Summary
Kalium joner bidrar till vila membranet potential celler och extracellulära K+ koncentration är en viktig regulator av cellulära retbarhet. Vi beskriver hur man gör, kalibrera och använda monopolär K+-selektiv mikroelektroder. Med sådana elektroder kan mätning av elektriskt evoked K+ koncentration dynamics i vuxen Hippocampus skivor.
Abstract
Kalium joner bidra avsevärt till att vila membranet potential celler och extracellulära K+ koncentration är därför en avgörande regulator av cell retbarhet. Förändrad koncentrationer av extracellulära K+ påverkar vilande membranet potential och cellulära retbarhet av skiftande jämvikter mellan sluten, öppen och inaktiverade stater för spänningsberoende jonkanaler som ligger bakom aktionspotential initiering och överledning. Därför är det värdefullt att direkt mäta extracellulära K+ dynamik i hälsa och sjuka stater. Här beskriver vi hur man gör, kalibrera och använda monopolär K+-selektiv mikroelektroder. Vi distribuerade dem i vuxna Hippocampus hjärnan skivor att mäta elektriskt evoked K+ koncentration dynamics. Förnuftig användning av sådana elektroder är en viktig del av den verktygslåda som behövs för att utvärdera cellulära och biofysiska mekanismer som styr extracellulära K+ koncentrationer i nervsystemet.
Introduction
Kalium jonkoncentrationer är hårt reglerad i hjärnan, och deras variationer ett kraftfullt inflytande på vilande membranet potential av alla celler. Mot bakgrund av dessa kritiska bidrag är ett viktigt mål av biologi att bestämma de cellulära och biofysiska mekanismer som används för att ordentligt reglera koncentrationen av K+ i det extracellulära utrymmet i olika organ i kroppen1 , 2. ett viktigt krav i dessa studier är förmågan att mäta K+ koncentrationer exakt. Även om många delar som bidrar till kalium homeostas i hjärnan i friska och sjuka har varit identifierade3,4,5, har ytterligare framsteg minskat på grund av specialiserade förbereder ion selektiv mikroelektroder kalium mätning. Mikroelektrod sensorer representerar den gyllene standarden för att mäta K+ koncentrationer i vitro, i vävnad skivor och in vivo.
Nyare metoder för K+ övervakning är under utveckling med optiska sensorer, men dessa inte upptäcka en biologiskt relevant utbud av K+ koncentrationer eller har inte fullt prövats i biologiska system, även om de första resultaten visas lovande6,7,8. Jämfört med optiska sensorer, är mikroelektroder fundamentalt begränsat till en punktkälla mätning av joner, även om elektroden matriser kan förbättra den rumsliga upplösning9. Denna artikel fokuserar på singel-barreled mikroelektrod sensorer för övervakning av K+ dynamics.
I detta arbete, Vi rapporterar detaljerad stegvis förfaranden för att göra K+ selektiv mikroelektroder, använder en valinomycin-baserade kalium jonofor som tillåter mycket selektiv (104 faldigt K+ till Na+ selektivitet) K+ rörelse över membran10. En naturligt förekommande polypeptid, valinomycin fungerar som en K+ genomsläpplig por och underlättar flödet av K+ ner det är elektrokemiska gradient. Vi beskriver också hur du kalibrerar elektroderna, lagra och använda dem och slutligen hur du distribuerar dem för att mäta K+ koncentration dynamics i akut Hippocampus hjärnan skivor från vuxna möss. Användningen av sådana elektroder tillsammans med genetiskt modifierade möss som saknar specifika jonkanaler föreslog att reglera extracellulära K+ dynamics bör avslöja de cellulära mekanismer som används av nervsystemet för att styra omgivande koncentrationen av K + i den extracellulära miljön.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök har utförts i enlighet med nationella institutet för hälsa guiden för skötsel och användning av laboratoriedjur och godkändes av kanslerns djur forskningsutskottet vid University of California, Los Angeles. Alla möss var inrymt med mat och vatten tillgängliga ad libitum i 12 h ljus-mörk miljö. Alla djur var friska med inga uppenbara beteendeförändringar, var inte inblandade i tidigare studier och offrades under lätta cykeln. Data för experiment samlades in från vuxna möss (6-8 veckor gammal för alla experiment).
1. beredning av K+ selektiv mikroelektroder
- Silanisering av borosilikatglas
- Ta bort tillräckligt glas kapillärer ur förpackningen och placera i en 50 mL konisk tub. Fyll koniska tube till toppen med 1 M HCl. Tvätta elektroder med mild agitation i HCl över natten eller i minst 6 timmar.
- Kort skölj kapillärer med 70% etanol och sedan torka helt på 100-120 ° C 6-8 timmar. Lagra tvättade kapillärer i behållare med vattenfri kalciumsulfat torkmedel för upp till 4 veckor före ytterligare användning.
- Innan silanisering, dra kapillärer till en fin spets med hjälp av mikroelektrod avdragare. De mikroelektroder som vi använder är cirka 2-5 mikrometer i diameter. Hantera alltid tvättade kapillärer med handskar, eftersom oljor från huden kan störa silanisering.
- Placera mikroelektroder i en glasbehållare så att elektroderna är förhöjda från botten för att förhindra tip brott. Fixa mikroelektroder till behållaren med autoklaverbart tejp eller liknande tejp.
- Ta bort cirka 0,5 mL 5% dichlorodimethylsilane (DDS) silanisering lösning från dess behållare med kväve ersätter metoden (se figur 2). Fylla en ballong med kvävgas och bifoga en spruta eller tube och nål till ballongen. Stick in nålen i behållaren DDS medan du ritar upp DDS i en separat spruta via en längre nål.
- Applicera lösningen silanisering droppvis till tips på pipetterna och omedelbart täcka. Placera behållaren håller mikroelektroder med silanisering lösning in en pre värmde (170-180 ° C) laboratorium ugnen i 10-12 timmar eller vid 200-220 ° C i 30 minuter
- Efter inkubering, Stäng av ugnen och sedan avlägsna plattan från ugnen. Var försiktig när du tar bort plattan ur ruvmaskinen, eftersom det är extremt varmt. Placera plattan på en bänk vid rumstemperatur i 10-15 minuter så att den glasvaror svalna.
- Ta bort mikroelektroder från plattan (med ett rakblad eller skalpell bladet för att klippa bandet) och placera dem i ett torkmedel fyllda lufttät behållare. Silaniserad mikroelektroder hålls fria från fukt kan användas i upp till 1 vecka efter silanisering.
- Grundning elektroderna
- Förbereda en stamlösning av K+ jonofor cocktail: 5% w/v valinomycin, 93% v/v 1,2-dimetyl-3-nitrobensen, 2% w/v kalium tetrakis(4-chlorophenyl) Borat11. Denna lösning är en svag gul färg. Förvara i en lufttät, ogenomskinliga behållare i rumstemperatur. Om denna lösning kan pågå flera månader lagras på lämpligt sätt.
- Förbereda en stamlösning av 10 mM HEPES buffrade 300 mM NaCl vid pH 7,4. Fixa elektroden till en klämma och återfyllning med den buffrad NaCl med ett 28G microfil tips ansluten till en spruta. Observera att saltlösning har nått slutet av mikroelektrod spetsen. Bekräfta att mikroelektrod är fri från stora bubblor som kan störa flödet av ström.
- Bryta spetsen av elektroden till cirka 10-20 µm breda, med den trubbiga sidan av en skalpell eller rakblad.
- Använd en mikropipett Applicera en liten droppe (~0.1 µl) av den K+ jonofor nära spetsen av mikroelektrod. Om elektroden har varit ordentligt silaniserad droplet-programmet kommer att absorberas i bruten spets. Fyll elektroden till 1-2 mm med K+ jonofor och ta bort överflödig använda mjukpapper.
2. kalibrering av K+ selektiv mikroelektroder
- Beredning av kalibreringslösningar
- Bereda lösningar av olika koncentrationer av KCl i lika osmolaritet konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) genom att ersätta NaCl med KCl. Vi använde 0,1, 1, 4.5, 10 och 100 mM K+ ACSF, för kalibrering av elektroderna. Recept på dessa kalibreringslösningar listas i tabell 1.
| Kemiska | MW | slutliga mM | 0,1 mM [K +] | 1 mM [K +] | 4.5 mM [K +] | 10 mM [K +] | 100 mM [K +] |
| (g / mol) | |||||||
| NaCl | 58.44 | varierar | 1.51 g | 1.50 g | 1,44 g | 1.4 g | 0.345 g |
| KCl | 1 M lager | varierar | 20 µl | 200 µl | 900 µl | 2 ml | 20 ml |
| CaCl2 | 1 M lager | 2 | 400 µl | ||||
| MgCl2 | 1 M lager | 1 | 200 µl | ||||
| NaH2PO4 | 119.98 | 1.2 | 0,29 g | ||||
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 0.437 g | ||||
| D-glukos | 180.16 | 10 | 0.360 g | ||||
| Vatten | QS 200 ml | ||||||
Tabell 1. Kalium kalibreringslösningar
- Mikroelektrod kalibrering
- Bubbla alla lösningar med 95% O2/5% CO2 i minst 20 minuter innan du börjar experimentet. Påbörja startas badet med 4,5 mM [K+] ACSF med en hastighet av 3 mL per minut. Placera den K+ selektiv elektroden i elektrodhållare bifogas den elektrod headstage på manipulatorn. Denna headstage är ansluten till en lämplig förstärkare. Sätt spetsen på elektroden i den bad perfusatet.
- Säkerställa Ag/Granulatfyllda marken elektroden badar i samma lösning och att flödet är stadig. Tillämpa kalibreringslösningar i en stegvis sätt och registrera de potentiella förändringarna i mV över den elektrod spetsen. Vänta på elektroden spetsen potential att nå ett stabilt värde innan du byter till nästa lösning
- Mäta steady-state spänning i svar på ansökan av kalibreringslösningar till elektroden spetsen. Bekräfta att lutningen på elektroden svaret är minst 52 och större än 58 mV per log förändring [K+].
3. beredning av akut Hippocampus hjärnan skivor
- Beredning av slice lösningar
- Förbereda 500 mL sackaros skärning lösning består av: 194 mM sackaros, 30 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM D-glukos, 1 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, och 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, mättad med 95% O2 och 5% CO2.
- Förbereda 1-2 liter inspelning lösning (ACSF) består av: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glukos, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4och 26 mM NaHCO3; pH 7,3-7,4 (efter bubblande), 290-300 mOsm, mättad med 95% O2 och 5% CO2. Fyll en bägare som innehåller en hjärna slice innehavaren kammare med inspelning lösning och hålla den på 32-34 ° C. Fyll vibratome kammaren med isvatten slush.
- Akut slice förberedelse
- Djupt söva en mus genom att placera det i en glaskupa förladdade med 2-3 mL isofluran. Kontrollera för tå nypa reflex, och om icke-lyhörd, snabbt halshugga den med ett par vassa saxar eller giljotinen som ditt djur protokollet kräver.
- Gör en 2-3 cm snitt med sax från kaudala delen av skallen för att skära hårbotten längs mittlinjen. Samtidigt manuellt infällbara hårbotten, se två 1 cm horisontella snitt från foramen magnum längs sidorna av skallen. Sedan använda fina saxar, skära ett snitt längden på skallen, längs mittlinjen från baksidan av skallen till näsan.
- Med fin pincett införas nära mittlinjen, återkalla anskäras skallen i två delar. Extrahera mus hjärnan från skallen och Använd ett blad att ta bort lillhjärnan och luktsinnet lökar, som finns respektive på den kaudala och rostralt delen av hjärnan. Dessa kan identifieras genom de stora sprickor, vilket skiljer dem från cortex.
- Montera hjärnan blocket på vibratome facket använder superlim. Fyll i vibratome facket med iskall skärande lösningen.
- Skär vävnadssnitt på koronalt planet på 300 µm tjocklek. Oftast kan 6 koronalt Hippocampus skivor samlas.
- Efter varje avsnitt är skuren, omedelbart överföra skivor till segmentet holding bägare värms till 32-34° C. Hålla avsnitten vid denna temperatur i 20 min innan du tar bort bägaren som innehåller avsnitten och placera det i rumstemperatur i minst 20-30 minuter före inspelning.
4. mätning av elektriskt Evoked K+ Dynamics
- Ställa in skiva beredning
- Placera försiktigt hjärnan segmentet i badet med en Pasteur-pipett och försiktigt hålla den på plats med en platina harpa med nylon strängar.
- Säkerställa tips av bipolär stimulerande elektrod är parallella med varandra och är i nivå med ett plan av segmentet. Långsamt, under loppet av 6-7 sekunder, in elektroderna CA3 stratum radiatum cirka 40-50 µm djupa för att stimulera Schaffer säkerheter. Koronalt avsnitt kan CA3 cirka identifieras som portion av den hippocampus korrekta lateralen till granule cellen skikt på den Hippocampus genu, med de stratum radiatum faller mediala och ventrala till den pyramidala cellager.
- Sätt försiktigt på K+-selektiv elektrod i CA1 stratum radiatum cirka 50 µm djupa, genom att långsamt sänka elektroden över ca 3-4 sekunder. Tillåta potential att stabilisera hela elektroden innan du tillämpar stimuli i segmentet: Detta tar vanligtvis 5-10 minuter. Om segmentet uppvisar spontana förändringar i extracellulära K+ sedan kassera och upprepa den här processen med en ny skiva.
- Mäta evoked K+ release
- Tillämpa tåg av elektrisk stimulering (8 pulser) genom manuellt trycka avtryckaren på stimulatorn medan du spelar digitalt in svaren. Tillämpa stimulering vid 10 Hz och 1 ms pulsbredd, börjar vid 10 μA stimulans amplitud.
- Gäller ökad stimulering amplituder av en faktor 2 tills en maximal amplitud K+ svar detekteras. Om du inte ser något svar, flytta upp positionen för K+ elektroden närmare till webbplatsen stimulering i 100 µm i steg om
- Bestämma stimulans amplituden som producerar den halva maximalt svaren. Vår erfarenhet är detta mellan 40-160 µA, beroende på den förberedelse kvalitet, ålder på djuret, och avståndet mellan stimulering elektroder och K+ selektiv elektrod.
- I samma segment, använder en stimulus amplitud vid ett steg lägre än amplituden som producerar den halva maximalt svaren (t.ex. om 80 µA producerar en halv maximal svar, använder 40 µA) Applicera stimulans tåg av ökande antal pulser. Inledningsvis har vi använt tåg av 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 och 128 pulser.
- För att bekräfta att K+ -signaler förmedlas av aktionspotential bränning av elektriskt stimulerad Schaffer säkerheter badet, tillämpa 0,5 µM TTX i ACSF i 10 minuter och upprepa protokollet stimulering. Inga framkallat svar bör observeras.
- Efter avslutad skiva experimentet, bekräfta elektroden har behållit sin responsivity av nytt kalibrera elektroden i kalibreringslösningarna och säkerställa svaret har inte avvikit mer än 10% från första kalibreringen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För selektiv mätning av extracellulära K+beredda vi jonselektiva mikroelektroder överdragen med ett vattenavvisande skikt genom silanisering av ren borosilikatglas pipetter (figur 1A). Denna beläggning kan den K+ jonofor som innehåller valinomycin för att vila på spetsen av elektroden och tillåta endast K+ flöde genom en smal öppning på elektroden spetsen (figur 1B). Efter grundning elektroderna med återfyllt saltlösning och den K+ jonofor, kan elektroderna testas för deras snabba och linjära svar på stegvis förändringar i Bad K+ koncentrationer (figur 3A) och för deras svar på Bad K+ ändrar över kalibreringslösningarna (figur 3B) i saltlösning eller ACSF på ett sätt förutspått av Nernst ekvation2. Förändringen i steady state potentiella kan plottas mot badet K+ koncentration för att bestämma lutningen på linjen, vilket bör ca 58,2 mV per log [K+], enligt Nernst ekvation och inte mindre än 52 mV per log [K+] (figur 3 c). Vi har dessutom testade lyhördheten för K+ selektiv elektroderna och fann att de svarat på en 5.5 mM förändring i K+ med upphov och förfall tidskonstanter cirka 85 MS (räkna 3D,E).
Elektrofysiologiska inspelning riggen består av ett standard upprätt Mikroskop ansluten till en LCD-display för att identifiera placeringen av de stimulerande och inspelning elektroder. Ingen speciell optik behövs för visuell utsläppande av K+ och stimulering elektroder; Vi använder en 5 x eller 10 x objektiv och vitt ljus från en halogenlampa, men en vit lysdiod skulle kunna användas i stället. Stimulerande elektroden är ansluten till utgång av en stimulus isolator, som levererar depolariserande nuvarande via tidsinställda leverans av pulser från en stimulator eller andra sådana tidtagningsanordning. Med andra ord, levererar stimulatorn tåg 2 V, 10-20 Hz timing pulser till stimulans Frånkopplingsdonet. Vid mottagandet av dessa pulser, levererar stimulans Frånkopplingsdonet sedan den önska nuvarande stimulering elektroderna. Inspelning elektroden är ansluten till en elektrodhållare, ansluten till en headstage, förstärkare och A/D styrelse, som gränssnitt till en PC med elektrofysiologiska inspelningsprogram (figur 4A). När elektroden har kalibrerats framgångsrikt och akut skivor har upprättats, kan slice placeras i den ACSF perfusatet. Att stimulera de Schaffer säkerheter, K+-selektiv elektrod placeras inom den CA1 stratum radiatum och fält stimulering elektroden placeras inom CA3 (figur 4B).
När elektroderna har placerats och K+ inspelningen har nått en stabil baslinje, sedan pulser av ökande nuvarande amplitud kan tillämpas på segmentet (figur 5, överst). Vågformen i denna aktivitet visas som en snabb ökning av K+ med en exponentiell decay rate, som avskaffas med TTX ansökan (figur 5, botten).
Figur 1 : Diagram för silanisering reaktion och K+ selektiv mikroelektrod arkitektur. A. Schematisk framställning av silanisering reaktion som uppstår mellan de exponerade polära hydroxylgrupperna av Borsilicat glas och silanisering reagens dichlorodimethylsilane (DDS). Denna reaktion återger ytan av glaset hydrofoba, som tillåter den K+ jonofor att bilda ett tunt membran. B. Diagram över den K+ selektiv mikroelektrod. Elektroden är återfyllt med saltlösning och K+ selektiv lösningen är platsen i ett 1-2 mm tjockt lager på spetsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Diagram över DDS utvinning. Schematisk bild av kväve ersättningsförfarandet för DDS extraktion från en behållare. DDS är flyktig och brandfarlig och kan reagera våldsamt med atmosfäriska gaser när det är i höga koncentrationer därför det är nödvändigt att ersätta DDS bort med inert kvävgas. En ballong fylld med kväve är ansluten till en nål via en spruta eller lämpliga slangen. Denna nål förs in genom tätningsmedlet på behållaren så att kväve gas (N2) flöde in i behållaren. Separat, är en lång (3-10 cm) nål ansluten till en 1 mL spruta och infogas i behållaren. Denna spruta används för att extrahera DDS, medan bara kvävgas kan ange behållaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Kalibrering av mikroelektroder. A. bad perfusion tillämpningen av olika K+ koncentrationer i saltlösning kan snabbt och reversibelt producera Nernstian förändringar i potential över den elektrod spetsen. B. stegvis tillämpning av K+ i ACSF frammanar en karakteristisk och stabil förändring av elektroden tip potential. C. tomt på mV ändringen av K+ selektiv elektrod som svar på ökande koncentrationer av K+ i fyra elektroder; R2 är 0.9995 för dessa fyra elektroder. D. Snabb perfusion bad systemanvändning 10 mM K+ orsakar en kliva svaret i spänning över K+ selektiv elektrod spetsen. E. tomt på den uppmätta Svaren tider (tau i ms); ingen skillnad mellan uppgång och förfalla tid upptäcktes (menar ± SEM, p = 0.939, två sample t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Apparater för extracellulära K+ mätning. A. elektrofysiologi riggen består av Mikroskop fast till en vibrationsdämpande tabell med en bifogad kamera och LCD-display för slice visualisering. K+ elektroden är fast en headstage, förstärkare och analog till digital styrelse som utgångar signalen till en ansluten PC med elektrofysiologiska inspelningsprogram. Elektrisk stimulering elektroderna är anslutna till en stimulans isolator som varierar stimulering amplituden och en stimulator för timing stimulans leverans. B. Diagram av slice preparatet och platsen för placeringen av olika elektroderna på skiva. CA3 kan identifieras ungefär som portion av den hippocampus korrekta lateralen till granule cellen skikt på den Hippocampus genu, med de stratum radiatum faller rostralt på pyramidal cell-lagret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Mätning av elektriskt evoked K+ release. Representativa spår av K+ släpper från inspelning elektroden under basala förhållanden (överst) och deras förlust vid tillämpningen av tetrodotoxin (0,25 µM) för 5 minuter före inspelning (nederst). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som vi beskriver här har tillåtit oss att bedöma K+ dynamics svar på elektrisk stimulering av Schaffer säkerheter i akut Hippocampus skivor från vuxna möss. Vår metod för att förbereda K+ ion selektiv mikroelektroder liknar tidigare beskrivna förfaranden12,13,14,15. Denna metod har dock fördelar över alternativa elektrod konfigurationer i att det är snabb och okomplicerad att förbereda K+ selektiv mikroelektroder. Efter lämplig kalibrering, dessa elektroder hittades att kraftfullt mäta K+ dynamics i skivor under elektrisk stimulering, och sådana Svaren blockerades av TTX. I dessa experiment användes stimuli för 80-160 uA vid 10 Hz; optimering av stimulering villkoren för en viss experiment och en hjärna intresseområde kommer dock krävas. Dessa värden anges som en guide.
Lutningen i svaret av elektroderna bör 58,2 mV per log [K+]. Sådant värde förutspås av Nernst och Nicolsky-Eisenman formler för en K+ selektiv halvgenomträngligt membran; den senare svarar bättre för interaktioner mellan joner16. Om elektroden inte svarar på sättet som förutspådde, kan detta vara av två huvudsakliga skäl. Först kan silanisering vara otillräckliga, orsakar membranet för att vara förlorad eller salt broar till formuläret. Bekräfta att membranet är intakt genom observation genom mikroskopet, bör det finnas ett tydligt gränssnitt mellan pipett lösningen och membranet. En annan anledning kan vara bubblor i pipetten som hindrar flödet av nuvarande från silverklorid tråd. Om bubblor observeras, ta sedan bort i pipetten och flick energiskt för att ta bort dem. Om lösningarna misslyckas, åter göra en annan K+ selektiv elektrod eller upprepa silanisering för längre eller vid högre temperaturer. Det är dock viktigt att upprepa dessa viktiga kontroller varje gång en ny hjärnregionen studeras eller en ny mikroelektrod testas.
Två specifika förstärkare användes i dessa experiment, men andra förstärkare kan användas så länge den ingång impedansen är större än eller lika med 500 MΩ. Med kalibrerade elektroderna med både 500 MΩ och 5 GΩ ingående impedanser, Vi hittade fanns ingen skillnad i sluttningen av spänning svaret med antingen inställning över en utbud av K+ koncentrationer (56,9 ± 0,7 och 56,5 ± 0,9 mV per tiofaldig förändring [K+ < / C1 >] för 500 MΩ och 5 GΩ ingång impedanser, respektive; P = 0.759, parat t-test, n = 4 elektroder).
Vi använde också snabb lösning växlar för att uppskatta svarstiden för elektroderna till en känd hopp i [K+] från 4,5 till 10 mM (figur 3D). Elektroderna svarade med upphov och förfall gånger (tau) 85 ± 12 och 85 ± 15 ms, respektive. I samband med detta svara lösningen exchange kinetiken för vår egen snabb lösning switcher var 85 ± 27 ms. därför K+ selektiv elektroderna med kinetics så fort den lösning kopplat vi anställt och långt snabbare än dynamiken i K+ i den extracellulära miljön till följd av Schaffer säkerheter stimulering (figur 5). Dessa data tyder på att K+ elektroder kan användas för att uppskatta kineticsen av K+ ackumulation och clearance i hjärnvävnad. Men i framtiden arbeta lämpliga kontroller och kalibreringar kommer att behövas på en fall-till-fall-basis. Vi föreslår att det är värdefullt att ägna tid att förstå den lösning exchange kineticsen i din inspelning kammare.
Vi hittade tre kritiskt viktiga faktorer som påverkar kvalitet och robusthet av K+ mätningar i skivor. Först är kvaliteten på förberedelserna, både vävnad hälsa och ålder på de djur som används verkar vara relevanta. För denna studie har vi använt C57/Bl6N möss som är ~ 12 veckor gamla. Vid sällsynta tillfällen hittade vi skivor med spontana K+ svängningar uppgående till ~0.1 mM och varar 5-10 sekunder; dessa skivor ignorerades. Andra är kvaliteten på den inspelning mikroelektrod. Den primära frågan är tid och temperatur som används för silanisering av dragna glaset kapillär. Vi rekommenderar > 170 ° C i minst 6 timmar (upp till övernattning är acceptabelt) eller vid 200 ° C i 30 minuter. Otillräcklig värmning av elektroderna med silanisering reagens kan leda till elektroder som inte upprätthåller en steady-state potentiella på grund av gradvis förlust av det K+ jonofor. Dessutom när du förbereder elektroderna, rekommenderar vi att placera ett tunt lager (1-2 mm) av de K+ jonofor i spetsen med en diameter av 10-20 µm dvs vid ungefär storleken av en genomsnittlig cellkroppen (figur 1B). Bryt inte överdrivet bred, spets eller K+ selektiv membranet kommer förlora integritet och elektroden misslyckas. Detta steg kan kräva lite övning att uppnå tips av rätt storlek. K+ elektroder med alltför fina spets eller för tjock i ett lager kan ha trög svaren, jämfört med korrekt konstruerade elektroder. Den tredje faktorn är avståndet mellan stimulering elektroden och K+ selektiv elektroden. Vi har använt en mellan elektrod avstånd av cirka 500 µm, men det optimala avståndet kan variera avsevärt med enskilda hjärnan området och behöver övervägas noga för viss experimentet till hands.
Utöver den enda fat konfigurationen, det finns för närvarande flera metoder för att göra K+-selektiv mikroelektroder i bipolär och koncentriska format17. Enda kanal elektroderna jämfört med publicerade beskrivningarna av dessa metoder, och har två huvudsakliga nackdelar: 1) en något större spets diameter (~ 10 vs 4 µm), vilket kan leda till större störning av den extracellulära comparted till bipolär och koncentriska elektroder, och 2) inkompatibilitet med samtidig mätning av flera ion arter som i de bipolära elektroderna. Men erbjuder enda kanal elektroderna flera fördelar. I synnerhet dessa elektroder kan fabriceras i mindre än fem minuter och är därför mer disponibla och kan göras och kalibrerat snabbt innan experiment. Risken för elektrod brott under kursen experimenten är därför mindre problem. Dessutom, eftersom den marken elektrod och inspelning elektrod är fysiskt åtskilda av volymen av badet, finns det ingen chans för bildandet av salt broar på spetsen av elektroden, vilket kan leda till elektroden i koncentriska och bipolär elektroderna. Svarstiden för enda kanal elektroderna är snabbare än bipolära elektroder och sannolikt jämförbar med koncentriska elektroder (~ 20 ms), även om vårt snabba perfusion system tillåts endast en mätning av svarstider storleksordningen 80 ms (figur 3E ). Dessutom erbjuder dessa elektroder lägre brus jämfört med bipolära elektroder, som har större tip motstånd och kräver användning av förstärkare med högre Ingångsmotstånd. Slutligen, dessa elektroder inte kräver användning av en specialiserad micromanipulator eller headstage som krävs för koncentriska elektroder. På balans uppväger fördelarna med konstruktion och användarvänlighet av enda kanal elektroder nackdelarna.
Den strategi som vi använde här att mäta K+ dynamics i skivor kan användas i många regioner i hjärnan för att studera K+ förordning. Även om detta protokoll visar användningen av K+-elektroder för mätningar av dynamiken i elektriskt evoked kalium joner i hjärnan vävnader, detta protokoll kan i stort sett användas i många olika vävnader där det är önskvärt att mäta K+ dynamics. Sådana situationer kan omfatta spontana dynamik och förändringar i svar på farmakologisk, optogenetic, eller chemogenetic cellulär aktivering. Dessa mikroelektroder kan göras med tillräcklig kvalitet och tillförlitlighet som möjliggör snabb integrering av denna teknik i något laboratorium verktygslåda. Detaljerade analyser av K+ koncentrationer i hälsa och sjuka stater kommer att möjliggöra ytterligare identifiering och kvantifiering av olika molekylära och cellulära komponenter bidrar till vila K+ koncentrationer i hjärnan3, 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Khakh labbet stöddes av NIH MH104069. Mody labbet stöddes av NIH NS030549. J.C.O. Tack det NIH T32 neurala mikrokretsar utbildning Grant(NS058280).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer. Sunderland, MA. 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M.
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
