Gør, afprøvning og brug af kalium Ion selektive Microelectrodes i væv skiver af voksne hjerne

Summary

Kalium ioner bidrage til hvile membranen potentiale celler og ekstracellulære K⁺ koncentration er en afgørende regulator af cellulære ophidselse. Vi beskriver hvordan man laver, kalibrere og bruge monopolære K⁺-selektive microelectrodes. Ved hjælp af sådanne elektroder kan måling af elektrisk evoked K⁺ koncentration dynamics i voksen hippocampus skiver.

Abstract

Kalium ioner bidrage væsentligt til den hvilende membranen potentiale celler og ekstracellulære K⁺ koncentration er derfor en afgørende regulator af celle ophidselse. Ændret koncentrationer af ekstracellulære K⁺ påvirker den hvilende membran potentiale og cellulære ophidselse ved at flytte ligevægt mellem lukket, åben og inaktiveret stater for spænding-afhængige Ionkanaler, der ligger bag aktionspotentialet indledning og varmeledning. Derfor er det værdifuldt at direkte måle ekstracellulære K⁺ dynamics i sundheds- og syge stater. Her, vi beskriver hvordan man laver, kalibrere og bruge monopolære K⁺-selektive microelectrodes. Vi indsatte dem i voksen hippocampus hjernen skiver til at måle elektrisk evoked K⁺ koncentration dynamics. Fornuftig brug af sådanne elektroder er en vigtig del af den værktøjskasse, der er nødvendige for at evaluere cellulære og Biofysisk mekanismer, der styrer ekstracellulære K⁺ koncentrationer i nervesystemet.

Introduction

Kalium ion koncentrationer er stramt reguleret i hjernen, og deres udsving øve en stærk indflydelse på den hvilende membran potentiale af alle celler. I lyset af disse kritiske bidrag er et vigtigt mål for biologi til at bestemme de cellulære og Biofysisk mekanismer, der anvendes til stramt regulere koncentrationen af K⁺ i det ekstracellulære rum i forskellige organer i kroppen^{1 , 2}. et vigtigt krav i disse undersøgelser er evnen til at måle K⁺ koncentrationer præcist. Selv om mange komponenter, som bidrager til kalium homøostase i hjernen i raske og syge stater har været identificeret^3,4,5, er yderligere fremskridt blevet bremset på grund af specialiserede karakter forberede ion selektiv microelectrodes for kalium måling. Mikroelektrode sensorer repræsenterer den gyldne standard for måling af K⁺ koncentrationer i vitro, i væv skiver og in vivo.

Nyere tilgange for K⁺ overvågning er under udvikling ved hjælp af optiske sensorer, men disse registrerer ikke en biologisk relevante vifte af K⁺ koncentrationer eller har ikke været fuldt undersøgt i biologiske systemer, selv om de første resultater synes lovende^6,7,8. Sammenlignet med optiske sensorer, er microelectrodes principielt begrænset til en punktkilde måling af ioner, selvom elektrode arrays kunne forbedre den rumlige opløsning⁹. Denne artikel fokuserer på single-barreled mikroelektrode sensorer til overvågning K⁺ dynamics.

I dette arbejde, vi rapportere detaljeret trinvis procedurer at gøre K⁺ selektive microelectrodes, ved hjælp af en valinomycin-baseret kalium ionophor, der tillader yderst selektiv (⁴ 10 K⁺ fold til Na⁺ selektivitet) K⁺ bevægelse over membraner¹⁰. En naturligt forekommende polypeptid, valinomycin fungerer som en K⁺ gennemtrængelig pore og letter strømmen af K⁺ ned den elektrokemiske gradient. Vi beskriver også, hvordan man kalibrere elektroderne, hvordan man kan gemme og bruge dem og endelig hvordan du installerer dem til at måle K⁺ koncentration dynamics i akut hippocampus hjernen skiver fra voksne mus. Brugen af sådanne elektroder samt genmodificerede mus, der mangler specifikke Ionkanaler foreslået at regulere ekstracellulære K⁺ dynamics skal afsløre de cellulære mekanismer, der bruges af nervesystemet til at kontrollere den omgivende koncentration af K ⁺ i det ekstracellulære miljø.

Protocol

Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med den nationale Institute sundhed Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af kanslerens dyr Forskningsudvalget ved University of California, Los Angeles. Alle mus har været opstaldet med mad og vand tilgængelig ad libitum i 12t lys-mørke omgivelser. Alle dyr var sund med ingen indlysende adfærdsmæssige ændringer, var ikke involveret i tidligere undersøgelser og blev ofret under lys cyklus. Data for eksperimenter blev indsamlet fra voksne mus (6-8 uger gamle for alle eksperimenter).

1. forberedelse af K⁺ selektive microelectrodes

1. Silanisering af borsilikatglas
   1. Fjerne tilstrækkelige glas kapillærer fra emballage og placere i en 50 mL konisk slange. Fyld koniske rør til toppen med 1 M HCl. vask elektroder med blid agitation i HCl natten over eller for mindst 6 timer.
   2. Kort skyl kapillærer med 70% ethanol og derefter tørre helt på 100-120 ° C i 6-8 timer. Gemme vasket kapillærer i containere med vandfri calcium sulfat tørremiddel i op til 4 uger før yderligere brug.
   3. Før silanisering, skal du trække kapillærer til en fin spids ved hjælp af en mikroelektrode puller. De microelectrodes, som vi bruger er ca 2-5 mikrometer i diameter. Altid håndtere vasket kapillærer med handsker, da olier fra huden kan forstyrre silanisering.
   4. Placere microelectrodes i en glasbeholder, således at elektroderne er forhøjet fra bunden for at forhindre tip brud. Lave microelectrodes til objektbeholderen bruger autoklaverbart tape eller lignende selvklæbende tape.
   5. Fjerne ca. 0,5 mL 5% dichlorodimethylsilane (DDS) silanisering løsning fra beholderen ved hjælp af kvælstof replacement-metoden (Se figur 2). Fylde en ballon med nitrogen gas og vedhæfte en sprøjte eller rør og nål til ballonen. Indsætte nålen i objektbeholderen DDS mens udarbejdelsen af DDS i en separat sprøjte via en længere nål.
   6. Anvende silanisering løsning dråbevis til spidsen af pipetter og straks dække. Anbring beholderen holder microelectrodes med silanisering løsning i en pre varmede (170-180 ° C) laboratorium ovn i 10-12 timer eller på 200-220 ° C i 30 minutter
   7. Efter inkubation, sluk ovnen og fjern derefter pladen fra ovnen. Vær forsigtig, når at fjerne pladen fra rugemaskinen, så det er meget varmt. Pladen anbringes på en bænk ved stuetemperatur i 10-15 minutter at tillade glasvarer til afkøling.
   8. Fjerne microelectrodes fra pladen (med et barberblad eller skalpel blade til at klippe båndet) og placere dem i et tørremiddel fyldt lufttæt beholder. TOT silaniseret microelectrodes holdes fri for fugt kan bruges i op til 1 uge efter silanisering.
2. Priming elektroderne
   1. Forberede en stamopløsning af K⁺ ionophor cocktail: 5% w/v valinomycin, 93% v/v 1,2-dimethyl-3-nitrobenzen, 2% w/v kalium tetrakis(4-chlorophenyl) Borat¹¹. Denne løsning er en svag gul farve. Holde i en lufttæt, uigennemsigtig beholder ved stuetemperatur. Hvis korrekt gemt denne løsning kan vare mange måneder.
   2. Forberede en stamopløsning af 10 mM HEPES buffered 300 mM NaCl ved pH 7,4. Lave elektroden i en klemme og opfyldning med buffered NaCl ved hjælp af en 28G microfil tip tilsluttet en sprøjte. Observere, at saltvandsopløsning har nået slutningen af mikroelektrode tip. Bekræfte, at mikroelektrode er fri for store bobler, der kunne forstyrre strømmen af strøm.
   3. Bryde spidsen af elektrode til ca 10-20 µm bred, ved hjælp af den stumpe side af en skalpel eller et barberblad.
   4. Med en mikropipette, anvende en lille dråbe (~0.1 µl) af K⁺ ionophor nær spidsen af mikroelektrode. Hvis elektroden har været korrekt TOT silaniseret slipværktøjet vil blive absorberet ind i knækkede spidsen. Fyld elektrode til 1-2 mm med K⁺ ionophor, og Fjern overskydende ved hjælp af silkepapir.

2. kalibrering af K⁺ selektive Microelectrodes

1. Forberedelse af kalibreringsopløsninger
   1. Forberede opløsninger med forskellige koncentrationer af KCl i lige osmolaritet kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) ved at erstatte NaCl med KCl. Vi brugte 0.1, 1, 4,5, 10 og 100 mM K⁺ ACSF, til kalibrering af elektroderne. Opskrifter til disse kalibreringsopløsninger er angivet i tabel 1.

Kemiske	MW	endelige mM	0.1 mM [K +]	1 mM [K +]	4,5 mM [K +]	10 mM [K +]	100 mM [K +]
	(g / mol)
NaCl	58.44	varierer	1.51 g	1,50 g	1,44 g	1.4 g	0.345 g
KCl	1 M lager	varierer	20 µl	200 µl	900 µl	2 ml	20 ml
CaCl2	1 M lager	2	400 µl
MgCl2	1 M lager	1	200 µl
NaH2PO4	119.98	1.2	0,29 g
NaHCO3	84.01	26	0.437 g
D-glukose	180.16	10	0.360 g
Vand	Qs 200 ml

Tabel 1. Kalium kalibreringsopløsningerne

2. Mikroelektrode kalibrering
   1. Boble alle løsninger med 95% O₂/5% CO₂ i mindst 20 minutter inden du starter eksperimentet. Begynder perfusing bad med 4,5 mM [K⁺] ACSF med en hastighed på 3 mL pr. minut. Placere K⁺ selektiv elektrode i elektrode indehaveren knyttet til elektrode headstage på en manipulator. Denne headstage er forbundet til en passende forstærker. Indsæt spidsen af elektroden i Bad perfusate.
   2. Sikre Ag/AgCl jorden elektrode er badet i samme løsning og at strømmen er stabil. Anvende kalibreringsopløsninger i en trinvis måde og registrere de potentielle ændringer i mV på tværs af elektrode tip. Afvente potentiale på elektrode tip til at nå en stabil værdi før du skifter til den næste løsning
   3. Måle steady state spænding ændring i svar på anvendelsen af kalibreringsopløsningerne elektrode tip. Bekræfte, at hældningen af elektrode svar er mindst 52 og ikke større end 58 mV per log ændring i [K⁺].

3. forberedelse af akut hippocampus hjernen skiver

1. Forberedelse af skive løsninger
   1. Forberede 500 mL saccharose opskæring løsning bestående af: 194 mM saccharose, 30 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄, og 26 mM NaHCO₃, 290-300 mOsm, mættet med 95% O₂ og 5% CO₂.
   2. Forberede 1-2 liter optagelse løsning (ACSF) består af: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄og 26 mM NaHCO₃; pH 7.3-7.4 (efter boblende), 290-300 mOsm, mættet med 95% O₂ og 5% CO₂. Udfylde et bægerglas, der indeholder en hjerne skive indehaveren kammer med optagelse løsning og holde det på 32-34 ° C. Fyld vibratome kammer med isvand sjap.
2. Akut skive forberedelse
   1. Dybt bedøver en mus ved at placere det i en glasklokke, opladet på forhånd med 2-3 mL isofluran. Check for tå knivspids refleks, og hvis ikke-lydhør, hurtigt halshugge det ved hjælp af et par skarpe sakse eller guillotine, som kræver dit dyrs protokollen.
   2. Lave en 2-3 cm snit bruger sakse fra den caudale del af kraniet til at skære i hovedbunden langs midterlinjen. Mens manuelt tilbagetrækningskraften hovedbunden, gøre to 1 cm vandret snit fra foramen magnum langs siderne af kraniet. Derefter, ved hjælp af fine sakse, skæres et snit længden af kraniet, langs midterlinjen fra bagsiden af kraniet til næsen.
   3. Bruger fine pincet indsat nær midterlinjen, trække indridset kraniet i to portioner. Uddrag mus hjernen fra kraniet og brug en kniv til at fjerne lillehjernen og olfaktoriske pærer, som er henholdsvis placeret på de caudale og rostralt dele af hjernen. Disse kan identificeres ved de store sprækker, som adskiller dem fra cortex.
   4. Montere hjernen blok på vibratome-bakken med superlim. Fylde bakken vibratome med iskolde skæring løsning.
   5. Skær væv sektioner på den koronale fly på 300 µm tykkelse. Normalt kan 6 koronale hippocampus skiver afhentes.
   6. Efter hvert afsnit er skåret, straks overføre skiver til skive holding bægerglas opvarmes til 32-34° C. Holde sektioner ved denne temperatur i 20 min. før du fjerner det bæger, som indeholder afsnittene og placere denne ved stuetemperatur i mindst 20-30 minutter før optagelse.

4. måling af elektrisk Evoked K⁺ Dynamics

1. Opsætning af skive forberedelse
   1. Anbring forsigtigt hjernen skive i badet ved hjælp af Pasteurs pipette og forsigtigt holde det på plads med en platin Harpe med nylon snore.
   2. Sikre tips af bipolar stimulere elektroden er parallelle med hinanden og er plan med flyet i Skive. Langsomt, i løbet af 6-7 sekunder, Indsæt elektroderne i CA3 stratum radiatum ca 40-50 µm dybt for at stimulere Schaffer soeskende. I koronale sektioner, kan CA3 være ca identificeret som del af hippocampus ordentlig lateral til granulet cellelag på Hippocampus genu med stratum radiatum falder mediale og ventrale til den pyramideformede cellelag.
   3. Omhyggeligt indsætte K⁺-selektiv elektrode i CA1 stratum radiatum ca 50 µm dyb, af langsomt sænke elektrode over ca 3-4 sekunder. Tillad potentiale til at stabilisere over elektroden før du anvender stimulering til skive: dette tager normalt 5-10 minutter. Hvis udsnittet udstiller spontane ændringer i ekstracellulær K⁺ derefter kassere og Gentag denne proces med en ny skive.
2. Måle evoked K⁺ frigivelse
   1. Anvende tog af elektrisk stimulation (8 bælgfrugter) ved manuelt deprimerende på aftrækkeren på stimulatoren mens digitalt optage svar. Anvende stimulation på 10 Hz og 1 ms pulse bredde, startende fra 10 µA stimulus amplitude.
   2. Anvende stigende stimulation amplituder med en faktor på 2, indtil en maksimal K⁺ svar amplitude er registreret. Hvis du ikke kan se nogen reaktion, Flyt placeringen af K⁺ elektrode tættere til webstedet stimulation i 100 µm i trin
   3. Bestemme den stimulus amplitude, der producerer den halve maksimal svar. Det er vores erfaring, mellem 40-160 µA, afhængigt af præparationskvalitet, alder af dyret, og afstanden mellem stimulation elektroder og K⁺ selektiv elektrode.
   4. I den samme skive, ved hjælp af en stimulus amplitude på et trin lavere end amplitude, der producerer den halve maksimal svar (f.eks. Hvis 80 µA producerer en halv-maksimal respons, bruge 40 µA) anvende stimulus tog for at øge antallet af impulser. I første omgang, har vi brugt tog af 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 og 128 impulser.
   5. For at bekræfte, at K⁺ signaler er medieret af aktionspotentialet fyring af elektrisk stimuleret Schaffer soeskende badet, anvende 0,5 µM TTX i ACSF i 10 minutter og Gentag stimulation-protokollen. Ingen evoked svar bør overholdes.
   6. Efter endt skive eksperiment, bekræfte elektroden har fastholdt sin responsivitet af re kalibrering elektrode i kalibreringsopløsningerne og sikre svar har ikke afveget med mere end 10% fra den oprindelige kalibrering

Representative Results

Selektiv måling af ekstracellulære K⁺forberedt vi ion-selektiv microelectrodes belagt med en hydrofobe lag gennem silanisering af ren borsilikatglas pipetter (figur 1A). Denne belægning giver K⁺ ionophor indeholdende valinomycin for at hvile på spidsen af elektrode og tillader kun K⁺ flux gennem en smal åbning på elektrode spids (figur 1B). Efter grunding elektroder med tilbagefyldt saltopløsning og K⁺ ionophor, kan elektroderne testes for deres hurtige og lineær respons til trinvis ændringer i Bad K⁺ koncentrationer (figur 3A) og for deres svar på Bad K⁺ ændringer over kalibreringsopløsningerne (figur 3B) i saltvand eller ACSF på en måde forudsagt af Nernst ligning². Ændringen i steady state potentielle kan afbildes mod bad K⁺ koncentration for at bestemme hældningen af linjen, som bør ca 58.2 mV per log [K⁺], ifølge Nernst-ligningen, og ikke mindre end 52 mV per Log [K⁺] (figur 3 c). Vi har desuden testet lydhørhed af K⁺ ionselektive elektroder og fundet, at de reagerede på en 5,5 mM ændring i K⁺ med storhed og forfald tid konstanter af ca 85 ms (figur 3D,E).

Den elektrofysiologiske optagelse rig består af en standard opretstående mikroskop tilsluttet en LCD-skærm til at identificere placeringen af den stimulerende og registrering af elektroder. Ingen særlig optik er nødvendige for visuel markedsføring af K⁺ og stimulation elektroder; Vi bruger en 5 x eller 10 x mål linse og hvidt lys fra en Halogenpære, men en hvid LED kunne bruges i stedet. Stimulere elektroden er forbundet til output af en stimulus isolator, som leverer depolariserende nuværende via timet levering af impulser fra en stimulator eller andre sådanne tidtagningsanordning. Med andre ord leverer stimulatoren tog 2 V, 10-20 Hz timing pulser til stimulus isolator. Ved modtagelse af disse impulser, leverer stimulus isolator derefter den ønskede strøm til elektroderne for stimulation. Optagelse elektrode er tilsluttet en elektrode indehaveren, forbundet til en headstage, forstærker og A/D board, som interface til en PC med elektrofysiologiske optagelse software (figur 4A). Efter elektroden er korrekt kalibreret og akut skiver er blevet forberedt, kan skive placeres i ACSF perfusate. At stimulere Schaffer soeskende, K⁺-selektiv elektrode placeres i CA1 stratum radiatum og feltet stimulation elektrode er placeret inden for CA3 (figur 4B).

Når elektroderne er blevet placeret og K⁺ optagelse har nået en stabil basislinje, pulser af stigende nuværende amplitude derefter kan anvendes på udsnittet (figur 5, øverst). Bølgeform af denne aktivitet vises som en hurtig stigning i K⁺ med en eksponentiel henfald sats, der er afskaffet med TTX ansøgning (figur 5, nederst).

Figur 1 : Diagram af silanisering reaktion og K⁺ selektive mikroelektrode arkitektur. A. skematisk gengivelse af silanisering reaktion, der opstår mellem de udsatte polar hydroxylgrupper af borsilikatglas og silanisering reagens dichlorodimethylsilane (DDS). Denne reaktion gør overfladen af glasset hydrofobe, som tillader K⁺ ionophor til at danne en tynd membran. B. Diagram af K⁺ selektive mikroelektrode. Elektroden er tilbagefyldt med saltvandsopløsning og K⁺ selektive løsning sted i et 1-2 mm tykt lag på spidsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Diagram over DDS udvinding. Skematisk fremstilling af kvælstof proceduren for DDS udtræk fra en container. DDS er flygtige og brændbare og kan reagere voldsomt med atmosfæriske gasser, når det er i høje koncentrationer, derfor er det nødvendigt at erstatte DDS fjernet med inert nitrogen gas. En ballon fyldes med nitrogen er tilsluttet en nål via en sprøjte eller passende slanger. Denne nål indsættes gennem fugemasse på objektbeholderen giver nitrogen (N₂) strømningshastigheden i containeren. Separat, er en lang (3-10 cm) nål tilsluttet en 1 mL sprøjte og indsat i beholderen. Denne sprøjte bruges derefter til at udtrække DDS, mens kun nitrogen gas kan indtaste beholderen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Kalibrering af microelectrodes. A. bad perfusion anvendelsen af K⁺ i forskellige koncentrationer i saltvand kan hurtigt og reversibelt producere Nernstian ændringer i potentiale på tværs af elektrode tip. B. trinvis anvendelsen af K⁺ i ACSF fremkalder en karakteristisk og stabil ændring i elektrode tip potentiale. C. Plot af mV ændringen af K⁺ selektiv elektrode som reaktion på stigende koncentrationer af K⁺ i fire elektroder; R² er 0.9995 for disse fire elektroder. D. Hurtig perfusion system bad anvendelse af 10 mM K⁺ forårsager et trin svar i spænding på tværs af K⁺ selektiv elektrode tip. E. Plot af den målte svar gange (tau i ms); ingen forskel mellem storhed og forfald tid blev fundet (betyde ± SEM, p = 0.939, to prøve t-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Apparat til måling af ekstracellulære K⁺ . A. Elektrofysiologi rig består af et mikroskop, fastgjort til et Vibrationsdæmpende bord med en vedhæftet kamera og LCD-display til skive visualisering. K⁺ elektrode er fastgjort til et headstage, forstærker og analog til digital board, som output signal til en tilsluttede PC med elektrofysiologiske optagelse software. Elektrisk stimulation elektroderne er tilsluttet en stimulus isolator, som varierer stimulation amplitude og en stimulator for timing stimulus levering. B. Diagram af skive forberedelse og placeringen af placeringen af de forskellige elektroder på udsnittet. CA3 kan identificeres ca som del af hippocampus ordentlig lateral til granulet cellelag på Hippocampus genu med stratum radiatum falder rostralt den pyramideformede cellelag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 : Måling af elektrisk evoked K⁺ release. Repræsentative spor af K⁺ frigivelse fra optagelse elektrode under basale forhold (øverst) og deres tab på begæring af tetrodotoxin (0,25 µM) 5 minutter inden optagelse (nederst). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den metode, som vi beskriver her har tilladt os at vurdere K⁺ dynamics svar på elektrisk stimulation af Schaffer soeskende i akut hippocampus skiver fra voksne mus. Vores metode til at forberede K⁺ ion selektiv microelectrodes minder tidligere beskrevne procedurer^12,13,14,15. Dog, denne metode har fordele i forhold til alternative elektrode konfigurationer i, at det er hurtig og ukompliceret at forberede K⁺ selektive microelectrodes. Efter passende kalibrering, disse elektroder fandtes at håndfast måle K⁺ dynamics i skiver under elektrisk stimulation, og sådanne svar var blokeret af TTX. I disse eksperimenter, blev stimulering af 80-160 uA på 10 Hz brugt; optimering af stimulation betingelser for et bestemt eksperiment og en hjerne område af interesse vil dog påkrævet. Disse værdier er opført som en guide.

Hældningen af elektroderne reaktion bør være 58.2 mV per log [K⁺]. Sådan en værdi er forudsagt af Nernst og Nicolsky-Eisenman ligninger for en selektiv semipermeabel membran K⁺ ; sidstnævnte bedre konti for interaktioner mellem ioner¹⁶. Hvis elektroden ikke reagerer på den forventede måde, kunne dette være en af to primære årsager. Først kunne silanisering være utilstrækkelig, forårsager membran til at være tabt eller salt broer til form. Bekræfte, at membranen er intakt ved observation gennem mikroskop, der bør være en klar grænseflade mellem pipette løsning og membranen. En anden grund kunne være tilstedeværelsen af bobler i pipetten, der hindrer strømmen af nuværende fra sølv chlorid wire. Hvis bobler er observeret, derefter fjerne pipette og svirp energisk at fjerne dem. Hvis disse løsninger ikke, re gøre en anden K⁺ selektiv elektrode eller gentage silanisering for længere eller ved højere temperaturer. Det er dog vigtigt at gentage disse centrale kontroller, hver gang et nyt område af hjernen er undersøgt eller en ny mikroelektrode er testet.

To specifikke forstærkere var brugt i disse eksperimenter, men andre forstærkere kan anvendes, så længe den Indgangsimpedans er større end eller lig med 500 MΩ. At have kalibreret elektroder med både 500 MΩ og 5 GΩ input impedances, fandt vi, der var ingen forskel i hældningen af spænding svar med enten indstilling over en vifte af K⁺ koncentrationer (56,9 ± 0,7 og 56,5 ± 0,9 mV per billeddetaljerne ændring i [K^{+ < / C1 >] for 500 MΩ og 5 GΩ indgang impedances, henholdsvis; P = 0.759, parret t-test, n = 4 elektroder).}

Vi brugte også hurtig løsning parametre til vurdering af elektroder til en kendt hoppe i [K⁺] fra 4,5 til 10 mM (figur 3D) responstid. Elektroderne reagerede med storhed og forfald gange (tau) 85 ± 12 og 85 ± 15 ms, henholdsvis. I den forbindelse reagere løsning exchange kinetik for vores brugerdefinerede hurtig løsning switcher var 85 ± 27 ms. derfor K⁺ ionselektive elektroder med kinetik så hurtigt som den løsning skifter vi ansat og langt hurtigere end dynamikken i K⁺ det ekstracellulære miljø som følge af Schaffer sikkerhedsstillelse stimulation (figur 5). Disse data tyder på, at K⁺ ionselektive elektroder kan bruges til at anslå kinetik af K⁺ ophobning og regnskabsafslutning i hjernevæv. Men i fremtiden arbejde passende kontrol og kalibreringer vil være behov for på et sag til sag grundlag. Vi foreslår, at det er værdifuldt at bruge tid på at forstå løsning exchange kinetik i din optagelse kammer.

Vi fandt tre kritisk vigtige faktorer, der påvirker kvalitet og robusthed af K⁺ målinger i skiver. Først er kvaliteten af forberedelsen, både væv sundhed og alder af de dyr, der anvendes synes at være relevante. For denne undersøgelse, har vi brugt C57/Bl6N mus, der er ~ 12 uger gamle. I sjældne tilfælde fandt vi skiver med spontane K⁺ udsving beløber sig til ~0.1 mM og varige 5-10 sekunder; disse udsnit blev kasseret. Andet er kvaliteten af optagelsen mikroelektrode. Det primære spørgsmål er tid og temperatur, der er brugt til silanisering af trak glasset kapillær. Vi anbefaler > 170 ° C i mindst 6 timer (op til natten er acceptabelt) eller ved 200 ° C i 30 minutter. Utilstrækkelig opvarmning af elektroder med silanisering reagens kan føre til elektroder, som ikke opretholder et steady state, potentielle på grund af gradvise tab af K⁺ ionophor. Desuden, når du forbereder elektroderne, anbefaler vi at placere et tyndt lag (1-2 mm) K⁺ ionophor i spidsen med en diameter på 10-20 µm dvs på omtrent på størrelse med en gennemsnitlig cellen kroppen (figur 1B). Bryder ikke alt for bredt, tip eller K⁺ selektive membran vil miste integritet og elektroden vil mislykkes. Dette trin kan kræve lidt øvelse at opnå spidsen af den korrekte størrelse. K⁺ ionselektive elektroder med en alt for fin spids eller for tyk af et lag kan have træg svar, i forhold til korrekt opbygget elektroder. Den tredje faktor er afstanden mellem stimulation elektrode og K⁺ selektiv elektrode. Vi har brugt en Inter elektrode afstand af ca 500 µm, men den optimale afstand kan variere betydeligt med området individuelle hjernen og skal nøje overvejes for særlige eksperimentet ved hånden.

Ud over den enkelte tønde konfiguration, der er i øjeblikket flere metoder til at gøre K⁺-selektive microelectrodes i bipolar og koncentrisk formater¹⁷. I forhold til de udgivne beskrivelser af disse metoder, single channel-elektroderne har to vigtigste ulemper: 1) lidt større tip diameter (~ 10 vs 4 µm), som kunne hidføre større sprængning af det ekstracellulære rum comparted til bipolar og koncentrisk elektroder, og 2) uforenelighed med samtidige målinger af flere ion arter som bipolar elektroderne. Men enkelt kanal elektroder tilbyder flere fordele. Specifikt, disse elektroder kan være fremstillet i mindre end fem minutter og er derfor mere disponible og kan være lavet og kalibreret hurtigt før eksperimenter. Derfor er risikoen for elektrode brud under kurset eksperimenter mindre af et problem. Derudover, fordi jorden elektrode og optagelse elektrode er fysisk adskilt fra volumenprocenten af badet, er der ingen chance for dannelsen af salt broerne ved spidsen af elektrode, som kan føre til elektrode fejl i koncentriske og bipolar elektroder. Responstiden for enkelt kanal elektroderne er hurtigere end bipolar elektroder og sandsynligvis sammenlignes med koncentriske elektroder (~ 20 ms), selv om vores hurtige perfusion system kun tilladt en måling af svartider på rækkefølgen af 80 ms (figur 3E ). Disse elektroder tilbyder derudover lavere støj i forhold til bipolar elektroder, som har større tip modstand og kræver brug af forstærkere med højere input modstand. Endelig kræver disse elektroder ikke brug af en specialiseret micromanipulator eller headstage som er påkrævet for koncentriske elektroder. På balance opvejer fordelene ved opførelsen og brugervenligheden af enkelt kanal elektroder ulemperne.

Den tilgang, som vi brugte her at måle K⁺ dynamics i skiver kan bruges i mange områder af hjernen til at studere K⁺ forordning. Selv om denne protokol demonstrerer brugen af K⁺-ionselektive elektroder til målinger af dynamikken i elektrisk evoked kalium ioner i hjernen væv, denne protokol kan stort set bruges i mange forskellige væv hvor det er ønskeligt, at måle K⁺ dynamics. Sådanne situationer kan omfatte spontan dynamik og ændringer som reaktion på farmakologiske, optogenetic, eller chemogenetic cellular aktivering. Disse microelectrodes kan laves med tilstrækkelig kvalitet og pålidelighed, tillader hurtig integration af denne teknik i ethvert laboratorium værktøjskasse. De detaljerede analyser af K⁺ koncentrationer i sundheds- og syge stater vil give yderligere påvisning og kvantificering af, hvordan forskellige molekylære og cellulære komponenter bidrager til hvile K⁺ koncentrationer i hjernen^{3, 18,19}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW