Summary
体内と体外の実験の利点を組み合わせてさらに神経変性疾患の基になる初期のイベントに対する洞察を提供することができますし、確立されたex vivo脳法に基づく手法を提案します。また、同じ解剖学的平面の処理と未処理のグループの直接の比較のためのユニークな機会を表します。
Abstract
基になる神経変性を処理するプライマリを反映して信頼性の高いモデル動物の開発を試みる多くの研究にもかかわらずいくつかの非常に幅広く受け入れられてまいりました。ここでは、新しいプロシージャをよく知られている前のヴィヴォ脳スライス テクニックから、近い体内適応を提案する-として細胞の変性をトリガーする初期のイベントを調査するための体外の準備よりシナリオのようなアルツハイマー病 (AD) で観測されました。このバリエーションは、シンプルで簡単に再現できる手順を実行し、選択した脳の領域と、ローカル機能を生理学的環境での解剖学的研究の保存を有効にするで構成されています。別の解剖学的領域は、サイト、線量、および時間依存的で問題の治療法と複数の実験を実行する機会を提供すること、同じ脳から入手できます。この方法論に関連する成果に影響を与えることができる潜在的な制限を組織、すなわち、スライスとインキュベーションのステップおよび切片厚中の解剖学的な整合性の維持保全に関連します。生化学的および免疫組織化学的解析に影響を与えることができます。このアプローチは、生理学的または病理学的条件、薬物スクリーニング、または用量反応アッセイに関与する分子機構の探索など、さまざまな目的に流用できます。最後に、このプロトコルはまた動物行動学で採用数を減らすことができます。ここで報告されたアプリケーションが最近説明し、含む、前脳基底部 (BF)、広告で主に影響を受ける脳の領域の一つであるラット脳スライス前のヴィヴォの最初の時間のためにテストします。具体的には、それはアセチルコリンエステラーゼ (AChE) の C 末端から派生した有毒ペプチド投与がトリガー、BF の前後軸に沿った発現の広告のようなプロファイルを求める可能性が実証されています。alpha7 ニコチン性受容体 (α 7-nAChR) など、広告の変更蛋白質は、タウ (p-タウ) とアミロイド β (a β) にリン酸化。
Introduction
広告は (OB)1,2,3、嗅 (EC)、BF、海馬 (HC)、嗅球などの異なった頭脳区域に影響を与える段階的な神経変性障害によって特徴づけられる慢性的な病理 4,5。広告開発の後期の段階は、この病気の約すべての場合6の 70% を占め、認知症の最も一般的なフォームを作り、進行性認知機能の低下に します。初期 AD の原因を理解する広範な試みにもかかわらずない現在、定義された実験的徴候がそれらを解明です。AD の病態も効果的な7,8 を証明している医薬品のターゲットを説明する完全なプロフィールを提供されていないまた、最も人気のある理論 -「アミロイド仮説」- は問わ ,9。
注目されている代替理論神経変性時に発生する初期のメカニズム広告3,10,11に主に影響を受けやすい神経クラスターに関連していることを示唆しています。,12,13,14. OB、HC、EC1615,などの複数の地域が BF、中脳、脳幹、プロジェクト内で包まれてこの異種細胞ハブ。神経細胞の形態、神経伝達物質合成の多様性、にもかかわらず細胞のこのコアは非酵素的関数17,18することも痛みを表現する共通の機能を共有します。シグナリング分子は、Ca2 +線量、可用性、および神経年齢17,18に関連して栄養や有害イベントを受けることができるニューロンにカルシウム (Ca2 +) の流れを仲介する小説としてこの非古典的な役割,19。
神経変性、中に観察された細胞損失かもしれないしたがってこの非酵素的関数17,18,20、関連付けられている痛みの C 末端から切断 30mer ペプチド (T30) に起因するであります。20.、T30 誘導 BF 構造を有するラット脳スライス前のヴィヴォに基づいて新規アプローチを通じて我々 は実証以前の結果は、細胞培養と光イメージング18,21の準備、実施に伴い広告のようなプロファイル22。この新しい手法は時間のタイム ・ ウィンドウのとはいえ、解剖学的から回路保全に至るまで、そのまま組織の特性の多くを維持するための細胞培養よりもより生理的シナリオ提供しています。T30 申請急性反応をモニタリング、神経変性疾患の初期の段階で行われるイベントを探索するこのプロトコルを適用されます。
脳の使い方の文献の大きいボディにもかかわらず神経損傷で暗黙の分子経路を調査するスライスまたはより即時初めて神経新生23,24, このプロトコルを提供し、読み出す敏感な比較脊髄スライスの共通使用。ただし、脳切片の場合、この急性スライス手順できますも採用される特定の工程で発生する主な分子の変化検出神経または神経毒性分子の評価など、いくつかの目的のため免疫組織化学的解析、および中枢神経系の薬理学的アッセイ関連病態です。
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Protocol
すべての動物の研究は、承認されたプロトコルの下で行われています。
注: このセクションで実験プロシージャの間に実行される一連の主なフェーズと推奨される時間間隔が表示される (図 1)。また、プロトコルの説明は脳除去から潜伏期間 (図 2) 後の組織の均質化に至るまで重要なアクションを見せて、説明パネルによって補われます。材料と装置と WB 解析のため後続のフェーズを構築する手順について詳細は、前述の22です。
1. 手術器具、Vibratome 設定と治療準備
注: は、実験の手順を開始する前に次の手順を実行します。
- 2 つ異なる人工髄液 (aCSFs)、脳をスライスするために使用される 1 つを準備し、29が前述に潜伏ステップのための他。簡単に言えば、2 つの aCSFs の (モル) で働く集中は、「スライス」アプライド: 120 塩化ナトリウム、5 KCl、20 NaHCO3、2.4 CaCl2、2 MgSO4、1.2 KH2PO4、および 10 のブドウ糖。6.7 HEPES 塩と 3.3 HEPES 酸;pH: 7.1。「記録」アプライドしばらく: 124 NaCl、3.7 KCl、26 NaHCO3、2 CaCl2、1.3 MgSO4、1.3 KH2PO4、および 10 のブドウ糖。pH: 7.1。
- ソリューションを混ぜると氷の上に置くし、脳とその後の断面を除去しながら寒さにスライスのアプライドに酸素を送り込みます。部屋の温度 (RT) と供給酸素記録アプライドに保ちます。
- 斬首と脳の除去、すなわちギロチン、外科解剖キット (ハサミ、鉗子、羽根) とヘラの郭清のフードの下で楽器を配置します。
- Vibratome パラメーターを設定するには、スライス厚測定 (この準備で 300 μ m) と 7 の周波数と 6 で速度を選択します。その適切な場所に vibratome チャンバーを挿入し、氷とそれを囲みます。
- 「スライス」(アプライド) 脳断面中に酸素を送り込むことカーボゲン ・ (95% O2 5% CO2) バルブを開きます。最小流量は 2 mL/分周辺を選択します。
- テストする条件を準備する 2 つの 15 mL チューブを取る。2 μ M (治療群) の濃度で T30 を豊かに「記録」アプライドの 10 mL 1 管 10 mL、「録音」アプライドだけで (コントロール群) のと、他を追加します。渦管し、セットアップ準備段階 (セクション 3) での使用まで氷のそれらを保ちます。
2. 麻酔、脳領域抽出とスライス
注: この研究で 9 野生型 P14 雄 Wistar ラットが使用されました。脳の抽出とその後スライスを防止または組織の変性過程に少なくとも遅くために (10 分) 内ですぐに実行すべきのでプロトコルの重要な一部を構成します。
- 誘導室に綿の層にイソフルランの 100%/w の 1.5 mL を追加、中に動物を配置、ふたを閉じる。動物深く麻酔、ペダルの反射の有無を確認するまで待ち、その後、ギロチンを使用して動物の首をはねます。
- 冷たい鍋含む内の動物の頭を保つ脳除去の段階アプライドをスライス (図 2 a -C)。
- 頭蓋骨に手術の刃で皮膚を切開し、はさみ次の後部から、正中線を使って頭蓋骨をカット、前方 (図 2 a) OBs の上の骨に到達するまで続行します。
- 脳 (図 2 b) へのアクセスを持つためにピンセットのペアを使用して頭蓋骨の横に 2 つの側面を引き出します。脳に腹へらを挿入し、優しくスクープ、それとそれは約 5 分 (図 2) のように冷たい「スライス」アプライドでうるおいをしっかりキープ。
- ろ紙上の脳を処分、ブレード (図 2 D) を用いた小脳を切り取る。Vibratome ディスクに垂直に脳を接着剤し断面のチャンバ内挿入、冷たい「スライス」のアプライドでそれ埋めるし、酸素 (図 2 e) を提供。
- 切断間隔を調整し、脳断面 (図 2 f) に進みます。上記22内側中隔 (MS)、ブローカー (DBB) と黒 innominata (SI) の斜め帯など、関心の領域を含むセクションを収集します。上から下に、3 つのスライスには、吻側 (R)、(I)、中級、BF (図 2) の尾の (C) 部分が含まれています。
- 小さなハサミで正中線に沿って各セクションを分割コントロールと同じ解剖学的平面で扱われる条件として個別に使用 2 つの鏡面 hemislices (図 2 H) を取得します。
- 5-10 分の vibratome 室で、hemisections を維持し、ガラス ピペットで記録アプライドを含むバブル鍋にそれらを転送します。常温約 30 分を回復してください。
- 記録アプライドだけ (以前に管理グループのための 1.6 の手順で準備) 3 mL で 3 つのガラス容器と扱われたグループの T30 (以前に 1.6 の手順で準備) を豊かにアプライドの 3 ml 3 バイアルを一方で、埋めます。
3. セットアップ準備
- 制御グループ (緑枠、図 2 j) の 3 つの連続した hemislices (, 中間, 吻側と尾側の BF 地域を含む) を持つために彼らの対応するガラスの瓶 (図 2 i)、hemisections に転送、治療群 (赤枠、図 2 j) の対応を一致します。
- 条件の間の任意の汚染を防ぐために制御 hemislices と処理対応の 2 つの異なるブラシを有する脳組織を転送します。
- 対応するふたをオキシジェネイティング針 (21 G) (図 2 j) を提示、各バイアルをシールします。カーボゲン ・ ソース (図 2 K) に装置のメインのチューブを接続します。実験では脳組織と機械的損傷の任意の動きを避けるために 2 mL/min の最小流量では培養期間を通して hemislices に酸素を提供します。5 時間培養を開始します。5 分以内 3.1 3.3 の手順を実行します。
注: こまめにチェック (15-20 分毎) すべてのバイアルに酸素が供給されるかどうかと、その流れは底から組織を動いていません。
4. サンプルの均質化
- 孵化後酸素の流れを停止し、バイアル瓶からすべての蓋を削除します。アイス (図 2 L) チューブを維持する換散バッファーの 250 μ L を含む 1.5 mL チューブに適切なブラシを使用して、hemislices に転送します。換散バッファー、PBS 1 をミックスするには、フォスファターゼ、プロテアーゼ阻害剤のカクテルと x で、1: 100 希釈し、サンプル間の汚染を防ぐために異なるすりこぎで組織をホモジナイズしてください。10-15 分内でこれらの操作を完了します。
- 遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 1,000 x g でライセートの脳上清を新しいチューブに転送し、-80 ° C のサンプル
5. タンパク質濃度および西部のしみの分析を読む
- 各サンプルのタンパク質濃度を測定し、その後、上記22として西部のしみの分析試料を準備します。
- 蛋白質の表現の治療の効果を評価するための統計分析を実行します。
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Representative Results
ここで提示されたプロトコルは、α 7-nAChR、p の式のサイト依存的に有毒ペプチド、T30 の管理が変調を示します-タウ ・ BF 含むセクション (図 3 a) で a β。ニコチン性受容体と比べてそのコントロール、吻側治療 hemislice の大幅な増加を示しています (スライス 1、 p = 0.0310) (図 3 b)、中間のスライスは 2 つの条件 (変更を明らかにしない中スライス 2、 p = 0.1195) (図 3 b)。後部セクションはそのコントロール側で大幅な削減は T30 露出部分に存在 (スライス 3、 p = 0.0476) (図 3 b)。T30 申請 p タウ レベルが大幅に側に一致するコントロールに対して前歯で増加 (スライス 1、 p = 0.0158) (図 3)。その一方で、その他 2 つの BF を含むセクションは条件間で有意差を表示しない (スライス 2、 p = 0.1014; スライス 3、 p = 0.6405) (図 3)。T30 暴露後 a β が吻側と中間 hemisections、未処理の対側部分と比較した場合に著しく (スライス 1、 p = 0.0136; スライス 2、 p = 0.0109) (図 3 D)。尾のスライスの 2 つの処置間の変更はありません (スライス 3、 p = 0.1231) (図 3 D)。P タウに対する主な抗体では、リン酸化 Ser202 残基を含むエピトープを認識します。A β に対する主な抗体では、Aβ37 から Aβ42 に至るまで、複数のアイソ フォームを検出します。2 を使用して前述の22尾対tデータを分析した-テストし、SEM. N で表されます = は (1 つのグループ、hemislices のラット) (27、9)。
図 1: 実験手順の間に実行シーケンスや主な手順を示すタイミング。最初と 3 番目の手順を完了する時間間隔は、オペレーターの経験レベルに関連して変更できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: プロトコルの進行を示す一連のステップです。(A-D)頭蓋骨と脳の残りの部分からの小脳の分離から脳の抽出。(E) vibratome ディスクと氷に囲まれて、冷たいアプライド スライス中に常に酸素でいっぱい解剖室に転送の脳の添付ファイル。(F) 脳の冠状断面。吻側 (R)、(私)、中級、前脳基底部の尾側 (C) の構造を含む、スライスのコレクションを (G)。2 つの一致する hemislices のセクションの (H) の分離。(私) 各ヘミセクションはその対応するバイアルに配置されます。(J) バイアルは装置ボックスの内側のサポートに配置、個別に閉じる。(K) インキュベーション システム酸素源 (黒丸) への接続時に期間。(L) は、治療後のサンプルの均質化。この図は、22から変更されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: T30 p α 7-nAChR の部位特異的発現を介した-タウ ・ BF 吻尾軸 a β 。(A) 前脳基底部の核 (白点線)、2 つの相補部分に分かれて、さまざまな条件にさらされるを含む脳辺縁系の表現。(B) 後 T30 露出、ニコチン性受容体 (T30 1) の前方の区分と対応する制御側 (ctrl キー 1 と ctrl 3) と比較して 1 つ (T30 3) 後部のマーク付きの減少で大幅な増加を示しています。中間のスライスでは、(ctrl 2、T30 2) の 2 つの条件間の任意の変更は表示されません。(C) p タウ式は、他の 2 つのスライス (スライス 2 と 3 のスライス) の 2 つのグループの違いを明らかにしないに対し、その制御一致する相手 (ctrl 1) 上処理の吻側部分 (T30 1) で有意に高値です。(D) a β の前方および中間処理区分 (T30 1 および T30 2) 対応する未処理側面 (ctrl キー 1 と ctrl 2) と比較して大幅に増加が表示されます。尾セクションで 2 つのグループの間の変動はありません。誤差範囲を示す SEM. * p < 0.05.n = は (1 つのグループ、hemislices のラット) (27、9)。スケール バーは、1 mm です。この図は、22 日から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
特定のアプリケーションの後の彼らの応答を監視、同じ解剖学的面から取得した 2 つの鏡面 hemislices を同期的にテストすることができます確立前のヴィヴォ脳の技術に基づいて、このプロトコルの主要側面条件 (制御または扱われる);したがって、できるだけしっかりと制御実験パラダイムを提供します。神経変性イベント22日中に見られるように時間、線量 - と部位特異的異なる neurochemicals 神経障害に関連する評価の可能性は、本質的な機能を表します。この方法論は、体外で準備、関心領域を取得し、理想的な細胞外コンテキストの作成で精度などの体内の生理環境の利点をリンクします。このプロトコルは広く前のヴィヴォ電気生理学的記録25,26,27光イメージング28,プロシージャをスライス共通の脳の適応を表す29,30、または培養切片スライス、両方構造とシナプス組織23,24 の保全により近い体内の状況をシミュレートします。、31,32。
さらに、この手順は、以来、それは部分的生体内で複製行動の研究で使用される動物の数を少なく助けることができる-の in vitroデータでは、細胞培養などを確認するため採用できる条件のような免疫組織化学的解析、生体実験を予想。
提案手法は、セクション厚さや整合性は、適切ではない場合は、最終的な結果を変えることができるなど、いくつかの制限も提示します。対照群と処理の比較に影響を及ぼす可能性がありますので、インキュベーション時間もこの手法の基本的なコンポーネントです。さらに、一連の手順または技術的な問題が発生した場合、プロトコルのすべてのステップの間によう: (1) 機械的ダメージを抽出したり、組織の正確な穏やかな処理によって避けることができる脳の断面(その整合性に影響を与える、アプライドに浸漬 2) オキシジェネイティング針にふれた場合に機械的に組織を損傷することが過剰な酸素の流れのため潜伏中に、hemislices のフローティングします。これはバブル; 最低レートを調整することによって防ぐことができます。(3) の不在や出没酸素の流量ではオキシジェネイティング針でプラグ チューブにおける空容器の損傷や切断を関連付けることができますまたはときそれは正しく浸漬は、アプライド。一定の酸素とそのフローの手順このプロトコルの最も重要な側面の 1 つを表しているので、調査のグループ間の同質な状態を維持するためにすべてのこれらのパラメーターを頻繁に監視することが重要です。
プロトコルの他の重要な手順が表示されます各アクションを実行するために必要な時間の窓、ときに続くが限り可能な限り整合性と組織の機能を維持します。さらに、前述の23,29として神経細胞生存率および電気生理学的記録に関連する特定のマーカーを検出するため、これらのパラメーターを評価するために免疫組織化学的解析を実行できます。
ここで説明した結果、を超えてこのメソッドは設計アドホック特定調査のためかもしれない。例えば、それに適用することができます: (1) モニターと比較いくつかのさまざまな化合物の活性脳領域、アプライド Neurobasal 媒体など、選択したソリューションにそれらをインキュベート(2) 研究で実行低酸素症、酸素の流れを各ヘミセクション; で選択的に制御できますので(3) 異なる病トランスジェニック動物モデルから脳組織特性を調べる(4) 同時に生体内で片側脳注射の効果を同じ解剖学的レベルで探索し、比較するコントロール半球。(5) したがって潜在的円滑化と創薬スクリーニング試験の長さを短く、他の臓器や組織のプロパティを探索します。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的な利益を宣言します。スーザン ・ a. グリーン フィールドは、創設者兼社長神経バイオ限定、個人所有の会社と会社の株を保有しております。エマヌエーレ ブライとアントネラ Cogoni 神経バイオ株式会社の従業員であります。
Acknowledgments
この作品会社ニューロ バイオで賄われていた我々 感謝したい博士・ ジョヴァンニ ・ Ferrati、博士セルジオ ・ ロトンド (神経生物)、コメントや原稿にアドバイスを。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
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