade α7-nAChR, p-Tau ve BF rostro Kaudal eksen boyunca Aβ. Beyin koronal dilimleri iki tamamlayıcı porsiyonlar halinde bölünmüş ve farklı koşullara maruz Bazal ön çekirdeği (beyaz noktalı çizgiler), dahil olmak üzere(a)gösterimi. (B) sonra T30 pozlandırmayı, nikotinik reseptör ön alt bölümü (T30 1) ve bir (T30 3) karşılık gelen denetim taraf (ctrl 1 ve ctrl 3) karşılaştırıldığında arka belirgin bir azalma önemli bir artış gösterir. Ara dilim (ctrl 2, T30 2) iki koşul arasında herhangi bir değişiklik görüntülemez. Diğer iki dilim iki grubu (dilim 2 ve 3 dilim) herhangi bir farklılık ortaya çıkarmak değil ise (C) p-Tau ifade denetim eşleşen muadili (ctrl 1), tedavi rostral bölümünde (T30 1) önemli ölçüde daha yüksektir. (D) Aβ önemli bir artış karşılık gelen tedavi edilmezse yan yana için (ctrl 1 ve ctrl 2) göre ön ve orta düzey tedavi alt bölümleri (T30 1 ve T30 2) görüntüler. Kaudal bölümlerde, iki grup arasında hiçbir varyasyon vardır. SEM hata Çubuklarõn * p < 0.05.n = (hemislices, grup başına fareler) olduğunu (27, 9). Ölçek çubuğu 1 mm'dir. Bu rakam22değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı, köklü ex vivo beyin tekniğine dayalı asıl yönünü zaman uyumlu olarak belirli bir uygulama sonra onların yanıt izleme aynı anatomik uçak elde edilen iki aynasal hemislices test etmek için izin verir Koşul (kontrol veya tedavi); Bu nedenle deneysel bir paradigma olarak sıkı mümkün olduğunca kontrol sunuyor. Bir saat, doz ve nöronal bozukluğu için ilgili siteye özgü şekilde farklı fizyolojinin nörodejeneratif olaylar22sırasında görüldüğü gibi değerlendirilmesi olasılığı önemli bir özelliği temsil eder. Bu yöntem bir vivo içinde fizyolojik ortam avantajları bu doğruluk bölgesi faiz elde etmek ve ideal hücre dışı içerik oluşturma gibi vitro hazırlıkları ile bağlar. Bu iletişim kuralını temsil eden bir uyum ex vivo Elektrofizyolojik kayıtlar25,26,27 ve optik görüntüleme28, için yaygın olarak kullanılan bir yordam Dilimleme ortak beyin 29,30, ya da her iki yapısal ve sinaptik organizasyon23,24 korunması sağlayarak daha yakın bir vivo içinde durum simülasyonu vitro organotypic dilimleri ,31,32.
Ayrıca, bu yordamı kısmen bir vivo içindeçoğaltır bu yana davranış çalışmalarda kullanılan hayvan sayısını azaltmak için yardımcı olabilir- vitro veri, hücre kültürü gibi onaylamak için kabul durum gibi ve immunohistokimyasal analizi ve in vivo deneyler tahmin.
Önerilen metodoloji bölüm kalınlığı ve değil uygun olduğunda, nihai sonucu değiştirebilirsiniz hangi bütünlüğü gibi bazı sınırlamalar da sunar. Kontrol grubu ve tedavi olan arasında karşılaştırma etkisi bu yana kuluçka süresi de bu teknik temel bileşenidir. Buna ek olarak, yordam veya teknik sorunları bir dizi iletişim kuralı, tüm adımları uyguladığınızda aşağıdaki gibi karşılaşılan olabilir: ayıklama veya hassas ve yumuşak doku; işleyerek önlenebilir beyin kesit (1) mekanik hasar (2) nedeniyle oxygenating iğne dokunursa mekanik olarak doku zarar verebilir bir aşırı oksijen akışı, kuluçka sırasında hemislices yüzen böylece bütünlüğünü etkileyen aCSF içinde sular altında. Bu-ebilmek var olmak önlemek için minimum oranı köpüren ayarlayarak; ve (3) devamsızlık veya kararsız oksijen akışı, hangi boş teneke kutu, hasar veya bağlantı kesme için tüp sistemi, oxygenating iğne bir fiş içinde ilgili olabilir ya da ne zaman bu düzgün aCSF içinde batırılır değil. Bu iletişim kuralı en önemli yönlerinden biri sürekli oksijenlenme ve prosedür boyunca akışını temsil ettiği sık incelenen gruplar arasında homojen bir durumu korumak için tüm bu parametreleri izlemek önemlidir.
İletişim kuralı diğer kritik adımları temsil edilir her eylemi gerçekleştirmek için gereken zaman windows tarafından hangi ne zaman takip edecek mümkün bütünlüğü ve doku işlevselliğini kadar korumak. Buna ek olarak, bu parametreler değerlendirmek için immunohistokimyasal analiz belirli işaretleri nöronal canlılığı ve Elektrofizyolojik kayıtlar ile ilgili yukarıda açıklanan23,29algılamak için gerçekleştirilebilir.
Burada açıklanan sonuçlar, bu yöntem tasarlanmış özel özel araştırmalar için olabilir. Örneğin, için uygulanabilir: (1) monitör ve karşılaştırın birkaç farklı bileşiklerin etkinliği beyin alanları, onları aCSF veya Neurobasal orta; gibi seçili çözümü ile kuluçka (2) oksijen akışını seçerek her hemisection kontrol edilebilir olduğundan hipoksi üzerinde çalışmalar gerçekleştirmek; (3) beyin doku özellikleri farklı hastalıkların transgenik hayvan modellerinden araştırmak; (4) aynı anda, aynı anatomik düzeyinde vivo içinde tek taraflı beyin enjeksiyonları etkilerini araştırmak ve onları kontrol Yarımküre ile karşılaştırın; ve (5) diğer organ veya doku özellikleri, bu nedenle potansiyel olarak kolaylaştırmak ve denemeler eleme uyuşturucu uzunluğunu azaltmak keşfetmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip mali çıkarlarının bildirin. Susan A. Greenfield nöro-Bio Limited, özel sektöre ait bir şirket ve şirket tutar hisseleri kurucusu ve başkanıdır. Emanuele Brai ve Antonella Cogoni nöro-Bio Ltd. çalışanları olan
Acknowledgments
Bu eser nöro-Bio Ltd. tarafından finanse edildi Dr. Giovanni Ferrati ve doktor Sergio Rotondo (nöro-BIO) teşekkür etmek onların yorum ve tavsiyeler el yazması için istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
References
- Braak, H., Braak, E.
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer's Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical? Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show? Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
