Summary
Vi presenterar en metod som kan ge ytterligare insikter i de tidiga händelser som underliggande neurodegeneration och bygger på etablerade ex-vivo brain teknik, kombinerar fördelarna med i vivo och in vitro- experiment. Dessutom innebär det en unik möjlighet för direkt jämförelse av behandlat och obehandlat grupp i samma anatomiska plan.
Abstract
Trots många studier som försöker utveckla tillförlitliga djurmodeller som återspeglar primärt processer underliggande neurodegeneration, har mycket få varit allmänt accepterat. Här föreslår vi ett nytt förfarande som anpassas från välkända ex vivo brain slice tekniken, som erbjuder en närmare i vivo-som scenario än in vitro- preparat, för att utreda de tidiga händelser som utlöser cell degeneration, som hos Alzheimers sjukdom (AD). Denna variation består av enkla och enkelt reproducerbar steg, som möjliggör bevarandet av de anatomiska cytoarchitecture av hjärnregionen valda och dess lokala funktionalitet i en fysiologisk miljö. Olika anatomiska områden kan erhållas från samma hjärnan, vilket ger möjlighet att utföra flera experiment med behandlingarna som är i fråga i en webbplats - dos- och tidsberoende sätt. Potentiella begränsningar som kan påverka resultaten relaterade till denna metod är relaterade till bevarande av vävnad, dvs underhållet av dess anatomiska integritet under skivning och inkubation stegen och snittjocklek, som kan påverka den biokemiska och immunhistokemisk analysen. Detta tillvägagångssätt kan användas för olika ändamål såsom att utforska molekylära mekanismer som är involverade i fysiologiska eller patologiska tillstånd, drogkontroll eller dos-respons-analyser. Slutligen kan detta protokoll också minska antalet djur som anställd i beteendevetenskapliga studier. Programmet redovisas här har nyligen beskrivits och testade för första gången på ex vivo råtta hjärnan skivor som innehåller basala framhjärnan (BF), som är en av de cerebrala regioner som främst drabbade i AD. Specifikt, har det visats att administrationen av en giftig peptid som härrör från C-terminus av acetylkolinesteras (AChE) kunde föranleda en AD-liknande profil, utlösande, längs ryggsköldens axel BF, en differentiell uttryck för proteiner som ändrats i AD, t.ex alpha7 nikotinhaltiga receptorn (α7-nAChR), fosforyleras Tau (p-Tau) och beta-amyloid (Aβ).
Introduction
AD är en kronisk patologi kännetecknas av gradvis neurodegenerativa nedsatt påverkar olika hjärnområden, såsom entorhinal cortex (EG), BF, hippocampus (HC) och luktbulben (OB)1,2,3, 4,5. Sena stadier av AD utveckling leder till en progressiv försämring av kognitiva funktioner, vilket gör denna sjukdom är den vanligaste formen av demens, ungefärligt står för 70% av alla fall6. Trots omfattande försök att förstå de inledande stadierna som orsakar AD, finns det inte för närvarande en definierad experimentella indikation belysa dem. Dessutom, ifrågasätts den mest populära teorin - ”amyloid hypotesen” - alltmer eftersom det inte ger en komplett profil för att förklara den AD patobiologi, och inte heller en farmaceutisk mål som har visat sig effektiv7,8 ,9.
En alternativ teori som får allt större uppmärksamhet tyder på att de inledande mekanismer som inträffar under neurodegeneration är relaterade till ett neuronala kluster primärt mottagliga AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. denna heterogena cellulära navet omfattade inom BF, mellanhjärnan och hjärnstammen, projekten till flera regioner, såsom de EG, HC och OB15,16. Trots sin mångfald i neuronala morfologi och signalsubstansen syntes delar denna kärna av celler gemensamt uttrycker värk, som också kan ha en icke-enzymatiska funktion17,18. Denna icke-klassiska roll som en roman signalering molekyl förmedlar kalcium (Ca2 +) flöde in i nervceller som kan genomgå trofiska eller giftiga händelser i förhållande till Ca2 + dos, tillgänglighet och neuronala ålder17,18 , 19.
Under neurodegeneration, kanske observerade cellulära förlusten är därför associerade till denna icke-enzymatiska funktion17,18,20, som är hänförligt till en 30mer peptid (T30) klyvs från värk C-terminus 20. i linje med tidigare resultat, transporteras på cellkultur och optisk imaging18,21 preparat, vi visat, genom en ny metod baserat på ex vivo råtta hjärnan skivor som innehåller BF strukturer, som T30 inducerad en AD-liknande profil22. Specifikt, erbjuder denna nya metod ett mer fysiologiska scenario än cellkultur eftersom det upprätthåller många av egenskaperna av en intakt vävnad, allt från anatomiska till kretsar konservering, om än för ett tidsfönster på timmar. Vi tillämpat detta protokoll för att utforska de händelser som äger rum under tidiga faser av neurodegeneration, övervakning akut svar på T30 ansökan.
Trots den stora mängden litteratur på använder hjärnan skivor att undersöka molekylära vägar antyds i neuronala skador eller neurogenes23,24, detta protokoll för första gången ger en mer omedelbar och känsliga läsa ut jämfört gemensam användning av organotypic skivor. Dock är fallet för organotypic hjärnan sektioner, kan proceduren akut segment också antas för flera ändamål, såsom utvärdering av nervskyddande eller neurotoxiska molekyler, upptäckten av primära molekylära förändringar som sker i en specifik process, immunhistokemisk analys och farmakologiska analyser för centrala nervsystemet relaterade sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla Djurstudier har utförts under godkända protokoll.
Obs: I det här avsnittet sekvensen av de viktigaste faserna utförs under det experimentella förfarandet och föreslagna tidsintervallet tillhandahålls (figur 1). En stegvis beskrivning av protokollet kompletteras dessutom av en belysande panel, visar kritiska åtgärder alltifrån hjärnan borttagning till vävnad homogenisering efter inkubationstiden (figur 2). Detaljerna avseende material och instruktioner för att bygga apparaten och den efterföljande fasen för WB analys är tidigare beskrivna22.
1. kirurgiska verktyg, inställningar för Vibratome och behandling förberedelser
Obs: Utföra följande steg innan du börjar experimentella förfarandet:
- Förbered två olika konstgjorda cerebrospinala vätskor (aCSFs), som används för hjärnan skivning och den andra för inkubation steg beskrivs som tidigare29. Sammanfattningsvis arbetar koncentrationerna (i mmol) av de två aCSFs är för den ”slice” aCSF: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2,4 CaCl2, 2 MgSO4, 1,2 KH2PO4och 10 glukos; 6,7 HEPES salt och 3.3 HEPES syra; pH: 7,1. Tag för de ”inspelning” aCSF: 124 NaCl, 3,7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1,3 KH2PO4och 10 glukos; pH: 7,1.
- Blanda väl lösningarna och sedan sätta på is och syresätta den skivning aCSF för att få det kallt medan du tar bort hjärnan och den efterföljande snittning. Förvaras vid rumstemperatur (RT) och leverans syre den inspelning aCSF.
- Placera instrumenten under dissektion huven för borttagning av halshuggning och hjärnan, dvs, giljotin, kirurgisk dissektion kit (sax, pincett, blad), och spatel.
- Ställa in parametrarna för vibratome genom att välja skiva tjocklek (300 µm i denna beredning) och frekvensen på 7 och hastighet på 6. Infoga vibratome kammaren i dess lämpligt utrymme och omge det med is.
- Öppna carbogen (95% O2, 5% CO2) ventilen för att syresätta de ”skivning” (aCSF) under den hjärnan snittning. Välj det minsta flödet, runt 2 mL/min.
- Ta två 15 mL rör att förbereda villkoren för att testa. Lägga till i en tub 10 mL av den ”inspelning” aCSF ensam (kontrollgrupp) och i den andra, 10 mL av den ”inspelning” aCSF berikad med T30 vid en koncentration av 2 µM (behandlade gruppen). Vortex både rör och hålla dem på is tills deras användning i förberedelse installationsfasen (avsnitt 3).
2. anestesi, hjärnan utvinning och skivning
Obs: I denna studie användes 9 vildtyp P14 manliga Wistar råttor. Hjärnan utvinning och efterföljande skivning utgör en kritisk del av protokollet eftersom de bör utföras snabbt (inom 10 min) för att förhindra eller åtminstone bromsa vävnad degeneration processer.
- Tillsätt 1,5 mL 100% w/w för isofluran på en bomull-lager i induktion kammaren, placera djuret inuti och Stäng locket. Vänta tills djuret är djupt sövda, bekräftar avsaknaden av pedal reflexen, och sedan halshugga djuret med giljotinen.
- Hålla huvudet av djuret i en kruka med iskall skivning aCSF under hjärnan borttagning steg (figur 2A -C).
- Incisionsfilm huden över skallen med en kirurgisk blad, och sedan klippa skallen med sax efter mittlinjen, från den bakre delen och fortsätt anteriorly tills benet ovanför OBs (figur 2A).
- Dra sido de två sidorna av skallen med ett par pincett för att få tillgång till hjärnan (figur 2B). Infoga en spatel ventralt till hjärnan, försiktigt scoop ut, och hålla den återfuktad i iskall ”slice” aCSF under cirka 5 minuter (figur 2 c).
- Förfoga över hjärnan på filterpapper och klipp ut lillhjärnan med hjälp av ett blad (figur 2D). Limma hjärnan vertikalt på vibratome skivan och infoga det inne i snittning kammaren, fylla den med iskall ”slice” aCSF och ge syre (figur 2E).
- Justera intervallet styckning, och fortsätt med den hjärnan snittning (figur 2F). Samla de avsnitt som innehåller regionen av intresse, såsom mediala septum (MS), diagonalt band av Broca (DBB) och substantia innominata (SI), som tidigare beskrivits22. Från toppen till botten innehåller tre skivor den rostralt (R), intermediär (I) och kaudalt (C) delen av BF (figur 2 g).
- Dela upp längs mittlinjen varje avsnitt med liten sax, att erhålla två speglande hemislices (figur 2 H), används individuellt som kontroll och behandlade tillstånd på samma anatomiska plan.
- Hålla hemisections i vibratome kammaren för 5-10 min och sedan överföra dem med glas pipett i en bubblande gryta innehållande inspelning aCSF. Hålla RT i ungefär 30 min att återställa.
- Fylla, under tiden tre glasampuller med 3 mL inspelning aCSF ensam (tidigare bereddes i steg 1,6 för kontrollgruppen) och tre injektionsflaskor med 3 mL aCSF berikad med T30 (tidigare bereddes i steg 1,6) för den behandlade gruppen.
3. setup förberedelse
- Överför hemisections till deras motsvarande glasampuller (figur 2I) för att ha tre på varandra följande hemislices (inklusive regionen rostralt, mellanliggande och stjärtfenan BF) för kontrollgruppen (grön ram, figur 2J) och deras matchande motsvarigheter för den behandlade gruppen (röd ram, figur 2J).
- Överför hjärnvävnad med två olika borstar, en för den kontroll hemislices och en annan för de behandlade motsvarigheterna, för att förhindra kontaminering mellan villkor.
- Försegla varje injektionsflaska av glas med motsvarande locket, presentera syresätta nålen (21G) (figur 2J). Anslut det huvudsakliga röret av apparaten till carbogen källa (figur 2 K). Leverera syre till hemislices i hela inkubationstiden med en minimal flödeshastighet av 2 mL/min för att undvika eventuella förflyttning av hjärnvävnad och mekaniska skador under experimentet. Start 5 h ruvning. Utföra stegen 3.1-3.3 inom 5 min.
Obs: Kontrollera ofta (varje 15-20 min) om syre levereras till alla injektionsflaskorna och att dess flöde inte går vävnaden från botten.
4. prov homogenisering
- Stoppa syreflödet efter inkubering och ta bort alla locken från injektionsflaskorna. Överföra de hemislices, med ordentlig borstarna, i 1,5 mL rör som innehåller 250 μl lyseringsbuffert, upprätthålla rören på is (figur 2 L). För att göra Lys buffert, blanda PBS 1 x med fosfatas och proteas hämmare cocktails både utspätt till 1: 100, och homogenisera vävnaden med olika mortlar att förhindra kontaminering bland proverna. Slutföra dessa åtgärder inom 10-15 min.
- Centrifugera hjärnan lysate vid 1 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Överför supernatanten till nya rör och hålla proverna vid-80 ° C.
5. behandlingen av proteinkoncentration och Western Blot analys
- Bestämma protein koncentrationen av varje prov och därefter förbereda alikvoter för Western blot analys som tidigare beskrivits22.
- Utföra statistiska analyser för att utvärdera effekter av behandlingen på proteinuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som presenteras här visar att administrationen av en giftig peptid, T30, modulerar på en webbplats-beroende sätt uttryck för α7-nAChR, p-Tau och Aβ i BF-innehållande sektioner (figur 3A). Nikotinhaltiga receptorn visar en betydande ökning i den rostralt-behandlade hemislice jämfört med dess kontroll motsvarighet (skiva 1, p = 0.0310) (figur 3B), medan mellanliggande skiva inte avslöjar någon förändring mellan de två villkor ( skiva 2, p = 0,1195) (figur 3B). I avsnittet bakre en betydande minskning är närvarande i vydelen T30-exponerade över dess kontroll sida (skiva 3, p = 0.0476) (figur 3B). Efter T30 ansökan, p-Tau nivåerna avsevärt ökar i den främre regionen mot kontrollen matchande sida (skiva 1, p = 0,0158) (figur 3 c). Däremot, de andra två BF-innehållande avsnitten inte visar någon signifikant skillnad mellan villkor (skiva 2, p = 0.1014; skiva 3, p = 0.6405) (figur 3 c). Efter T30 exponering, Aβ markant förbättrade i den rostralt och mellanliggande hemisections jämfört med deras obehandlad kontralaterala portionr (skiva 1, p = 0.0136; skiva 2, p = 0.0109) (figur 3D). I den kaudala biten, det finns ingen förändring mellan de två behandlingarna (skiva 3, p = 0.1231) (figur 3D). Den primär antikroppen mot p-Tau erkänner den epitop som innehåller fosforylerade Ser202 rester. Den primär antikroppen mot Aβ upptäcker flera isoformer, alltifrån Aβ37 till Aβ42. Data analyserades enligt tidigare beskrivna22 använder två tailed Parade t-tester och representerade som SEM. N = (hemislices per grupp, råttor) är (27, 9).
Figur 1: sekvens och vägledande timing av de viktigaste stegen utförs under det experimentella förfarandet. Tidsintervallet att slutföra det första och tredje steget kan variera i förhållande till operatörens erfarenhetsnivå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: sekventiella steg illustrerar protokoll progressionen. (A–D) Utvinning av hjärnan från skallen och separation av lillhjärnan från resten av hjärnan. (E) fastsättning av hjärnan på vibratome skivan och överföring till dissektion kammaren, som omges av is och fylld med kall aCSF ständigt syresatt under skivning. (F) koronalt hjärnan snittning. (G) samling av skivor, som innehåller rostralt (R), intermediär (jag) och kaudalt (C) strukturer av basala framhjärnan. (H) Separation av avsnitten i två matchande hemislices. (jag) varje hemisection placeras i dess motsvarande injektionsflaska. (J) injektionsflaskor placerad i stöd, inuti rutan apparater och stängd separat. (K) inkubation period vid anslutning av systemet till syre källan (svart cirkel). (L) homogenisering av prov efter behandlingen. Denna siffra är modifierad från22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: T30 medierad platsspecifika uttryck för α7-nAChR, p-Tau och Aβ längs BF rostro-kaudala axeln. (A) framställning av hjärnan koronalt skivor inklusive basala framhjärnan atomkärnor (vita streckade linjer), uppdelad i två kompletterande delar och utsätts för olika förhållanden. (B) efter T30 exponering, nikotinhaltiga receptorn visar en betydande ökning i det främre delfältet (T30 1) och en markant minskning i den bakre en (T30 3) jämfört med motsvarande kontroll sidorna (ctrl 1 och ctrl 3). Mellanliggande skiva visar inte någon förändring mellan de två villkor (ctrl 2, T30 2). (C) p-Tau uttryck är betydligt högre i den behandlade rostralt delen (T30 1) över dess kontroll matchande motsvarighet (ctrl 1), medan de andra två skivorna inte avslöjar någon skillnad i de två grupperna (del 2 och del 3). (D) Aβ visar en betydande ökning i de främre och mellanliggande behandlade delområden (T30 1 och T30 2) jämfört med deras motsvarande obehandlad sidor (ctrl 1 och ctrl 2). I kaudala avsnitt finns det ingen variation mellan de två grupperna. Felstaplarna indikerar SEM. * p < 0.05.n = (hemislices per grupp, råttor) är (27, 9). Skalstapeln är 1 mm. Denna siffra har ändrats från22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den viktigaste aspekten av detta protokoll, bygger på väletablerade ex vivo brain teknik, tillåter att synkront testa två speglande hemislices, erhålls från samma anatomiska plan, övervakningen av deras svar efter ansökan av ett specifikt skick (kontroll eller behandlas); Detta erbjuder därför ett experimentella paradigm kontrolleras lika noggrant som möjligt. Möjligheten att utvärdera i en tid - dos- och platsspecifika sätt olika neurochemicals relaterade till neuronala njurfunktion, som sett under neurodegenerativa händelser22, representerar en viktig funktion. Denna metod länkar fördelarna av en in-vivo fysiologisk miljö med de av in vitro- preparat, såsom noggrannhet att erhålla regionen av intresse och att skapa det perfekta extracellulära sammanhanget. Detta protokoll utgör en anpassning av gemensamma hjärnan skivning förfarande som allmänt används för ex vivo elektrofysiologiska inspelningar25,26,27 och optisk imaging28, 29,30, eller in vitro- organotypic skivor, som simulerar en närmare i vivo situationen genom att aktivera bevarandet av både strukturella och synaptic organisation23,24 ,31,32.
Dessutom detta förfarande kan bidra till att minska antalet djur som används i beteendevetenskapliga studier eftersom det delvis återger en in-vivo-liknande tillstånd, som kan antas för att bekräfta in vitro- data, till exempel cellkultur och immunhistokemisk analys, och sedan räknar in-vivo -experiment.
Den föreslagna metoden presenterar också vissa begränsningar, såsom snittjocklek och integritet som, när inte lämpligt, kan förändra slutresultatet. Inkubationstiden är också en grundläggande del av denna teknik eftersom det kan påverka jämförelsen mellan kontrollgruppen och den behandlade. Dessutom en rad processuella eller tekniska problem kan uppstå under alla steg i protokollet, såsom: (1) mekanisk skada samtidigt utvinna eller snittning hjärnan, vilket kan undvikas genom exakt och skonsam hantering av vävnad; (2) flytande av hemislices under inkubationstiden på grund av en överdriven syre flöde, som mekaniskt kan skada vävnaden om det berör syresätta nålen nersänkt i den aCSF, vilket påverkar dess integritet. Detta kan förhindras genom att anpassa till den lägsta avkastningsgraden bubblande; och (3) frånvaro eller obeständig syre flöde, vilket kan relateras till den tomma kapseln, en skada eller frånkoppling i systemet slangar, en plugg i syresätta nålen, eller när det är inte korrekt nedsänkt i aCSF. Eftersom konstant syresättningen och dess flöde under hela förfarandet utgör en av de mest kritiska aspekterna av detta protokoll, är det viktigt att ofta övervaka alla dessa parametrar för att bibehålla en homogen tillstånd mellan de undersökta grupperna.
Andra kritiska steg i protokollet representeras av de tidsfönster som krävs för att utföra varje åtgärd, som när följt kommer bevara så mycket som möjligt integritet och funktionalitet av vävnad. För att bedöma dessa parametrar, kan dessutom immunhistokemisk analys utföras för att upptäcka specifika markörer relaterade till neuronala livskraft och elektrofysiologiska inspelningar som tidigare beskrivits23,29.
Utöver resultaten beskrivs här, kan denna metod vara utformade ad hoc för särskilda undersökningar. Till exempel, det kan gälla: (1) övervaka och jämför aktiviteten av olika föreningar i flera områden i hjärnan, inkubering med den valda lösningen, såsom aCSF eller Neurobasal medium; (2) utföra studier på hypoxi, eftersom syreflödet styras selektivt i varje hemisection; (3) undersöka hjärnans vävnad egenskaper från transgena djurmodeller av olika sjukdomar. (4) samtidigt utforska, på samma anatomiska nivå, effekterna av i vivo ensidiga hjärnan injektioner och jämföra dem med den kontroll halvklotet; och (5) utforska andra organ eller vävnader egenskaper, därför potentiellt underlätta och minska längden på drug screening prövningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar konkurrerande finansiella intressen. Susan A. Greenfield är grundare och VD av Neuro-Bio Limited, ett privatägt företag och innehar aktier i bolaget. Emanuele Brai och Antonella Cogoni är anställda av Neuro-Bio Ltd.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Neuro-Bio Ltd. Vi vill tacka Dr. Giovanni Ferrati och Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) för deras kommentarer och råd om manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
References
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer's Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical? Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show? Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
