Summary
אנו מציגים שיטה אשר יכול לספק עוד תובנות האירועים בתחילת שבבסיס הקשורים ניוון מוחיים, המבוססת על הטכניקה המוח הוקמה לשעבר-vivo , המשלב את היתרונות של ניסויים ב- vivo ו- in vitro לקשרי . יתר על כן, הוא מייצג הזדמנות ייחודית השוואה ישירה של קבוצת טיפול ללא טיפול באותו מישור אנטומיים.
Abstract
למרות מחקרים רבים המנסים לפתח מודלים אמינים בעלי חיים אשר המשקף העיקרית תהליכים הקשורים ניוון מוחיים הבסיסית, מעטים התקבלו באופן נרחב. כאן, אנו מציעים הליך חדש מקורי ידועים שמחוץ המוח פרוסה הטכניקה, אשר מציעה יישום קרוב ויוו-כמו לתרחיש יותר במבחנה הכנות, על חקירת האירועים בתחילת מפעילה ניוון תאים, כמו נצפתה מחלת אלצהיימר (AD). וריאציה זו כוללת צעדים לשחזור בקלות ופשוט, המאפשר שימור cytoarchitecture האנטומי של האזור שנבחר המוח ופונקציונליות המקומית שלה וחשש פיזיולוגיים. ניתן להשיג במגוון תחומים אנטומיים המוח באותו, מתן האפשרות לבצע ניסויים מרובים עם הטיפולים המדובר האתר - מינון-, באופן תלוי-זמן. מגבלות פוטנציאליים, אשר עלול להשפיע על התוצאות הקשורות מתודולוגיה זו קשורים שימור הרקמה, קרי, שמירה על שלמותה אנטומי במהלך השלבים הדגירה וגזירה, העובי סעיף, אשר יכול להשפיע על הניתוח הביוכימי ו- immunohistochemical. גישה זו יכולה להיות מועסק למטרות שונות, כגון חקר המנגנונים המולקולריים המעורבים בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגית, והתרופות הקרנה או מבחני מנה-תגובה. לבסוף, פרוטוקול זה גם יכול להפחית את מספר בעלי חיים המועסקים במחקרים התנהגותיים. היישום דיווחו כאן שתוארו לאחרונה ובדק בפעם הראשונה ב- ex-vivo עכברוש המוח פרוסות המכילות הקדמי הבזליים (BF), אשר הוא אחד האזורים במוח מושפע בעיקר לספירה. באופן ספציפי, זה הוכח כי הממשל של פפטיד רעילים שמקורם את קצה קרבוקסילי של אצטילכולין אסטראז (AChE) יכול לבקש פרופיל כמו AD, מפעילה, לאורך ציר גישה antero-אחוריים BF, ביטוי דיפרנציאלי של חלבונים שינו לספירה, כגון הקולטן nicotinic alpha7 (α7-nAChR), phosphorylated טאו (p-טאו), עמילואיד ביתא (Aβ).
Introduction
המודעה היא שמחלה כרונית המאופיינת על ידי ליקוי ניווניות הדרגתית להשפיע על אזורים שונים במוח, כגון entorhinal קליפת (EC), BF, ההיפוקמפוס (HC) וכן הריח הנורה (אבוב)1,2,3, 4,5. כך שהאח של AD התפתחות להוביל ירידה קוגניטיבית מתקדמת, גורם מחלה זו הצורה הנפוצה ביותר של דמנציה, והיוו כ-70% של המקרים כל6. למרות ניסיונות נרחב להבין בשלבים הראשונים גורם לספירה, אין כרגע אינדיקציה ניסיוני מוגדר שחקרתי אותם. בנוסף, התיאוריה המקובלת ביותר - "עמילואיד ההשערה" - נחקרת יותר ויותר מאז הוא אינו מספק פרופיל מלא להסביר את pathobiology לספירה, ולא מטרה התרופות הוכיח יעילות7,8 ,9.
תיאוריה חלופית אשר מקבל תשומת לב גדלה והולכת מרמז כי המנגנון הראשוני המתרחשים במהלך הקשורים ניוון מוחיים הקשורים מקבץ עצביים רגישים בעיקר לספירה3,10,11 , 12 , 13 , 14. רכזת הסלולר הטרוגנית זו הקיפה במסגרת הפרויקטים BF, המוח האמצעי, גזע המוח, באזורים מרובים, כגון ה EC, HC ו- OB15,16. למרות המגוון שלה מורפולוגיה עצביים, סינתזה נוירוטרנסמיטר, הגרעין של תאים משתף תכונה נפוצה לבטא כאב, אשר יכול להיות גם של פונקציה אנזימטי17,18. התפקיד-קלאסי זה כמו רומן איתות מולקולה שמתווכת סידן (Ca2 +) מזרימה נוירונים אשר יכול לחוות אירועים עם מחלות או רעילים ביחס במינון2 + Ca, זמינות ו עצביים בגיל17,18 , 19.
במהלך הקשורים ניוון מוחיים, אובדן תאי שנצפה יכול להיות לכן קשור עם זה פונקציה שאינה אנזימטי17,18,20, אשר אינה משרתת פפטיד 30mer (T30) ביקע מ כאב קרבוקסילי 20. בקנה אחד עם תוצאות קודמות, נישא על תרבית תאים וההכנות אופטי הדמיה18,21 , הפגנו, באמצעות גישה חדשנית המבוססת על שמחוץ עכברוש המוח פרוסות המכילות מבנים BF, שהביאה T30 המודעה דמוי22. באופן ספציפי, מתודולוגיה חדשה זו מציעה תרחיש פיזיולוגית יותר מאשר תרבית תאים מאז זה משמר רבים מהמאפיינים של רקמות ללא פגע, ועד אנטומי שימור המעגלים, גם אם עבור חלון זמן של שעות. אנחנו מוחלים פרוטוקול זה לחקור את האירועים המתרחשים במהלך השלבים המוקדמים של הקשורים ניוון מוחיים, ניטור התגובה חריפה עם יישום T30.
למרות גוף גדול של הספרות על משתמש במוח פרוסות לחקור מסלולים מולקולריים נרמז נזקים עצביים או23,נוירוג'נסיס24, פרוטוקול זה מספק בפעם הראשונה מיידי יותר, רגיש הקריא בהשוואה לשימוש משותף של פרוסות organotypic. עם זאת, כפי שקורה organotypic מקטעים המוח, הליך חריפה פרוסה יכול גם להיות מאומץ למספר מטרות, כגון הערכת neuroprotective או מולקולות העצבים, גילוי ראשוני השינויים המולקולריים המתרחשים תהליך ספציפי, immunohistochemical ניתוח ולאחר מבחני תרופתי על מערכת העצבים המרכזית הקשורים פתולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו.
הערה: בחלק זה, רצף השלבים העיקריים שבוצעו במהלך ההליך ניסיוני, מרווח הזמן המוצע הינו מסופק (איור 1). יתר על כן, תיאור צעד אחר צעד של הפרוטוקול בתוספת לוח המחשה, מציג פעולות קריטיות ועד המוח להסרת רקמות המגון לאחר תקופת הדגירה (איור 2). הפרטים לגבי חומרים ו הוראות לבנות את המנגנון ואת השלב שלאחר מכן לניתוח WB הם שתואר לעיל22.
1. כלי ניתוח, Vibratome הגדרות והכנה לטיפול
הערה: בצע את השלבים הבאים לפני תחילת ההליך ניסיוני:
- להכין שני שונים מלאכותי מוחי שדרתי נוזלים (aCSFs), אחד משמש את המוח עם פרוסות ותיאר השני לשלב הדגירה כאמור29. בקצרה, ריכוז העבודה (ב mmol) aCSFs שני מיועדים כלנית חדד "חותך": 120 NaCl, 5 אשלגן כלורי, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 ח'2PO4ו- 10 גלוקוז; 6.7 HEPES מלח וחומצה HEPES 3.3; pH: 7.1. זמן כלנית חדד "רישום": 124 NaCl, 3.7 אשלגן כלורי, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 ח'2PO4ו גלוקוז 10; pH: 7.1.
- מערבבים היטב את הפתרונות ואז לשים קרח, חמצן של כלנית חדד עם פרוסות על מנת שיהיה קר בעת הסרת את המוח ואת חלוקתה עוקבות. לשמור בטמפרטורת החדר (RT), אספקת חמצן חנה המבר ההקלטה.
- מניחים את המכשירים מתחת למכסה המנוע לנתיחה עבור הסרת עריפת ראש ומוח, קרי, גיליוטינה, ערכת חיתוך כירורגי (מספריים, מלקחיים, להבים), מרית.
- הגדר את פרמטרי vibratome על-ידי בחירת פרוסה בעובי (300 מיקרומטר בהכנה זו) ואת התדירות-7 ואת המהירות ב-6. הוספת תא vibratome בחלל המתאים שלה, להקיף אותו עם קרח.
- . פתח את הברז carbogen (95% או2, 5% CO2) לחמצן את "חיתוך" (חנה המבר) במהלך חלוקתה המוח בחר את קצב זרימה מינימלית, סביב 2 mL/min.
- קח שני צינורות 15-mL כדי להכין את התנאים כדי לבדוק. הוסף בשפופרת אחת 10 מיליליטר "רישום" כלנית חדד לבד (קבוצת הביקורת) וב -האחר, 10 מ"ל של כלנית חדד"רישום"מועשר T30-ריכוז של 2 מיקרומטר (קבוצת מטופלים). מערבולת שני צינורות, לשמור אותם על קרח עד השימוש בהם במסגרת שלב הכנת ההתקנה (סעיף 3).
2. הרדמה, המוח החילוץ וחלוקת
הערה: במחקר זה, 9 פראי סוג P14 הגברית Wistar חולדות שימשו. המוח החילוץ וחלוקת הבאים מהווים חלק הכרחי של הפרוטוקול מאז הם במהירות לבצע (במרחק של 10 דקות) על מנת למנוע או לפחות להאט תהליכי ניוון רקמות.
- להוסיף 1.5 מ ל 100% w/w של איזופלוריין על שכבה כותנה אל החדר אינדוקציה, למקם את. החיה בפנים, סגור את המכסה. המתן עד החיה עמוק הוא מורדם, המאשרת רפלקס פדלים, העדר, אז לכרות את החיה באמצעות הגיליוטינה.
- . תמשיך הראש של החיה בתוך סיר המכילה קרח לחבר חנה המבר במהלך השלב הסרת המוח (איור 2 א -C).
- תחתכי את העור על פני הגולגולת עם להב כירורגי, ואז לחתוך את הגולגולת באמצעות מספריים בעקבות האמצע, מן החלק האחורי והמשך anteriorly עד שהגיע העצם מעל מכשול (איור 2 א).
- משוך רוחבית שני הצדדים של הגולגולת בעזרת זוג מלקחיים כדי לקבל גישה אל המוח (איור 2B). הכנס מרית ventrally אל המוח, סקופ בעדינות החוצה, ושומרים את שזה להתייבש תוך קר כקרח יצחק "חותך" גרגיר במשך כ 5 דקות (איור 2C).
- תשליך את המוח על נייר סינון, לחתוך את המוח הקטן באמצעות להב (איור דו-ממדי). הדבק את המוח בצורה אנכית על הדיסק vibratome להוסיפו בתוך החדר אופטים, למלא אותו קר כקרח "חותך" כלנית חדד ו לספק חמצן (2E איור).
- . להתאים את מרווח חיתוך ולהמשיך חלוקתה המוח (2F איור). לאסוף את הסעיפים המכיל אזור מעניינים, כמו מחצה המדיאלי (MS), פס אלכסוני של ברוקה (DBB) ולאחר הסובסטנציה innominata (SI), כפי שתואר לעיל22. מלמעלה למטה, שלוש פרוסות להכיל את rostral (R), בינוני (I), (ג) סימטרית, חלק BF (איור 2G).
- לחלק לאורך קו האמצע כל מקטע עם מספריים קטנות, קבלת שני סימונים hemislices (איור 2 H), משמש בנפרד הפיקוח ואת תנאי שטופלו על אותו מישור אנטומיים.
- לשמור את hemisections בבית הבליעה vibratome למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן להעביר אותם באמצעות פיפטה מזכוכית לתוך סיר מבעבע המכיל הקלטה כלנית חדד. שמור ב RT כ 30 דקות כדי להתאושש.
- למלא, בינתיים, שלוש מבחנות זכוכית עם 3 מ"ל של הקלטה חנה המבר לבד (בעבר להכין בשלב 1.6 עבור קבוצת הביקורת), שלוש מבחנות עם 3 מ של חנה המבר מועשר T30 (בעבר להכין בשלב 1.6) עבור קבוצת מטופלים.
3. הגדרת הכנה
- להעביר את hemisections לתוך צלוחיות זכוכית המתאימים שלהם (איור 2I) על מנת לקבל שלושה hemislices רצופים (כולל אזור BF rostral ביניים, סימטרית) עבור קבוצת הביקורת (מסגרת ירוקה, איור 2J) שלהם התאמת עמיתיהם עבור קבוצת מטופלים (מסגרת אדומה, איור 2J).
- העברה על רקמת המוח עם שתי מברשות שונות, אחת hemislices שליטה והשניה עבור עמיתיהם שטופלו, כדי למנוע כל זיהום בין תנאי.
- חותם כל בקבוקון זכוכית עם מכסה המתאים, מציגים את המחט oxygenating (21 גרם) (דמות 2J). לחבר את הצינור הראשי של המנגנון המקור carbogen (איור 2 K). לספק חמצן hemislices לאורך כל תקופת הדגירה עם קצב זרימה מינימלית של 2 מ לדקה על מנת למנוע כל תנועה של רקמת המוח, פגיעה מכנית אפשרית במהלך הניסוי. תתחיל הדגירה 5 שעות. בצע את השלבים 3.1-3.3 בתוך 5 דקות.
הערה: סימון לעתים קרובות (כל 15-20 דקות) אם החמצן המסופקת לתוך כל הבקבוקונים, כי הזרימה שלו לא זזה הרקמה מלמטה.
4. דוגמת המגון
- מפסיקים את זרימת החמצן לאחר הדגירה ולהסיר את כל המכסים הבקבוקונים. להעביר את hemislices, באמצעות מברשות נכונה, לתוך צינורות 1.5 mL המכיל 250 µL מאגר פירוק, שמירה על הצינורות על קרח (איור 2 L). כדי להפוך את פירוק מאגר, לערבב PBS 1 x עם קוקטיילים מעכבי פוספטאז, פרוטאז מדולל-מטריים, והן homogenize הרקמה עם בקווקז שונים למניעת זיהום בין הדגימות. להשלים את פעולות אלה תוך 10-15 דקות.
- Centrifuge המוח lysate-1000 g x עבור 5 דקות ב 4 º C. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינורות חדשים, שומרים את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.
5. קריאה של חלבונים ריכוז וניתוח תספיג חלבון
- לקבוע את ריכוז חלבון כל דגימה, לאחר מכן להכין את aliquots לניתוח תספיג כפי שתואר לעיל22.
- לבצע ניתוח סטטיסטי כדי להעריך את השפעת הטיפול על ביטוי חלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול המובאת כאן מציין כי הממשל של פפטיד רעילים, T30, שמחליש באופן תלוי-אתר הביטוי של α7-nAChR, p-טאו, ו Aβ במקטעים המכילים BF (איור 3 א). הקולטן nicotinic מציג עלייה משמעותית hemislice rostral שטופלו לעומת המקביל שליטה (פרוסה 1, p = 0.0310) (איור 3B), בעוד הפרוסה ביניים אינו חושף כל שינוי בין (שני תנאים פרוסה 2, p = 0.1195) (איור 3B). במקטע האחורי הפחתה משמעותית קיים בחלק החשופים T30 מעל פקד שלה (פרוסה 3, p = 0.0476) (איור 3B). בעת יישום T30, p-טאו רמות גדלו באופן משמעותי באזור הקדמי כנגד הפקד התאמת צד (פרוסה 1, p = 0.0158) (איור 3C). מצד שני, שני המכיל BF בסעיפים אחרים אינם מראים כל הבדל משמעותי בין התנאים (פרוסה 2, p = 0.1014; פורסים 3, p = 0.6405) (איור 3C). לאחר החשיפה T30, Aβ היא משופרת באופן משמעותי ב- hemisections rostral, ביניים בהשוואה לחלקים contralateral לא מטופל שלהם (פרוסה 1, p = 0.0136; פורסים 2, p = 0.0109) (דמות תלת-ממד). ב הפרוסה סימטרית, אין שינוי בין שני הטיפולים (פרוסה 3, p = 0.1231) (דמות תלת-ממד). נוגדן ראשוני נגד p-טאו מזהה את epitope המכילות השאריות Ser202 phosphorylated. נוגדן ראשוני נגד Aβ מזהה מספר איזופורמים, החל Aβ37 וכלה Aβ42. הנתונים נותחו כפי שתואר לעיל22 משתמשת בשני זנב לזווג t-בודק, מיוצג ב- SEM. N = (hemislices לכל קבוצה, חולדות) הוא (27, 9).
איור 1: רצף והעיתוי מעיד על השלבים העיקריים שבוצעו במהלך ההליך ניסיוני. מרווח הזמן כדי להשלים את השלב הראשון והשלישי יכול להשתנות ביחס רמת הניסיון של המפעיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שלבים רציפים הממחישות את התקדמות פרוטוקול. (A–D) מיצוי של המוח לגולגולת, ההפרדה של הצרבלום משאר חלקי המוח. קובץ מצורף של המוח על דיסק vibratome, העברה לחדר ניתוח, אשר מוקפים בקרח, מלא עם חנה המבר קר חמצן ללא הרף במהלך חותך (E). (F) המוח הילתית חלוקתה. אוסף (G) של הפרוסות, המכיל rostral (R), בינוני (אני), (ג) סימטרית, מבני הקדמי הבזליים. (H) הפרדת בסעיפים hemislices התאמת שני. (אני) כל hemisection ימוקם המבחנה המתאימים שלו. צלוחיות (J) ממוקם בתומך, בתוך הקופסה המנגנון וסגרו בנפרד. (K) דגירה תקופת על החיבור של המערכת למקור החמצן (עיגול שחור). המגון (L) הדגימות לאחר הטיפול. נתון זה משתנה בין ה-22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: T30 מתווכת ביטוי ספציפי לאתר של α7-nAChR, p-טאו, ו- Aβ לאורך הציר rostro-סימטרית BF. (א) ייצוג פרוסות הילתית המוח כולל הבסיס הקדמי גרעינים (קווים מנוקדים לבנים), מחולק לשני חלקים משלימים וחשוף למצבים שונים. (B) T30 לאחר החשיפה, הקולטן nicotinic מראה עלייה משמעותית חלוקה הקדמי (T30 1), צמצום מסומן האחורי (T30 3) ביחס לצדדים שליטה המתאים (ctrl 1 ו- ctrl 3). הפרוסה ביניים לא יציג כל שינוי בין שני התנאים (ctrl 2, T30 2). (ג) p-טאו הביטוי הוא גבוה באופן משמעותי בחלק rostral שטופלו (T30 1) על פני מקבילתה תואמות שליטה (ctrl 1), ואילו שתי הפרוסות אחרים אינם מגלים כל הבדל בין שתי הקבוצות (פרוסה 2 ו פרוסה 3). (ד) Aβ מציג עלייה משמעותית anterior ואת ביניים שטופלו חלוקות משנה (T30 1 ו- T30 2) לעומת צדם לא מטופל המתאים (ctrl 1 ו- ctrl 2). בסעיפים סימטרית, אין שום וריאציה בין שתי הקבוצות. קווי השגיאה מציינים ב- SEM * p < 0.05.n = (hemislices לכל קבוצה, חולדות) הוא (27, 9). סולם בר הוא 1 מ מ. איור זה השתנה מ22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההיבט העיקרי של פרוטוקול זה, המבוסס על טכניקת המוח ומבוססת ex-vivo , מאפשר לבחון באופן סינכרוני שני hemislices סימונים, המתקבל אותו מישור אנטומיים, ניטור התגובה שלהם לאחר היישום של ספציפי תנאי (לשלוט או לטפל); זה מציע לכן פרדיגמה נסיונית מבוקר חזק ככל האפשר. האפשרות של הערכת פעם, מינון-ו באופן ספציפי לאתר neurochemicals שונים הקשורים ליקוי עצביים, כפי שניתן לראות במהלך אירועים ניווניות22, מייצגת תכונה חיונית. מתודולוגיה זו מקשרת את היתרונות של סביבה ויוו פיזיולוגיים עם אלה של ההכנות במבחנה , כמו רמת הדיוק קבלת האזור עניין ויצירת הקשר חוץ-תאית אידיאלי. פרוטוקול זה מייצג עיבוד של המוח משותף עם פרוסות הליך בשימוש נרחב עבור ex-vivo 26,25,הקלטות אלקטרופיזיולוגיות27 ו דימות אופטי28, 29,30, או במבחנה organotypic פרוסות, שידמה מצב ויוו קרוב יותר בכך שהוא מאפשר השימור של שני הארגון סינפטית מבניים23,24 ,31,32.
יתר על כן, הליך זה יכול לעזור להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים במחקרים התנהגותיים, מאז זה מעתיק חלקית של ויוו-כמו מצב, שבו ניתן לאמץ לאשר נתונים במבחנה , כגון תרבית תאים ו ניתוח immunohistochemical, ואז לחזות ויוו ניסויים.
המתודולוגיה המוצעת מציגה גם מספר מגבלות, כגון סעיף עובי ו שלמות אשר, כאשר לא מתאים, יכול לשנות את התוצאה הסופית. זמן הדגירה הוא גם מרכיב מהותי של טכניקה זו מאז זה עשויים להשפיע על השוואה בין קבוצת הביקורת ואחד שטופלו. בנוסף, סדרה של בעיות פרוצדוראליות או טכניים שניתן נתקל במהלך כל השלבים של הפרוטוקול, כגון: פגיעה מכנית (1) בעת חילוץ או חלוקתה המוח, אשר יכול להימנע על ידי טיפול עדין ומדויק של הרקמה; (2) ריחוף של hemislices במהלך הדגירה עקב זרימת חמצן מופרז, העלול לפגוע באופן מכני את הרקמה ואם הוא נוגע המחט oxygenating שקועים כלנית חדד, ובכך משפיע על שלמותו. זה ניתן למנוע על-ידי התאמת כדי שיעור מינימלי של בעבוע; (3) היעדרות או זרימת חמצן הפכפכה, אשר יכול להיות קשור המיכל ריק, פגיעה או ניתוק במערכת צינורות, פקק במחט oxygenating, או כאשר לא כראוי טובלת בנוף כלנית חדד. מאז את חמצון קבוע וזרימה שלה לאורך כל ההליך מייצג את אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה, חשוב לפקח לעתים קרובות את כל הפרמטרים הללו כדי לשמור על מצב הומוגנית בין הקבוצות ובדוקים.
צעדים קריטיים אחרים בפרוטוקול מיוצגים על ידי החלונות זמן נדרש לבצע כל פעולה, אשר עקב רצון לשמור ככל האפשר השלמות והפונקציונליות של הרקמה. בנוסף, כדי להעריך את הפרמטרים הללו, ניתן לבצע ניתוח immunohistochemical כדי לזהות סמנים ספציפיים הקשורים הכדאיות עצביים והקלטות אלקטרופיזיולוגיות כפי שתואר לעיל23,29.
מעבר הממצאים המתוארים כאן, שיטה זו יכולה להיות מעוצב אד הוק לחקירות ספציפיים. לדוגמה, באפשרותך להחיל אותה על: המוח צג (1) והשווה הפעילות של תרכובות שונות בכמה אזורים, המקננת בהם עם הפתרון הנבחר, כגון כלנית חדד או בינוני Neurobasal; (2) לבצע מחקרים על היפוקסיה, מאז זרימת החמצן יכול להיות נשלט באופן סלקטיבי על כל hemisection; (3) לחקור את מאפייני רקמת המוח מ הטרנסגניים מודלים חייתיים של מחלות שונות; (4) בו זמנית לחקור, באותה רמה אנטומיים, את ההשפעות של ויוו מוח חד צדדית זריקות ולהשוות אותם עם הכדור שליטה; ו- (5) לחקור איברים או רקמות מאפיינים אחרים, ולכן פוטנציאל הקלת וקיצור האורך של סמים הקרנת ניסויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אינטרסים כלכליים מתחרים. סוזן א גרינפילד הוא מייסד נשיא מוגבלת נוירו-ביו, חברה בבעלות פרטית, מחזיק במניות החברה. כוח המוח עמנואלה, אנטונלה Cogoni עובדים של נוירו-ביו בע מ
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי נוירו-ביו בע מ ברצוננו להודות Ferrati ג'ובאני ד ר ד ר סרג'יו ברוטונדו (נוירו-ביו) הערות, עצות על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
References
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer's Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical? Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show? Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
