Summary
Desthiobiotin mærkning af en syntetisk oligo 25-nukleotid RNA, som indeholder en adenin-rige element (er) motiv, tillader specifikke bindende cytosole er-bindende protein.
Abstract
In vitro- RNA-pulldown anvendes stadig i vid udstrækning i de første trin af protokoller med henblik på at identificere RNA-bindende proteiner, der anerkender bestemt RNA strukturer og motiver. I protokollens RNA-pulldown kommercielt syntetiserede RNA-sonder er mærket med en modificeret form af biotin, desthiobiotin, fra 3' endepunktet af RNA-streng, der kan dekrypteres binder sig til streptavidin og dermed giver eluering af proteiner under mere fysiologisk betingelser. RNA-desthiobiotin er immobiliseret gennem interaktion med streptavidin på magnetiske perler, som bruges til at trække ned proteiner, der specifikt interagerer med RNA af interesse. Ikke-denatureret og aktive proteiner fra det cytosole brøkdel af lungehindekræft celler der bruges som kilde til proteiner. Metoden beskrives her kan anvendes til påvisning af samspillet mellem kendte RNA-bindende proteiner og en 25-nukleotid (nt) lang RNA sonde der indeholder en sekvens af interesse. Dette er nyttigt til at fuldføre den funktionelle karakterisering af stabiliserende eller destabiliserende elementer findes i RNA molekyler opnås ved hjælp af en reporter vektor assay.
Introduction
Genekspression og det endelige niveau for gen produktet kan reguleres tæt ved at påvirke mRNA stabilitet og mRNA oversættelse sats1. Disse post-transcriptional reguleringsmekanismer er udøvet gennem vekselvirkninger mellem ikke-kodende RNA og/eller RNA-bindende proteiner (RBPs) med målrettede mRNA. Det er normalt den 3' utranslaterede region af mRNA (3' UTR - tilhører den ikke-kodende del af genom2) der indeholder specifikke cis-regulerende elementer (CRE), som er anerkendt af trans-handler faktorer såsom miRNA eller RBPs 3. den bedst undersøgte cis-element inden for 3' UTR, er motivet er adenin-rige element (er), som er anerkendt af specifikke AU-bindende proteiner (AUBP), og til gengæld, inducerer enten mRNA nedbrydning/deadenylation (er-medieret decay) eller mRNA stabilisering4.
Størrelsen af 3' UTR af calretinin mRNA (CALB2) er 573 bp lang og indeholder en formodede AUUUA pentamer, som forudsagt af AREsite2, en bioinformatic værktøj5. Overensstemmelse med tilstedeværelsen af en formodet er motiv, pmirGLO vektor-reporter Analysen viste en stabilisering rolle af dette element inden for CALB2 mRNA6. Endelig, in vitro- RNA-pulldown blev brugt til at identificere den AUBP, der stabiliserer calretinin mRNA gennem er motiv.
Da alle ikke-kodende RNA'er interagerer med proteiner7, in vitro- RNA-pulldown er en god måde og første of choice analyse for at identificere RNA-interactors til støtte i afkodningen molekylære mekanismer. I denne RNA-pulldown metode, blev kommercielt syntetiserede RNA-sonder, der var mærket med en modificeret form af biotin (desthiobiotin) fra 3' endepunktet af RNA-streng, anvendt. RNA-desthiobiotin er immobiliseret gennem interaktion med streptavidin på magnetiske perler, som bruges til at trække ned proteiner, der specifikt interagerer med bundet-RNA af interesse. Ikke-denatureret og aktive proteiner fra det cytosole brøkdel af lungehindekræft celler der bruges som kilde til proteiner. Disse RNA-bundet proteiner er elueret fra de magnetiske perler, køre gennem en 12% SDS-PAGE gel, overføres til en membran og aftestede med forskellige antistoffer.
I standard streptavidin-biotin affinitet rensning procedure, barske denaturering betingelser er nødvendige for at forstyrre den stærke irreversibel biotin-streptavidin bånd for at eluere bundne proteiner8, hvilket kan føre til dissociation af proteinkomplekser. I modsætning til biotin, desthiobiotin reversibelt bindes til streptavidin og er konkurrencedygtig forskydes med en bufferopløsning af biotin, giver mulighed for en blid eluering af proteiner, og at undgå isolation af naturligt biotinylated molekyler9, tyder på, at teknikken er ideel til at isolere nativt proteinkomplekser indfødte betingelser.
In vitro bindende betingelser og strenghed, som bestemmes af saltkoncentration, reduktionsmiddel og vaskemiddel procentdel, bør være tæt på de tilstedeværende i forbindelse med cellulære for at identificere sande i vivo interaktioner. De bindende betingelser gennemført heri har tidligere påvist som passende for en identifikation af HuR som en AU-bindende protein10. Denne tilgang kunne spare tid, da optimering af ordentlig bindende betingelser kan være tidskrævende og udfordrende. Desuden, denne metode kunne anvendes som en start protokol for enhver RNA-pulldown eksperiment og gradvist kan optimeres ved at ændre koncentration af salte og rengøringsmidler, ændre glycerol procentdelen og tilføje andre salte. Vi viste desuden, at selv en kort 25-nukleotid RNA-sonde husly en pentamer er-motiv kan bruges til at vise interaktion med en specifik AUBP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af cytosole og nukleare proteinfraktion
- Plade 4 x 106 ACC-MESO-4 celler i en T150 celle kultur kolbe dyrkes i RPMI - 1640 medium suppleret med 10% FBS, 1 x penicillin/streptomycin (100 x) og 2 mM L-glutamin (200 mM). Når celler når et sammenløb af 80-90% (~5-5.5 x 106 celler), fortsætte med protein udvinding af nukleare og cytosole brøkdel.
Bemærk: ACC-MESO-4 cellelinie blev indhentet fra RIKEN BioResource Center11. - Opsug medium, vaske cellerne ved at tilføje 15 mL PBS, 1 x, VIP pladen forsigtigt et par gange og Opsug 1 x PBS. Tilføj 3 mL 0,25% Trypsin-EDTA og inkuberes kultur kolben ved 37 ° C i 3 min.
Bemærk: Se celler under mikroskop for udstationering; Hvis stadig tilknyttet tap kolbe mod håndfladen i en række 3 gange. - Tilføje 7 mL af RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS, 1 x penicillin/streptomycin (100 x) og 2 mM L-glutamin (200 mM), indsamle cellerne i en 15 mL tube og spin ned på 200 x g i 5 min.
- Opsug medium og resuspend celle pellet med 1,5 mL 1 x PBS, derefter overføre cellerne ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør. Spin ned på 500 x g og 4 ° C i 5 min. Fjern supernatanten.
Bemærk: Fra dette trin og fremefter, skal du udføre alle centrifugering trin ved 4 ° C og holde alle reagenser på is. - Resuspenderes celle med iskold 1,5 mL 1 x PBS og spin-ned celler på 500 x g og 4 ° C i 3 min. supernatanten.
Bemærk: De nødvendige mængder af CER I, CER II og NER reagenser er 10, 0,55 og 5 bind anslåede celle pellet pakket volumen, henholdsvis; følgende protokol antager et volumen på 20 µL. Vi anbefaler forbereder kun den nødvendige mængde reagens CER jeg. - Tilføje 200 µL af is-kold cytoplasmatiske udvinding reagens (CER jeg) suppleret med 2 µL 1 x proteinase inhibitor, fxfortyndes 1 tablet af Protease Inhibitor (EDTA-fri) i 500 µL vand for at opnå 100 x lager. Dette beløb af reagens CER jeg er nok til at lyse 20 µL af en celle pellet pakket volumen.
- At estimere pellet pakket cellevolumen, sammenligne rør indeholdende celle pellet med en 1,5 mL rør fyldt med 10, 20, 50 eller 100 µL 1 x PBS.
- Resuspenderes celle af energisk vortexing tube for 15 s og Inkuber i røret i isbad i 10 min. tilføje 11 µL af is-kold cytoplasmatiske udvinding reagens II (CER II) til rør, energisk vortex for 5 s, og Inkuber 1 min på is.
- Vortex kraftigt i 5 s og centrifugeres tube på 16.000 x g og 4 ° C i 5 min. Overfør supernatanten til ren pre kølet røret på is. Supernatanten er den cytoplasmatiske fraktion, der er yderligere brugt i RNA-pulldown eksperiment.
- Resuspenderes resterende i 100 µL af iskold nukleare udvinding reagens (NER) suppleret med 1 µL af proteinase inhibitor (100 x) og energisk vortex for 15 s. Vi anbefaler forbereder kun den nødvendige mængde af NER reagens suppleret med proteasehæmmere.
- Inkuber prøve på ice i 40 min. med lejlighedsvise vortexing for 15 s (hver 10 min).
- Centrifugeres tube på 16.000 x g i 10 min. overførsel supernatanten (dette er den nukleare proteinfraktion) til en ren pre kølet tube.
- Straks gå videre ved at måle proteinkoncentration ved hjælp af metoden bicinchoninic (BCA) (Se Tabel af materialer). For at kontrollere for protein renhed af hver fraktion, skal du udføre immunoblotting (figur 1) mod α-tubulin (positiv registrering kun i det cytosole brøkdel) og Poly ADP-ribose polymerase - PARP (positiv registrering kun i den nukleare fraktion). For protein visualisering, henvises til afsnit 4.
- For at holde protein aktivitet og deres hjemstat, forberede 25 µL af delprøver af cytosole og nukleare ekstrakter. Snap-fryse disse alikvoter ved at placere dem i flydende nitrogen for 5 s og lageret direkte ved-80 ° C.
2. mærkning af RNA med Desthiobiotin
- RNA-sonder kommercielt syntetiseret og HPLC renset. Resuspend med nukleasen-gratis vand på 10 µM.
Bemærk: Sonden sekvenser er angivet i tabel 1. - Brug 50 pmol af RNA pr. RNA-pulldown reaktion. Tø og holde alle reagenser på is undtagen for PLØK 30%, anvendes til etiket 3' endestation for RNA oligo.
- Overføre 5 µL af 10 µM RNA-sonder, mærket som CALB2 3' UTR (er), CALB2 3' UTR (mtARE), og uafhængige-RNA (IRE), i 0,5 mL tynd væg microcentrifuge rør og inkuberes i en PCR-maskine på 85 ° C for 5 min. placere rør straks på is.
Bemærk: Dette trin er vigtigt, da det fremmer afslapning og tilgængelighed af RNA sonden for mærkning. - For en enkelt 30 µL reaktion, tilføje til RNA-holdige røret følgende 10 µL mix: 3 µL nukleasen gratis vand, 3 µL af 10 x RNA Ligase reaktion Buffer, 1 µL af RNase Inhibitor (40 U/µL), 1 µL af Desthiobiotinylated Cytidine bisfosfat (1 mM) , og 2 µL af T4 RNA ligase (20 U/µL).
Bemærk: For at forberede master mix A 3 prøver i overskud (3.2), mix 9,6 µL af nukleasen gratis vand, 9,6 µL af 10 x RNA Ligase reaktion Buffer, 3,2 µL af RNase Inhibitor (40 U/µL), 3,2 µL af Desthiobiotinylated Cytidine bisfosfat (1 mM) og 6,4 µL af T4 RNA ligase (20 U/µL). - Tilføje omhyggeligt 15 µL af PLØK 30% til reaktionen. Brug en anden tip til at blande reaktionen. Inkuber reaktion overnatning på 16 ° C.
- Den næste dag, forberede følgende: 5 M NaCl (frisk/nukleasen-fri), chloroform: isoamyl alkohol i 24:1-forhold (f.eks.pr. reaktion - 96 µL chloroform og 4 µL isoamyl alkohol), iskold 100% ethanol og iskold 70% ethanol.
- Tilføje 70 µL nukleasen-gratis vand til RNA-mærkning reaktion rør. Tilsæt 100 µL chloroform: isoamyl alkohol og vortex kort. Spin-ned på 13.000 x g til 3 min. Fjern forsigtigt kun den øverste fase og overførsel til en ny nukleasen-fri 1,5 mL tube; undgå at berøre den nederste fase.
- Tilsæt 10 µL af 5 M NaCl, 1 µL af glykogen og 300 µL iskold 100% ethanol. Røret anbringes ved-20 ° C i 2 timer.
Bemærk: På dette trin, eksperimentet kan være fortsatte den følgende dag. - Centrifuger på 13.000 x g og 4 ° C i 15 min. supernatanten omhyggeligt uden at forstyrre pelleten. Tilsæt 300 µL af iskold 70% ethanol og centrifugeres igen ved 13.000 x g og 4 ° C i 5 min.
- Supernatanten helt og lufttørre pellet (15 min). Resuspenderes i 20 µL nukleasen-gratis vand.
Bemærk: Fortsætte med RNA-pulldown på samme dag. - Inkuber RNA ved 90 ° C i 2 min. og Anbring på is. Placere mærket-RNA på is i løbet af de følgende trin i forvask af streptavidin magnetiske perler.
Bemærk: En længere inkubationstiden kan beskadige RNA sonden.
3. RNA-Protein Pulldown
-
Forvask streptavidin-magnetiske perler og inkubering med desthiobiotin-RNA
- Bruge 50 µL af streptavidin magnetiske perler pr. 50 pmol RNA. Dette bør dog være optimeret afhængigt af eksperimentet.
- Vortex tube med streptavidin-magnetiske perler for 15 s, og hurtigt fjerne 200 µL (master mix; nok for reaktioner, 3 + 1) i en ren 1,5 mL sikker-lock tube bruger skære pipette tips. Placer røret på en magnetisk stå, så perlerne samle på siden af glasset og vente 1 min. Fjern resuspension væske.
- At vaske perlerne, fjerne røret fra den magnetiske stå, tilføje 400 µL af 0,1 M NaOH, 0,05 M NaCl løsning, og forsigtigt afpipetteres op og ned flere gange. Placer røret tilbage på den magnetiske stand. Vent 1 min og indsamle supernatanten. Gentag dette trin igen.
- Vaske perlerne med 200 µL af 100 mM NaCl. Fjern supernatanten.
- Tilføje 200 µL af 20 mM Tris (pH 7,5), resuspend perler af pipettering, placere røret på den magnetiske stå, vente på 1 min og Fjern supernatanten. Gentag trin.
- Fjerne røret fra den magnetiske stå, tilføje 200 µL 1 x RNA indfangning buffer, og pelleten streptavidin magnetiske perler af kort vortexing. Fjerne 50 µL af streptavidin magnetiske perler og tilføje til hver mærket RNA rør ved hjælp af en cut pipette tip. Inkuber rør i 30 min. ved stuetemperatur på en rulle.
-
Bindende protein til RNA
- Sted rør til en magnetisk stand, vente 1 min og Fjern supernatanten.
- Tilsæt 50 µL af 20 mM Tris (pH 7,5) til perlerne og resuspend af pipettering. Sted rør til en magnetisk stand, vente 1 min og Fjern supernatanten. Gentag dette trin.
- Tilsæt 100 µL 1 x Protein-RNA binding buffer til perlerne og resuspend af pipettering.
- I mellemtiden, forberede følgende blanding: 10 µL af 10 x Protein-RNA binding buffer, 30 µL af 50% glycerol, 50 µg af cytoplasmatisk proteiner, og nukleasen-gratis vand op til 100 µL.
Bemærk: Forberede master mix B 3 prøver i overskud (3.3) som følger: 33 µL af 10 x Protein-RNA binding buffer, 99 µL af 50% glycerol, 165 µg cytoplasmatisk proteiner og nukleasen-gratis vand op til 330 µL. holde røret af master mix B på is. - Sted rør til magnetiske stand, vente 1 min og indsamle supernatanten. Tilsæt 100 µL af master mix B, resuspend af pipettering forsigtigt op og ned, og undgå at skabe bobler. Inkuber reaktion rør for 60 min. ved 4 ° C på en rulle.
-
Vask og eluering
- Sted rør til en magnetisk stand, indsamle supernatanten (der er flow gennem - FT) og overføres til en ny tube.
Bemærk: Hold denne FT på is til senere analyse. - Afpipetteres 100 µL 1 x vaskebuffer på perlerne, resuspend forsigtigt, sættes tilbage i den magnetiske stå, vente 1 min, og supernatanten. Gentag dette trin 2 gange.
- Tilføje 40 µL af eluering Buffer til de magnetiske perler, mix af pipettering op og ned, og der inkuberes ved 37 ° C på en tube shaker (950 rpm) i 30 min.
- Sted rør til en magnetisk stand, vente 1 min og indsamle elueret stikprøven, (hvilket er eluatet - E). Anbring på is og bruge downstream analyse.
Bemærk: På dette trin, hver testet RNA sonden består af en gennemstrømnings (FT), og eluatet (E) prøven.
- Sted rør til en magnetisk stand, indsamle supernatanten (der er flow gennem - FT) og overføres til en ny tube.
4. polyacrylamid elektroforese og Western Blot analyse
Bemærk: Se tabel 2 for opskrifter til buffere anvendes i dette afsnit. Udføre en Western skamplet ifølge Laemmli metode12.
- Handcast 12% SDS-PAGE geler (10-brønde, 1,5 mm spacer, 66 µL). Forberede en kørende gel mix: 4 mL 30% acrylamid-bisacrylamide stamopløsning, 2,4 mL af lavere Tris buffer, 3,2 mL af dH2O, 9,6 µL af TEMED, 96 µL af 10% ammonium persulfat løsning (APS). Forberede stabling gel mix: 3.25 mL af dH2O, 0,5 mL 30% acrylamid - bisacrylamide stamopløsning, 1,3 mL af øvre Tris buffer, 10 µL af TEMED, 20 µL af 10% APS.
- Tilføje 16,6 µL af 6 x Laemmli buffer (f.eks., 14 mL af Tris/HCl/SDS pH 6,8 (øvre Tris buffer), 2 g af SDS, 1.86 g af DTT, 6 mL glycerol og 0,012% bromophenol blå; opbevares ved-20 ° C) i eksemplet FT og 6,6 µL af 6 x Laemmli buffer i E prøve. Inkuber prøver i 5 min. ved 95 ° C.
- Indlæse prøver (20 µL af FT og hele elueres ~ 40 µL) og køre dem for 30 min. ved 60 V, fortsætter med 20 V natten over.
- Ved hjælp af en semi-tør electroblotting system, Overfør proteiner på en PVDF membran for 80 min. ved 15 V.
Bemærk: PVDF membran skal være aktiveret, før du udfører protein overførsel. Inkuber membran i 100% methanol for 1 min, efterfulgt af en 2 min inkubation i ultrarent vand. - Inkuber SDS-PAGE gel med Coomassie løsning for 3 timer, efterfulgt af tre trin af vask med ultrarent vand, hvert 30 min efter overførsel protein.
- Lade PVDF membranen tør for 1 h. genaktivere membranen som angivet i trin 4,5 efter protein overførsel. Blokere membran 1 t med 5% BSA i 1 x TTBS.
- Inkuber membran med den første antistof: HuR eller mesothelin, begge fortyndet 1:1000 i 5% BSA i 1 x TTBS i 4 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Vask membran tre gange i 7 min. i 1 x TTBS, og der inkuberes med kanin anti-mus peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundær antistof fortyndet 1:10,000 i 5% BSA, 1 x TTBS.
- Visualisere proteiner ved hjælp af forbedrede chemiluminescence og en digital imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette eksperiment, blev en 25-nt lang fragment af calretinin 3' UTR husly er motiv (CALB2 3' UTR (er) 25-nt) brugt til at teste, om det binder sig specifikt til den menneskelige-antigen Rasmussen (HuR) protein, en kendt mRNA stabilisator. For at teste specificiteten af elementet er, en 25-nt RNA var sonden CALB2 3' UTR (mtARE) indeholdende en er-motiv mutation, som tidligere blev vist at afskaffe stabilisering effekten er motiv, brugte6. Den tredje RNA sonde repræsenterer den negative kontrol, som er en 28-nt uafhængige RNA, der indeholder de veldefinerede jern-responderende element (uafhængige RNA (IRE)), kendt for at binde cytosole jern-responderende protein13,14. Da HuR er overvejende lokaliseret i kernen men funktioner som et mRNA-stabilisator i cytosol15, blev nukleare/cytosole udvinding udført for at få aktive proteiner fra cytosol.
For at bevise renheden af de nukleare/cytosole fraktioner, blev proteiner analyseret af vestlige skamplet, som viste, at α-tubulin blev kun fundet i det cytosole fraktion, mens PARP protein blev opdaget kun i den nukleare fraktion, som forventede ( Figur 1). Eluatet fra CALB2 3' UTR er-sonde demonstreret binding af HuR HuR var fraværende i eluatet fra muterede probe CALB 3' UTR (mtARE). HuR også var fraværende i eluatet fra ikke-forretningsmæssigt forbundne RNA sonden, som binder jern-responderende protein (figur 2A). Yderligere viser specificitet mellem CALB 3' UTR (er) og HuR, blev membranen desuden aftestede med anti-mesothelin (MSLN) antistof, som dette protein ikke interagerer med RNA. Eluater fra alle tre prøver viste ingen tilstedeværelse af mesothelin. Tilsammen, angiver, at de stabiliserende er motiv i CALB2 3' UTR specifikt kan binde HuR protein.
Coomassie farvning af gel (figur 2B) viser, at lige store mængder af proteiner blev anvendt til at udruge med de tre forskellige RNA-sonder. På grund af lavt beløb af cytosole ekstrakt bruges og overførsel til membranen, gav denne farvning ikke mulighed for påvisning af proteiner i eluatet (E) baner, som ellers blev opdaget af Western blot analyse.
Figur 1: Western blot analyse af 5 µg cytosole og nukleare proteinfraktion. PARP protein er til stede i den nukleare fraktion (N) men fraværende i det cytosole (C) brøkdel. Α-tubulin er til stede i det cytosole brøkdel (C) men fraværende i den nukleare fraktion (N). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vestlige skamplet viser at HuR er fanget af 25-nt CALB2 3' UTR (er). A) FT: flow gennem efter inkubation med RNA sonde; E: proteiner elueres ved inkubation og binding til RNA sonder. Sonder: CALB2 3' UTR (mtARE) - 25-nt fragment af calretinin 3' UTR, der indeholder 3 muterede nukleotider i er motiv; UR RNA (IRE) - 28-nt RNA sonde med et veldefineret jern-responderende element, der binder de jern-responderende proteiner. Membranen blev yderligere aftestede for mesothelin (MSLN), et protein, der ikke interagerer med RNA. B) Coomassie farvning af gel efter protein overførsel, demonstrerer, at lige store mængder af proteiner var inkuberes med RNA sonder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| RNA sonde | Sekvens | Koncentration |
| CALB2 3' UTR (er) 25nt | UCGCUGUAUGAUUUAGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| CALB2 3' UTR (mtARE) 25nt | UCGCUGUAUGGUCUGGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| Uafhængige RNA - IRE 28nt | UCCUGCUUCAACAGUGCUUGGACGGAAC | 10 ΜM |
Tabel 1 : Sekvenser af RNA sonder
| Lavere Tris buffer til at køre gel | |
| 1.5 M | Tris Base |
| 0,40% | SDS løsning |
| addjust pH til 8,8 bruger HCL (6 mol/L) | |
| Fyld med | dH2O |
| Øvre Tris for stabling gel SDS-PAGE | |
| 500 mM | Tris base |
| 0,4% | SDS løsning |
| Justere pH på 6.8 brug af HCL (6 mol/L) | |
| Fyld med | dH2O |
| 10 x løb buffer | |
| 250 mM | Tris base |
| 1.92 M | Glycin |
| Justere pH til 8,3 ved hjælp af HCL (6 mol/L) | |
| Fyld med | dH2O |
| Filter eller autoklave, og opbevares ved 4° C | |
| 1 X kører buffer | |
| 100 mL | 10 x løb buffer |
| 0,05% | SDS løsning |
| Fylde op til 1 L med | dH2O |
| 10 x overførsel Buffer | |
| 480 mM | Tris base |
| 390 mM | Glycin |
| 0,38% | SDS løsning |
| Fyld med | dH2O |
| Bemærk: Filtrere 0,22 um og opbevares ved 4 ° C | |
| 1 X overføre buffer (for semi-tør system) | |
| 20 mL | 10 x overførsel Buffer |
| 40 mL | methanol |
| Fyld op til 200 mL | dH20 |
| 10 X TBS (Tris-bufferet saltvand) | |
| 250 mM | Tris base |
| 1.36 M | NaCl |
| 27 mM | KCl |
| Justere pH 7,4 | |
| Fyld med | dH2O |
| Filter | |
| 1 X TTBS (Tris-buffer saltvand med 0,1 Tween-20) | |
| 1 X | 10 X TBS |
| 0,10% | Tween-20 |
| Fyld med | dH2O |
| RNA indfangning Buffer (1 X) | |
| 20 mM | Tris (pH 7,5) |
| 1 M | NaCl |
| 1 mM | EDTA |
| Protein-RNA Binding Buffer (10 x) | |
| 200 mM | Tris (pH 7,5) |
| 500 mM | NaCl |
| 20 mM | MgCl2 |
| 1% | Tween-20 |
| Vaske Buffer (1 x) | |
| 20 mM | Tris (pH 7,5) |
| 10 mM | NaCl |
| 0,1% | Tween-20 |
| Eluering Buffer | |
| 4 mM | Biotin |
| 20 mM | Tris (pH 7,5) |
| 50 mM | NaCl |
| Coomassie løsning | |
| 0,02% | Coomassie G-250 |
| 5% | Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrat |
| 10% | EtOH |
| 2% | ortho-phosphorsyre syre |
Tabel 2: Opskrifter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3' UTRs tilhører ikke-kodende genom3, og alle ikke-kodende RNA'er kan interagere med proteiner for at udøve deres funktion7. Når det mammale genom blev anset for at være korrekt transskriberet og produceret en betydelig del af lange noncoding RNA'er16, viste nye beviser, at disse lange-noncoding RNA'er fungere i reguleringen genekspression som de interagerer med kromatin-remodeling komplekser17. Denne viden blev opnået ved at udnytte RNA-pulldown assay. Således kunne det første skridt for at begynde at decifrere interactors af en bestemt RNA, være i vitro biokemiske assays såsom RNA-pulldown, som den er enkel at udføre.
Bemærk spiller ikke kun sekvens motiver, men også de sekundære struktur af RNA en afgørende rolle i RNA funktionalitet som de udgør domæner væsentlige for at interagere med proteiner. Sekundær struktur kan variere i fysiologiske og in vitro- betingelser, og RNA-pulldown kan føre til identifikation af falsepositives. For eksempel, RNA-pulldown identificeret EZH2, en komponent af polycomb repressive komplekse 2 (PRC2), som en dataflowdiagrammer af X inaktive specifikke udskrift (Xist)18, der henviser til, at en nylig undersøgelse, der brugte RNA antisense rensning kombineret med masse massespektrometri (RAP-MS) identificeret andre interactors såsom SHARP (SMRT og HDAC forbundet repressor protein), SAF-1 (stillads vedhæftet fil faktor A) og LBR (lamin B receptor)19. Derfor, hvis ingen andre funktionelle tests støtte samspillet mellem en RNA og et bestemt protein, resultaterne skal yderligere suppleres med en supplerende protein-centreret tilgang, såsom immunoprecipitating den givne protein, efterfulgt af udvinding og karakterisering af den bundne RNA.
De heri protokol fremlagde er blevet brugt til at registrere HuR binding til er motivet i CALB2 3' UTR, som tidligere havde været funktionelt karakteriseret ved pmiRGLO-luciferase assay6. På grund af den lille mængde proteiner er denne protokol ikke egnet til downstream analyse såsom massespektrometri hvor større protein beløb er nødvendige. I stedet kan protokollen bruges til at forny RNA-interactors identificeret ved massespektrometri, men ved hjælp af en betydeligt lavere mængde af proteiner.
Da metoden omfatter arbejde med RNA, som er modtagelige for nedbrydning, anbefaler vi, at rengøring arbejdsflader med en RNase-dekontaminering løsning ud over standard god laboratoriepraksis. Hvis det er muligt, udføre forberedelse af RNA mærkning og rensning under laminar flow. Renheden af RNA oligo kan også påvirke de bindende betingelser; således var de kommercielt syntetiserede sonder HPLC renset. Hvis modificerede, længere og meget ren RNA oligos er påkrævet, skal du bruge side rensning metode. Forberede delprøver af native proteiner af snap frysning, derfor at undgå beskadigelse af proteiner på grund af langsom indefrysning tilgang og gentagen nedfrysning og optøning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den schweiziske National Science Foundation Sinergia grant CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung og Zürich Krebsliga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | - | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - α - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin - streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | - | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | - | the synthesis scale - 0.04 µmol - HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 - 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
References
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
- von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
- Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
- Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013).
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
- Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
- Morris, K. V., Mattick, J. S.
- Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
