Summary
Íons de potássio contribuem para o descanso potencial de membrana das células e a concentração extracelular de K+ é um regulador crucial da excitabilidade celular. Descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K+-seletivos microeletrodos. Usar tais eletrodos permite a medição da dinâmica de concentração de K+ eletricamente evocada em fatias hippocampal adultas.
Abstract
Íons de potássio contribuem significativamente para o descanso potencial de membrana das células e, portanto, a concentração extracelular de K+ é um regulador crucial da excitabilidade da célula. Alterou a concentrações extracelulares K+ vai afectar a excitabilidade de celular e potenciais de membrana de descanso deslocando o equilíbrio entre Estados fechados, abertos e inativados para canais dependentes de voltagem íon que fundamentam o potencial de ação iniciação e condução. Portanto, é valioso para medir diretamente o extracelular K+ dinâmica na saúde e Estados doentes. Aqui, descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K+-seletivos microeletrodos. Nós lhes implantado em fatias hippocampal cérebro de um adulto para medir evocada eletricamente dinâmica de concentração de K+ . O uso criterioso de tais eletrodos é uma parte importante do kit de ferramentas necessária para avaliar os mecanismos celulares e biofísicos que controlam a concentração extracelular de K+ no sistema nervoso.
Introduction
Concentrações de íons potássio estão fortemente regulamentadas no cérebro, e suas flutuações exercem uma poderosa influência sobre o potencial de membrana descanso de todas as células. À luz destas contribuições críticas, um objectivo importante da biologia é determinar os mecanismos celulares e biofísicos que são usados para regular firmemente a concentração de K+ no espaço extracelular em diferentes órgãos do corpo1 , 2. a capacidade de medir concentrações de K+ com precisão, constitui um requisito importante nestes estudos. Apesar de muitos componentes que contribuem para a homeostase do potássio no cérebro em Estados saudáveis e doentes foram identificados3,4,5, ainda mais progresso tem sido abrandado devido à natureza especializada do preparando íon seletivo microeletrodos para medição de potássio. Sensores de microeletrodos representam o padrão de ouro para medir K+ concentrações em vitro, em fatias de tecido e em vivo.
Novos enfoques para K+ de monitoramento estão em desenvolvimento utilizando sensores ópticos, porém estes não detectar uma gama biologicamente relevantes de K+ concentrações ou já não foram totalmente analisados em sistemas biológicos, embora os resultados iniciais Parece promissor,6,7,8. Comparado com sensores ópticos, microeletrodos são fundamentalmente limitados a uma medição de ponto fonte de íons, embora matrizes eletrodo poderiam melhorar a resolução espacial9. Este artigo enfoca os sensores de cano único microeletrodos para monitoração dinâmica K+ .
Neste trabalho, relatamos os procedimentos detalhados em etapas para fazer K+ seletivos microeletrodos, usando um ionóforo de potássio valinomicina-baseado que permite altamente seletivo (dobra4 10 K+ a seletividade Na+ ) K+ movimentação de membranas10. Um polipeptídeo natural, valinomicina atua como um poro permeável K+ e facilita o fluxo de K+ para baixo é um gradiente electroquímico. Também descreveremos como calibrar os eletrodos, como armazenar e usá-los e, finalmente, como implantá-las para medir a dinâmica de concentração K+ em fatias aguda hippocampal cérebro de ratos adultos. O uso de tais eletrodos juntamente com ratos geneticamente modificados que não possuem canais de íon específico propostos para regular extracelular K+ dinâmica deve revelar os mecanismos celulares usados pelo sistema nervoso para controlar a concentração ambiente de K + no meio extracelular.
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Protocol
Todos os animais de experimentos foram conduzidos em conformidade com o Instituto Nacional de saúde-guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de pesquisa Animal do Chanceler a Universidade da Califórnia, Los Angeles. Todos os ratos foram alojados com comida e água disponível ad libitum em um ambiente de claro-escuro de 12 h. Todos os animais eram saudáveis sem alterações comportamentais óbvias, não estavam envolvidos em estudos anteriores e foram sacrificados durante o ciclo de luz. Dados de experimentos foram coletados de ratos adultos (6-8 semanas de idade para todos os experimentos).
1. preparação de microeletrodos seletivas K+
- Silanização de vidro de borosilicato
- Remova o suficiente capilares de vidro da embalagem e coloque em um tubo cónico de 50 mL. Encha o tubo cônico para cima com eletrodos de 1m HCl. lavagem com agitação suave em HCl durante a noite ou durante um período mínimo de 6 horas.
- Brevemente, enxágue capilares com etanol a 70% e depois seque completamente a 100-120 ° C por 6 a 8 horas. Loja capilares lavados em recipientes com dessecante de sulfato de cálcio anidro por até 4 semanas antes de nova utilização.
- Antes da silanização, puxe os capilares para uma ponta fina usando um extrator de microeletrodos. Os microeletrodos que usamos são cerca de 2 a 5 mícrons de diâmetro. Sempre lidar com capilares lavados com luvas, como óleos de pele podem interferir com a silanização.
- Colocar microeletrodos para um recipiente de vidro para que os eletrodos são elevados da parte inferior para evitar a ruptura de ponta. Corrigi os microeletrodos ao contêiner usando fita de autoclave ou similar de fita adesiva.
- Remova aproximadamente 0,5 mL de solução de silanização 5% diclorodimetilsilano (DDS) do seu contêiner usando o método de substituição de nitrogênio (ver Figura 2). Encha um balão com gás de nitrogênio e anexar uma seringa ou tubo e agulha para o balão. Inserir a agulha em recipiente DDS enquanto elaboração de DDS para uma seringa separada através de uma agulha mais longa.
- Aplicar a solução de silanização gota a gota as dicas das pipetas e cubra imediatamente. Coloque o recipiente segurando os microeletrodos com solução de silanização em um forno de laboratório (170-180 ° C) pré-aquecido por 10-12 horas ou a 200-220 ° C por 30 minutos
- Após a incubação, desligar o forno e, em seguida, retire a placa do forno. Tenha cuidado ao retirar a placa da incubadora, como é extremamente quente. Coloque a placa em um banco na temperatura ambiente por 10-15 minutos para permitir que o vidro esfriar.
- Remova a placa (usando uma lâmina de navalha ou lâmina de bisturi para cortar a fita) os microeletrodos e colocá-los em um recipiente hermético preenchido dessecante. Microeletrodos silanizada mantidos livres de umidade podem ser usados por até 1 semana após silanização.
- Aprontar os eléctrodos
- Prepare uma solução stock de K+ ionóforo cocktail: valinomicina de 5% p/v, 93% v/v 1,2-dimetil-3-nitrobenzeno, potássio 2% w/v tetrakis(4-chlorophenyl) borato11. Esta solução é uma cor amarela fraca. Mantenha-se em um recipiente hermético, opaco em temperatura ambiente. Se armazenado corretamente esta solução pode durar muitos meses.
- Prepare uma solução stock de 10 mM HEPES buffer 300 mM NaCl em pH 7,4. Fixe o eletrodo em uma braçadeira e aterre com o NaCl no buffer usando uma ponta de micropartículas de 28G conectada a uma seringa. Observe que a solução salina atingiu o fim da ponta de microeletrodos. Confirme que o microeléctrodo é livre de grandes bolhas que podem interferir com o fluxo da corrente.
- Quebre a ponta do eletrodo de aproximadamente 10-20 µm de largura, utilizando o lado sem corte de um bisturi ou lâmina de barbear.
- Utilizando uma micropipeta, aplica uma gota pequena (~0.1 µ l) do ionóforo K+ perto da ponta dos microeletrodos. Se o eletrodo foi devidamente silanizada a gota será absorvida na ponta quebrada. Preenchimento do eletrodo para 1-2 mm com o ionóforo K+ e remove o excesso usando lenços de papel.
2. calibração de microeletrodos seletivas K+
- Preparação das soluções de calibração
- Prepare soluções de diferentes concentrações de KCl em osmolaridade igual artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) substituindo NaCl por KCl. Usamos a 0.1, 1, 4.5, 10 e 100 mM K+ ACSF, para calibração de eletrodos. As receitas para essas soluções de calibração são listadas na tabela 1.
| Produto químico | MW | final mM | 0,1 mM [K +] | 1 mM [K +] | 4.5 mM [K +] | 10 mM [K +] | 100 mM [K +] |
| (g / mol) | |||||||
| NaCl | 58.44 | varia | 1,51 g | 1,50 g | 1,44 g | 1,4 g | 0,345 g |
| KCl | Estoque de 1 M | varia | 20 µ l | 200 µ l | 900 µ l | 2 ml | 20 ml |
| CaCl2 | Estoque de 1 M | 2 | 400 µ l | ||||
| MgCl2 | Estoque de 1 M | 1 | 200 µ l | ||||
| NaH2PO4 | 119.98 | 1.2 | 0,29 g | ||||
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | g 0,437 | ||||
| D-glicose | 180.16 | 10 | 0,360 g | ||||
| Água | QS 200ml | ||||||
Tabela 1. Soluções de calibração de potássio
- Calibração de microeletrodos
- Bolha todas as soluções com 95% O25% CO2 pelo menos 20 minutos antes de começar o experimento. Começar a perfusing o banho com 4,5 mM [K+] ACSF a uma taxa de 3 mL por minuto. Coloque o elétrodo seletivo do K+ no eléctrodo anexado para o eletrodo headstage sobre o manipulador. Este headstage é conectado a um amplificador adequado. Introduza a ponta do eletrodo o perfusato de banho.
- Certifique-se o eléctrodo de terra de Ag/AgCl é banhado na mesma solução e que o fluxo é constante. Aplicar soluções de calibração, de forma gradual e gravar as alterações de potenciais em mV, do outro lado da ponta do eletrodo. Esperar que o potencial na ponta do eletrodo para atingir um valor estável antes de mudar para a próxima solução
- Medir a mudança de tensão de estado estacionário em resposta a aplicação de soluções de calibração, a ponta do eletrodo. Confirmar que o declive da resposta do eletrodo é pelo menos 52 e não maior que 58 mV por registro de mudança em [K+].
3. preparação de fatias de cérebro Hippocampal aguda
- Preparação de soluções de fatia
- Preparar a sacarose 500ml corte solução composta de: sacarose 194 mM, 30 mM de NaCl, 4,5 mM KCl, D-glicose, 1 mM MgCl2de 10 mM, 1,2 mM NaH2PO4e 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, saturado com 95% O2 e 5% de CO2.
- Prepare-se 1-2 litros de solução de gravação (ACSF) compostos por: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10mm D-glicose, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4e 26 mM NaHCO3; pH 7.3-7.4 (depois da subida), 290-300 mOsm, saturado com 95% O2 e 5% de CO2. Encha um copo contendo uma câmara de titular de fatia do cérebro com solução de gravação e mantém-na 32-34 ° C. Encha a câmara de vibratome com lama gelada.
- Preparação de fatia aguda
- Anestesia profundamente um mouse, colocando-o em uma redoma de vidro pré-carregada com 2-3 mL isoflurano. Verificar se há reflexo pitada de dedo do pé e se não-responsivos, decapitá-lo usando um par de tesouras afiadas ou guilhotina como seu protocolo animal exige rapidamente.
- Faça uma incisão de 2-3 cm, usando tesouras da porção caudal do crânio para cortar o couro cabeludo ao longo da linha mediana. Enquanto manualmente retraindo o couro cabeludo, fazer duas 1cm horizontal incisões do foramen magnum ao longo dos lados do crânio. Em seguida, usando tesouras bem, corte uma incisão do comprimento do crânio, ao longo da linha mediana da parte posterior do crânio ao nariz.
- Usando a pinça bem inserida perto da linha mediana, retraia o incisão no crânio em duas partes. Extrair o cérebro de rato do crânio e usar uma lâmina para remover o cerebelo e os bulbos olfatórios, respectivamente localizadas na porção caudal e rostral do cérebro. Estes podem ser identificados por grandes fissuras, que separação-las do córtex.
- Monte o bloco de cérebro a bandeja vibratome com super cola. Encha a bandeja vibratome com solução de corte fria como o gelo.
- Seções de tecido sobre o plano coronal em 300 µm de espessura de corte. Geralmente podem ser coletadas 6 fatias hippocampal coronais.
- Depois de cada seção é cortada, transferir imediatamente as fatias para a fatia segurando copo aquecido para 32-34° C. Manter as seções nesta temperatura durante 20 minutos antes de retirar o béquer contendo as seções e coloque isto em temperatura ambiente pelo menos 20-30 minutos antes da gravação.
4. medida da dinâmica evocado eletricamente K+
- Configurando a preparação de fatia
- Delicadamente, coloque a fatia do cérebro na banheira com uma pipeta Pasteur e suavemente, segure-o no lugar com uma harpa de platina com cordas de nylon.
- Certifique-se as pontas do eletrodo bipolar estimulante são paralelas um ao outro e estão nivelados com o avião da fatia. Lentamente, ao longo de 6-7 segundos, inserir os eletrodos CA3 stratum radiatum aproximadamente 40-50 µm fundo para estimular colaterais de Schaffer. Em secções coronais, CA3 pode ser aproximadamente identificada como parte da lateral adequada para a camada de células grânulo no genu hippocampal, hipocampo com o estrato radiatum caindo ventral e medial à camada de célula piramidal.
- Insira cuidadosamente o K+-elétrodo seletivo em CA1 stratum radiatum aproximadamente 50 µm profunda, diminuindo lentamente o eletrodo durante aproximadamente 3-4 segundos. Permitir que o potencial estabilizar através do eletrodo antes de aplicar estímulos para a fatia: isto geralmente leva de 5 a 10 minutos. Se a fatia exibe espontânea mudanças no extracelular K+ então descartar e repita este processo com uma nova fatia.
- Medida evocados lançamento K+
- Aplica os comboios de estimulação elétrica (8 pulsos) manualmente pressionando o gatilho sobre o estimulador durante a gravação digital de respostas. Aplica a estimulação em 10 Hz e 1 ms largura de pulso, começando na amplitude de estímulo 10 µA.
- Aplique amplitudes de estimulação crescente por um fator de 2 até uma amplitude máxima de resposta K+ é detectada. Se você não vê qualquer resposta, mover a posição do eletrodo K+ mais perto para o local de estimulação em 100 µm em incrementos
- Determine a amplitude do estímulo que produz a meia resposta máxima. Em nossa experiência, isto é entre 40-160 µA, dependendo da qualidade da preparação, idade do animal e a distância entre os eléctrodos de estimulação e elétrodo seletivo do K+ .
- Na mesma fatia, usando uma amplitude do estímulo em um passo mais baixo do que a amplitude que produz a resposta máxima metade (por exemplo, se 80 µA produz uma resposta de metade-máximo, use 40 µA) aplicam-se os comboios de estímulo de aumentar o número de pulsos. Inicialmente, nós usamos os trens de pulsos de 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128.
- Para confirmar que K+ sinais são mediados por fuzilamento de potencial de ação do banho de colaterais de Schaffer estimulado eletricamente, aplique 0,5 µM TTX em ACSF por 10 minutos e repita o protocolo de estimulação. Nenhuma resposta evocada deve ser observada.
- Depois de terminar o experimento de fatia, confirmar o eletrodo tem mantido sua responsivity pela re-calibrar o eletrodo nas soluções de calibração e garantir a resposta não desviou-se por mais de 10% da calibração inicial
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Representative Results
Para a medição selectiva de extracelular K+, preparamos íon-seletivo microeletrodos revestidos com uma camada hidrofóbica através de silanização de pipetas de vidro de borosilicato limpo (figura 1A). Este revestimento permite que o ionóforo K+ contendo valinomicina para descansar na ponta do eletrodo e permitir apenas K+ fluxo através de uma abertura estreita na ponta do eletrodo (figura 1B). Depois de aprontar os eléctrodos com a solução salina backfilled e o ionóforo K+ , os eletrodos podem ser testados para sua resposta rápida e linear a gradual alterações nas concentrações de K+ de banho (Figura 3A) e sua resposta a banho K+ muda ao longo do intervalo de calibração (Figura 3B), em soro fisiológico ou ACSF na forma prevista pela equação de Nernst2. A mudança no estado estacionário potencial pode ser plotada contra o banho K+ concentração para determinar a inclinação da linha, que será aproximadamente 58,2 mV por log [K+], de acordo com a equação de Nernst e nada menos que 52 mV por log [K+] (Figura 3). Além disso testamos a capacidade de resposta dos eletrodos seletivos K+ e encontrado que responderam a uma mudança de 5,5 mM de K+ com constantes de tempo de ascensão e decadência do ms aproximadamente 85 (Figura 3D,E).
O equipamento de gravação eletrofisiológicas consiste de um microscópio vertical padrão conectado a uma tela de LCD para identificar o posicionamento do estimular e eletrodos de gravação. Sem óptica especial são necessários para a colocação visual do K+ e eletrodos de estimulação; Nós usamos um x 5 ou 10 x da lente objetiva e luz branca de uma lâmpada de halogéneo, mas um LED branco poderia ser usado em vez disso. O estimulante eletrodo é conectado à saída de um isolador de estímulo, o que proporciona despolarizantes atual através a entrega programada de pulsos de um estimulador ou outro tal dispositivo de sincronismo. Em outras palavras, o estimulador oferece trens de 2 V, 10-20 Hz pulsos de sincronismo para o isolador de estímulo. Ao receber estes impulsos, o isolador de estímulo, em seguida, envia a corrente desejada para os eletrodos de estimulação. O eletrodo de gravação está ligado a um eléctrodo, conectado a um headstage, amplificador e placa A/D, que interface a um PC com software de gravação eletrofisiológicas (Figura 4A). Depois que o eletrodo foi calibrado com êxito e as fatias agudas foram preparadas, a fatia pode ser colocada no perfusato ACSF. Para estimular os colaterais de Schaffer, o K+-elétrodo seletivo é colocado dentro do CA1 stratum radiatum e o eletrodo de estimulação de campo é colocado dentro do CA3 (Figura 4B).
Uma vez que foram colocados os eléctrodos e a gravação de K+ atingiu uma linha de base estável, então pulsos de crescente amplitude atual podem ser aplicados para a fatia (Figura 5, topo). A forma de onda desta atividade aparece como um rápido aumento de K+ , com uma taxa de decaimento exponencial, que é abolida com aplicação de TTX (Figura 5, inferior).
Figura 1 : Diagrama da reação de silanização e arquitetura de microeletrodos seletiva K+ de . R. representação esquemática da reação de silanização que ocorre entre os grupos hidroxila polares expostos do vidro borosilicato e o reagente de silanização diclorodimetilsilano (DDS). Esta reação processa a superfície do vidro hidrofóbico, que permite que o ionóforo K+ formar uma fina membrana. B. diagrama de microeletrodos de seletiva o K+ . O eletrodo é backfilled com solução salina e a solução seletiva K+ é o lugar em uma camada de 1-2 mm de espessura na ponta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Diagrama de extração DDS. Representação esquemática do processo de substituição de nitrogênio para extração de DDS de um contêiner. DDS é volátil e inflamável e pode reagir violentamente com gases atmosféricos quando é em altas concentrações, portanto, é necessário substituir o DDS removido com gás inerte nitrogênio. Um balão cheio de nitrogênio está ligado a uma agulha através de uma seringa ou tubos apropriados. Esta agulha é inserida através do vedador do recipiente, permitindo o fluxo de gás (N2) nitrogênio dentro do recipiente. Separadamente, uma agulha longa (3-10 cm) é conectada a uma seringa de 1 mL e inserida no recipiente. Esta seringa é usada para extrair o DDS, enquanto apenas o gás nitrogênio pode entrar no recipiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Calibração de microeletrodos. R. aplicação de perfusão de banho de diferentes concentrações de K+ em solução salina pode rapidamente e reversivelmente produzir mudanças Nernstian no potencial do outro lado da ponta do eletrodo. B. aplicação gradual de K+ em ACSF evoca uma característica e estável mudança no potencial de eletrodo de ponta. C. trama da mudança mV do eletrodo seletivo K+ em resposta a concentrações crescentes de K+ em quatro eletrodos; o R2 é 0.9995 para estes quatro eletrodos. M. Perfusão rápida aplicação banho sistema de 10 mM K+ causa uma resposta passo na tensão do outro lado da ponta do eletrodo seletivo K+ . E. parcela da resposta medida vezes (tau em ms); Não há diferença entre tempo de ascensão e decadência foi detectada (quer dizer SEM ±, p = 0.939, duas amostra t-teste). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Aparelho para medição de K+ extracelular. R. o equipamento de eletrofisiologia consiste de um microscópio fixado a uma tabela de antivibração com uma câmera anexada e display LCD para visualização de fatia. O eletrodo de K+ é fixa para um headstage, amplificador e analógico para digital placa que gera o sinal de um PC conectado com o software de gravação eletrofisiológicas. Os eletrodos de estimulação elétrica são conectados a um isolador de estímulo que varia a amplitude de estimulação e um estimulador para a entrega de estímulo de sincronismo. B. diagrama de preparação a fatia e o local da colocação de vários eletrodos na fatia. CA3 pode ser aproximadamente identificada como parte da lateral adequada para a camada de células grânulo no genu hippocampal, hipocampo com o estrato radiatum caindo rostral à camada de célula piramidal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Medição de evocado eletricamente lançamento K+ . Traços representativos de K+ Liberte-se do eletrodo gravação em condições basais (topo) e sua perda mediante a aplicação de tetrodotoxina (0,25 µM) por 5 minutos antes da gravação (parte inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método que descrevemos aqui nos permitiu avaliar a dinâmica de K+ , em resposta à estimulação elétrica de colaterais de Schaffer em fatias hippocampal agudas de ratos adultos. Nosso método de preparação K+ microeletrodos seletiva de íons é semelhante a procedimentos anteriormente descritos12,13,14,15. No entanto, este método tem vantagens sobre configurações de eletrodo alternativo que é rápida e descomplicada para preparar microeletrodos seletivos K+ . Após a calibração adequada, esses eletrodos foram encontrados para medir robustamente K+ dinâmica em fatias durante a estimulação elétrica, e tais respostas foram bloqueadas por TTX. Nesses experimentos, foram utilizadas estimulações de 80-160 uA a 10 Hz; no entanto, a otimização das condições de estimulação para uma experiência particular e para uma área do cérebro de interesse será necessária. Esses valores são listados como um guia.
A inclinação da resposta dos eléctrodos deve ser 58,2 mV por log [K+]. Esse valor é previsto a partir das equações de Nernst e Nicolsky-Eisenman por uma membrana semi-permeável seletiva de K+ ; o último melhor representa interações entre íons16. Se o eletrodo não responde da forma prevista, pode ser para um dos dois motivos principais. Primeiro a silanização pode ser inadequada, fazendo com que a membrana ser perdidos ou sal pontes ao formulário. Confirme que a membrana está intacta pela observação através do microscópio, deve haver uma interface clara entre a solução da pipeta e a membrana. Outro motivo, pode ser a presença de bolhas em pipeta que impedem o fluxo de corrente do fio de cloreto de prata. Se observam-se bolhas, depois retire a pipeta e sacudir vigorosamente para removê-los. Se essas soluções não, re-fazer o outro elétrodo seletivo do K+ ou repetir silanização para mais, ou em temperaturas mais altas. No entanto, é importante repetir esses controles chaves cada vez que uma nova região do cérebro é estudada ou um novo microeletrodos é testado.
Dois amplificadores específicos foram utilizados nesses experimentos, mas outros amplificadores podem ser usados, desde que a impedância de entrada é maior ou igual a 500 MΩ. Tendo calibrado os eléctrodos com 500 MΩ e 5 impedâncias de entrada GΩ, achamos que não houve diferença na inclinação da resposta tensão com qualquer configuração ao longo de um intervalo de K+ concentrações (56,9 ± 0,7 e 56,5 ± 0,9 mV por dez vezes de mudança em [K+ < / C1 >] para 500 MΩ e 5 GΩ de entrada impedâncias, respectivamente; P = 0.759, emparelhado t-teste, n = 4 eletrodos).
Também usamos switches de solução rápida para estimar o tempo de resposta dos eletrodos para um salto conhecido no [K+] de 4,5 a 10 mM (Figura 3D). Os eletrodos responderam com tempos de ascensão e decadência (tau) de 85 ± 12 e 85 ± 15 ms, respectivamente. Em relação a isto, a cinética de troca de solução para nosso alternador de solução rápida personalizada foi 85 ± 27 ms. portanto, os eletrodos seletivos K+ respondem com cinética tão rápido como o alternador de solução que foi utilizada e muito mais rapidamente do que a dinâmica de K+ em o meio extracelular, como resultado da estimulação de colaterais de Schaffer (Figura 5). Estes dados sugerem que os eletrodos seletivos K+ podem ser usados para estimar a cinética de acumulação de K+ e desminagem no tecido cerebral. No entanto, em um futuro trabalho controlos adequados e calibrações serão necessário em uma base caso-a-caso. Sugerimos que é valioso para gastar tempo para entender a cinética de troca de solução em sua câmara de gravação.
Encontramos três criticamente importantes fatores que influenciam a qualidade e robustez das medições K+ em fatias. O primeiro é a qualidade da preparação, o tecido saúde e idade dos animais utilizados parecem ser relevantes. Para este estudo, nós usamos camundongos C57/Bl6N que são ~ 12 semanas de idade. Em raras ocasiões, encontramos as fatias com flutuações de K+ espontâneas no montante de ~0.1 mM e duração de 5 a 10 segundos; Estes cortes foram descartados. O segundo é a qualidade de microeletrodos a gravação. O principal problema é o tempo e a temperatura que é usada para silanização do capilar de vidro puxado. Recomendamos > 170 ° C durante pelo menos 6 horas (até durante a noite é aceitável) ou a 200 ° C durante 30 minutos. Aquecimento insuficiente dos eletrodos com o reagente de silanização pode levar a eletrodos que não mantêm um estado estacionário potencial por causa de uma perda gradual do ionóforo K+ . Além disso, ao preparar os eléctrodos, recomendamos a colocação de uma camada fina (1-2 mm) do ionóforo K+ na ponta com um diâmetro de 10-20 µm, ou seja, em aproximadamente o tamanho de um corpo celular médio (figura 1B). Não quebre a ponta excessivamente ampla, ou a membrana seletiva K+ vai perder a integridade e o eletrodo irá falhar. Este passo pode requerer alguma prática para obter dicas do tamanho correto. Eletrodos seletivos K+ , com uma ponta muito fina ou muito grossa de uma camada podem ter respostas lentas, em comparação com eletrodos construídos adequadamente. O terceiro fator é a distância entre os eletrodos de estimulação e o elétrodo seletivo do K+ . Nós ter usado a uma distância de inter eletroda de aproximadamente 500 µm, no entanto a distância ideal pode variar consideravelmente com a área do cérebro individual e terá de ser cuidadosamente considerados para o experimento particular à mão.
Além da configuração de cano único, atualmente existem vários métodos para fazer K+-17formatos de microeletrodos seletivos em bipolar e concêntricos. Em comparação com as descrições publicadas desses métodos, eletrodos de único canal tem duas desvantagens principais: 1) um diâmetro de ponta ligeiramente maior (~ 10 vs 4 µm), o que poderia causar a rotura maior do espaço extracelular comparted bipolar e concêntricos eletrodos e 2) incompatibilidade com medição simultânea de várias espécies de íons como os eletrodos bipolares. No entanto, os eletrodos de canal único oferecem várias vantagens. Especificamente, esses eletrodos podem ser fabricados em menos de cinco minutos e, portanto, são mais descartáveis e pode ser feita e calibrada rapidamente antes de experimentos. Portanto, o risco de quebra de eletrodo durante as experiências de curso é menos uma preocupação. Além disso, o eléctrodo de terra e eletrodo gravação são fisicamente separados pelo volume do banho, lá é nenhuma chance para a formação de pontes de sal na ponta do eletrodo, que pode levar ao fracasso do eletrodo concêntrico e bipolar eléctrodos. O tempo de resposta dos eléctrodos de canal único é mais rápido do que eletrodos bipolares e prováveis eletrodos comparáveis ao concêntrico (~ 20 ms), embora nosso sistema de perfusão rápida permitida apenas uma medição de tempos de resposta da ordem de 80 ms (Figura 3E ). Além disso, esses eletrodos oferecem menor ruído em comparação com eletrodos bipolares, que possuem maior resistência de ponta e exigem o uso de amplificadores com maior resistência de entrada. Por último, estes eletrodos não requer o uso de um micromanipulador especializado ou headstage requeridos para eletrodos concêntricos. Em suma, as vantagens da construção e facilidade de utilização dos eletrodos de canal único supera as desvantagens.
A abordagem que usamos aqui para medir K+ dinâmica em fatias pode ser usada em muitas regiões do cérebro para estudar Regulamento K+ . Embora este protocolo demonstra o uso de K+-eletrodos seletivos para as medições da dinâmica de íons potássio eletricamente evocado em tecidos do cérebro, este protocolo pode ser, em geral, usado em muitos tecidos diferentes onde é desejável medir a dinâmica K+ . Tais situações podem incluir dinâmica espontânea e mudanças em resposta a farmacológica, optogenetic, ou chemogenetic de ativação celular. Estes microeletrodos podem ser feitos com qualidade e confiabilidade suficientes a permitir a rápida integração desta técnica em qualquer caixa de ferramentas de laboratório. As análises detalhadas das concentrações de K+ na saúde e Estados doentes permitirá mais deteção e quantificação de como vários componentes moleculares e celulares contribuem para descanso K+ concentrações no cérebro3, 18,19.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O laboratório de Khakh foi apoiado pelo NIH MH104069. O laboratório Mody foi apoiado pelo NIH NS030549. J.C.O. graças a Grant(NS058280) de formação do NIH T32 Neural microcircuitos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer. Sunderland, MA. 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M.
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
