Summary
Desthiobiotin etichettatura di un sintetico oligo RNA 25 nucleotidi, che contiene un motivo di elemento ricco di adenina (ARE), permette di grippaggio specifico di proteina citosolica sono vincolanti.
Abstract
Lo in vitro RNA-pulldown è ancora largamente utilizzato nei primi passi di protocolli volti ad identificare RNA-binding proteins che riconoscere specifici RNA strutture e motivi. In questo protocollo RNA-pulldown, commercialmente sintetizzato le sonde del RNA sono etichettate con una forma modificata di biotina, desthiobiotin, all'estremità 3' del filamento di RNA, che si lega reversibilmente al streptavidina e permette così di eluizione delle proteine sotto più fisiologico condizioni. il RNA-desthiobiotin è immobilizzato tramite interazione con streptavidina su biglie magnetiche, che vengono utilizzati per abbattere le proteine che interagiscono specificamente con il RNA di interesse. Proteine non denaturate e attive da frazione citosolica delle cellule di mesotelioma sono utilizzate come fonte di proteine. Il metodo qui descritto può essere applicato per rilevare l'interazione tra proteine RNA associazione di note e una sonda 25 nucleotidi (nt) lunga RNA contenente una sequenza di interesse. Questo è utile per completare la caratterizzazione funzionale di stabilizzare o destabilizzare gli elementi presenti nelle molecole di RNA ottenute utilizzando un'analisi di vettore reporter.
Introduction
Espressione genica e il livello finale del prodotto del gene può essere strettamente regolate che interessano la stabilità del mRNA e mRNA traduzione tasso1. Questi meccanismi di regolazione post-trascrizionali sono esercitati attraverso le interazioni di non codificanti proteine RNA e/o RNA-binding (RBPs) con mRNA mirati. È solitamente la regione non tradotta 3' del mRNA (3' UTR - appartenendo alla parte non codificante del genoma2) che contiene specifiche cis-elementi regolatori (CRE), che sono riconosciuti da trans-in qualità di fattori quali miRNA o RBPs 3. la migliore studiati cis-elemento all'interno di 3' UTR, è il motivo di elemento ricco di adenina (ARE), che è riconosciuto da specifiche proteine che legano il AU (AUBP) e, a sua volta, induce la degradazione sia mRNA/deadenylation (decadimento sono-mediata) o mRNA stabilizzazione4.
La dimensione del 3' UTR di calretinina mRNA (CALB2) è 573 bp lungo e contiene un pentamero AUUUA putativo, come predetto da AREsite2, un tool di bioinformatic5. Coerente con la presenza di un motivo sono presunto, l'analisi di vettore-reporter di pmirGLO ha dimostrato un ruolo di stabilizzazione di questo elemento all'interno di mRNA di CALB26. Infine, l' in vitro RNA-pulldown è stato utilizzato per identificare il AUBP che stabilizza calretinina mRNA attraverso il motivo sono.
Poiché tutti gli RNA non codificanti interagisce con proteine7, lo in vitro RNA-pulldown è un buon modo e analisi prima della scelta per l'identificazione di interattori di RNA per aiutare a decifrare i meccanismi molecolari. In questo metodo di RNA-pulldown, commercialmente sintetizzato le sonde del RNA, che sono state etichettate con una forma modificata di biotina (desthiobiotin) all'estremità 3' del filamento di RNA, sono state utilizzate. il RNA-desthiobiotin è immobilizzato tramite interazione con streptavidina su biglie magnetiche, che vengono utilizzati per abbattere le proteine che interagiscono specificamente con l'associazione-RNA di interesse. Proteine non denaturate e attive da frazione citosolica delle cellule di mesotelioma sono utilizzate come fonte di proteine. Tali RNA-proteine vengono eluite dai branelli magnetici, eseguire attraverso un gel di SDS-PAGE 12%, trasferito ad una membrana e sondato con anticorpi differenti.
Nella procedura di purificazione di affinità standard streptavidina-biotina, denaturazione dura condizioni sono necessarie per interrompere il legame biotina-streptavidina irreversibile forte per eluire le proteine rilegate8, che potrebbe portare alla dissociazione di complessi proteici. A differenza di biotina, desthiobiotin reversibilmente si lega alla streptavidina e competitivo è spostata con una soluzione tamponata di biotina, consentendo per la delicata eluizione delle proteine ed evitando l'isolamento di naturalmente biotinilati molecole9, suggerendo che la tecnica è ideale per isolare i complessi della proteina nativa in condizioni native.
In vitro condizioni vincolanti e rigore, che sono determinate dalla concentrazione salina, agenti riducenti e percentuale di detergente, dovrebbe essere vicine a quelle presenti nel contesto del cellulare al fine di identificare le interazioni vere in vivo . Le condizioni di associazione implementate nel presente documento sono state dimostrate in precedenza come appropriato per l'identificazione del HuR come un AU-binding protein10. Questo approccio potrebbe risparmiare tempo, poiché l'ottimizzazione delle condizioni di associazione corretto può essere lungo e impegnativo. Inoltre, questo metodo potrebbe essere usato come un protocollo di partenza per qualsiasi esperimento di RNA-pulldown e può essere ottimizzato gradualmente cambiando la concentrazione di sali e detergenti, modificando la percentuale di glicerolo, e aggiungendo altri sali. Inoltre, abbiamo dimostrato che anche una breve 25 nucleotidi RNA-sonda che harboring un pentamero sono-motivo poteva essere utilizzato per dimostrare l'interazione con un AUBP specifico.
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Protocol
1. preparazione di frazione delle proteine citosoliche e nucleari
- Piatto 4 x 106 ACC-MESO-4 cellule in un matraccio di cultura cellulare T150 coltivate in RPMI - 1640 medio completati con 10% FBS, 1 x penicillina/streptomicina (100x) e 2 mM L-Glutammina (200 mM). Quando le cellule raggiungono una confluenza di 80-90% (~5-5.5 x 106 cellule), procedere con estrazione della proteina della frazione citosolica e nucleare.
Nota: ACC-MESO-4 linea cellulare è stata ottenuta dal RIKEN BioResource centro11. - Medio di aspirare, lavare le cellule con l'aggiunta di 15 mL di PBS 1X, inclinare il piatto delicatamente un paio di volte e aspirare il PBS 1X. Aggiungere 3 mL di 0,25% tripsina-EDTA e incubare la beuta di coltura a 37 ° C per 3 min.
Nota: Esaminare le cellule sotto il microscopio per distacco; Se ancora attaccato tocca il pallone contro il palmo di una mano 3 volte. - Aggiungere 7 mL di RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 1x penicillina/streptomicina (100x) e 2 mM L-Glutammina (200 mM), raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL e spin giù a 200 x g per 5 min.
- Aspirare il medio e risospendere il pellet cellulare con 1,5 mL di 1X PBS, quindi trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Rotazione verso il basso a 500 x g e a 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante.
Nota: Da questo punto in poi, eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 4 ° C e mantenere tutti i reagenti sul ghiaccio. - Risospendere il pellet cellulare con gelida 1,5 mL di 1X PBS e spin-down le cellule a 500 x g e a 4 ° C per 3 min. scartare il surnatante.
Nota: Le quantità necessarie di CER I, CER II e reagenti NER sono 10, 0.55 e 5 volumi di pellet cellulare stimato pranzo volume, rispettivamente; il seguente protocollo presuppone un volume di 20 µ l. Si consiglia di preparare solo la quantità necessaria di reagente CER io. - Aggiungere 200 µ l di reagente di estrazione citoplasmico ghiacciata (CER mi) completati con 2 µ l di 1x inibitore della proteinasi, ad es., diluire 1 compressa dell'inibitore di proteasi (privo di EDTA) in 500 µ l di acqua per ottenere stock x 100. Questa quantità di reagente CER basterà lisare 20 µ l di un pellet cellulare imballato volume.
- Per stimare il volume di pellet imballato delle cellule, confrontare la provetta contenente il pellet cellulare con un tubo di 1,5 mL riempito con 10, 20, 50 o 100 µ l di PBS 1X.
- Risospendere il pellet cellulare vigorosamente nel Vortex il tubo per 15 s e incubare la provetta in ghiaccio per 10 min aggiungere 11 µ l di reagente di estrazione citoplasmico ghiacciata II (CER II) al tubo, vigorosamente vortex per 5 s e incubare 1 min sul ghiaccio.
- Agitare vigorosamente per 5 s e centrifugare la provetta a 16.000 x g e 4 ° C per 5 min. trasferire il surnatante nella provetta pre-refrigerata pulita sul ghiaccio. Il supernatante è la frazione citoplasmatica che è ulteriormente utilizzato nell'esperimento RNA-pulldown.
- Risospendere in 100 µ l di reagente di estrazione nucleare ghiacciata (NER) completati con 1 µ l di inibitore della proteinasi (100x) e vigorosamente vortex per 15 s. Si consiglia di preparare solo la quantità necessaria di reagente NER completati con inibitori della proteasi.
- Incubare il campione in ghiaccio per 40 min con occasionali su vortex per 15 s (ogni 10 min).
- Centrifugare la provetta a 16.000 x g per 10 min trasferimento il surnatante (questa è la frazione di proteina nucleare) in una provetta pulita pre-refrigerata.
- Procedere immediatamente misurando la concentrazione di proteine mediante il metodo bicinconinico (BCA) (Vedi Tabella materiali). Per controllare per la purezza della proteina di ogni frazione, eseguire immunoblotting (Figura 1) contro Poli ADP-ribosio polimerasi - PARP (rilevamento positivo solo nella frazione nucleare) e α-tubulina (rilevamento positivo solo nella frazione citosolica). Per la visualizzazione di proteine, fare riferimento alla sezione 4.
- Al fine di mantenere l'attività della proteina e loro stato nativo, preparare 25 µ l di aliquote di estratti citosolici e nucleari. Snap-congelare queste aliquote ponendoli in azoto liquido per 5 s e direttamente a-80 ° C.
2. etichettatura di RNA con Desthiobiotin
- Le sonde del RNA sintetizzato commercialmente e HPLC purificato. Risospendere con acqua priva di nucleasi a 10 µM.
Nota: La sonda sequenze sono elencati nella tabella 1. - Utilizzare 50 pmoli di RNA per reazione di RNA-pulldown. Scongelare e conservare tutti i reagenti su ghiaccio tranne per PEG 30%, utilizzato con etichetta 3' capolinea del RNA oligo.
- Trasferire 5 µ l di 10 µM le sonde del RNA, etichettato come CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) e nessuna relazione-RNA (IRE), in 0,5 mL a parete sottile microcentrifuga tubi e procedere all'incubazione in una macchina PCR a 85 ° C per 5 min. Posizionare i tubi immediatamente sul ghiaccio.
Nota: Questo passaggio è importante, in quanto favorisce il rilassamento e l'accessibilità della sonda RNA per l'etichettatura. - Per una singola reazione di 30 µ l, aggiungere alla provetta contenente RNA la seguente miscela di 10 µ l: 3 µ l di acqua libera nucleasi, 3 µ l di tampone di reazione ligasi di RNA, 1 µ l di RNAsi inibitore 10x (40 U / µ l), 1 µ l di Desthiobiotinylated citidina bisfosfato (1 mM) e 2 µ l di ligasi T4 RNA (20 U / µ l).
Nota: Per preparare mix master A 3 campioni in eccesso (3.2), mescolare acqua gratuita, 9,6 µ l di tampone di reazione ligasi di RNA, 3,2 µ l di RNAsi inibitore 10x 9.6 µ l di nucleasi (40 U / µ l), 3,2 µ l di Desthiobiotinylated citidina bisfosfato (1 mM) e 6,4 µ l della ligasi T4 RNA (20 U / µ l). - Aggiungere attentamente 15 µ l di PEG 30% alla reazione. Utilizzare un altro suggerimento per mescolare la reazione. Incubare la reazione durante la notte a 16 ° C.
- Il giorno successivo, preparare quanto segue: 5 M di NaCl (fresco/nucleasi-free), cloroformio: alcool isoamilico in rapporto 24:1 (ad esempio, per reazione - 96 µ l cloroformio e 4 µ l di alcool isoamilico), ghiacciata 100% etanolo e ghiacciata etanolo al 70%.
- Aggiungere 70 µ l di acqua priva di nucleasi per le provette di reazione RNA-etichettatura. Aggiungere 100 µ l di cloroformio: isoamil alcool e agitare brevemente. Rallentamento a 13.000 x g per 3 minuti, rimuovere con attenzione solo la fase superiore e il trasferimento ad un nuovo tubo privo di nucleasi 1,5 mL; evitare di toccare la fase inferiore.
- Aggiungere 10 µ l di 5m NaCl, 1 µ l di glicogeno e 300 µ l di etanolo al 100% ghiacciata. Posizionare il tubo a-20 ° C per 2 h.
Nota: In questa fase, l'esperimento può essere continuato il giorno seguente. - Centrifugare a 13.000 x g e a 4 ° C per 15 min., attentamente, scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. Aggiungere 300 µ l di etanolo al 70% ghiacciata e centrifugare nuovamente a 13.000 x g e a 4 ° C per 5 min.
- Scartare il surnatante completamente e asciugare il pellet (15 min). Risospendere il pellet in 20 µ l di acqua priva di nucleasi.
Nota: Procedere con RNA-pulldown nello stesso giorno. - Incubare il RNA a 90 ° C per 2 min e metterli su ghiaccio. Mettere il RNA etichettati sul ghiaccio durante il passaggio seguente di prelavaggio dei branelli magnetici streptavidina.
Nota: Un tempo di incubazione più lungo potrebbe danneggiare la sonda RNA.
3. RNA-proteina Pulldown
-
Prelavaggio biglie streptavidin-magnetiche e incubazione con desthiobiotin-RNA
- Utilizzare 50 µ l di streptavidina perline magnetico per 50 pmol RNA. Tuttavia, questo dovrebbe essere ottimizzato a seconda dell'esperimento.
- Vortice il tubo con perline streptavidina-magnetiche per 15 s e rapidamente rimuovere 200 µ l (mix master; abbastanza per reazioni di 3 + 1) in un tubo di sicurezza bloccaggio pulito 1,5 mL utilizzando taglia punte di pipetta. Posizionare il tubo su un supporto magnetico in modo che le perline raccolgono sul lato del tubo e attendere 1 minuto Rimuovi il liquido di risospensione.
- Lavare le perle, togliere il tubo dal supporto magnetico, aggiungere 400 µ l di 0.1 M NaOH 0,05 M NaCl soluzione e delicatamente dispensare su e giù più volte. Riposizionare il tubo sul supporto magnetico. Attendere 1 minuto e raccogliere il surnatante. Ripetere questo passaggio.
- Lavare le perle con 200 µ l di NaCl 100 mM. Eliminare il surnatante.
- Aggiungere 200 µ l di 20 mM Tris (pH 7.5), risospendere perline pipettando, posizionare il tubo sul supporto magnetico, attendere per 1 min e rimuovere il surnatante. Ripetere il passaggio.
- Togliere il tubo dal supporto magnetico, aggiungere 200 µ l di buffer di acquisizione di RNA: 1x e risospendere le microsfere magnetiche streptavidina brevemente nel Vortex. Rimuovere 50 µ l di biglie magnetiche streptavidina e aggiungere ad ogni provetta etichettata-RNA utilizzando un puntale di taglio. Incubare le provette per 30 min a temperatura ambiente su un rullo.
-
Grippaggio della proteina al RNA
- Disporre le provette in un supporto magnetico, attendere 1 min e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 50 µ l di 20 mM Tris (pH 7,5) ai talloni e risospendere pipettando. Disporre le provette in un supporto magnetico, attendere 1 min e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio.
- Aggiungere 100 µ l di tampone di legame proteina-RNA 1x ai talloni e risospendere pipettando.
- Nel frattempo, preparare la seguente miscela: 10 µ l di 10x buffer obbligatorio della proteina-RNA, 30 µ l di glicerolo al 50%, 50 µ g di proteine citoplasmatiche e nucleasi-free fino a 100 µ l di acqua.
Nota: Preparare mix master B per 3 campioni in eccesso (3.3) come segue: 33 µ l di tampone di legame proteina-RNA 10x, 99 µ l di glicerolo al 50%, 165 µ g di proteine citoplasmatiche e acqua priva di nucleasi fino a 330 µ l. tenere il tubo di mix master B sul ghiaccio. - Inserire i tubi di supporto magnetico, attendere 1 minuto e raccogliere il surnatante. Aggiungere 100 µ l di master mix B, risospendere pipettando delicatamente su e giù ed evitare di creare bolle. Incubare le provette di reazione per 60 min a 4 ° C su un rullo.
-
Lavaggio ed eluizione
- Disporre le provette in un supporto magnetico, raccogliere il surnatante (che è il flusso attraverso - FT) e trasferire in una nuova provetta.
Nota: Mantenere questa FT sul ghiaccio per un'analisi successiva. - Pipettare 100 µ l di tampone di lavaggio sui branelli: 1x, Risospendere delicatamente, rimettere il supporto magnetico, attendere 1 minuto e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio 2 volte.
- Aggiungere 40 µ l di tampone di eluizione ai branelli magnetici, Miscelare pipettando su e giù e incubare a 37 ° C in un agitatore di tubo (950 giri/min) per 30 min.
- Posizionare i tubi in un supporto magnetico, attendere 1 minuto e raccogliere eluito campione (che è eluito - E). Posizionare sul ghiaccio e utilizzare per analisi a valle.
Nota: In questa fase, ogni testata sonda RNA consiste di un flusso continuo (FT) e campione eluito (E).
- Disporre le provette in un supporto magnetico, raccogliere il surnatante (che è il flusso attraverso - FT) e trasferire in una nuova provetta.
4. analisi della macchia occidentale e poliacrilammide elettroforesi
Nota: Vedere la tabella 2 per le ricette per i buffer utilizzati in questa sezione. Eseguire un Western blot secondo il metodo di Laemmli12.
- Handcast 12% gel di SDS-PAGE (10-pozzi, spessore 1,5 mm., 66 µ l). Preparare una miscela di gel in esecuzione: 4 mL di soluzione madre di 30% acrilammide-bisacrylamide, 2,4 mL di Tris più basso del buffer, 3,2 mL di dH2O, 9,6 µ l di TEMED, 96 µ l di soluzione di 10% ammonio persolfato (APS). Preparare la miscela di gel di impilamento: 3,25 mL di dH2O, 0,5 mL di 30% acrilammide - soluzione bisacrylamide, 1,3 mL di tampone Tris superiore, 10 µ l di TEMED, 20 µ l di 10% di APS.
- Aggiungere 16,6 µ l di tampone x Laemmli 6 (ad esempio, 14 mL a pH 6.8 Tris/HCl/SDS (tampone Tris superiore), 2 g di SDS, 1,86 g di DTT, 6 mL di glicerolo e 0.012% bromofenolo; conservati a-20 ° C) nel campione FT e 6,6 µ l del 6 x Laemmli buffer nel campione E. Incubare i campioni per 5 min a 95 ° C.
- Caricare i campioni (20 µ l di FT e intera eluire ~ 40 µ l) ed eseguirli per 30 min a 60 V, continuando con 20 V durante la notte.
- Utilizzando un sistema semi-secco electroblotting, trasferire proteine su una membrana PVDF per 80 minuti a 15 V.
Nota: La membrana PVDF deve essere attivata prima di eseguire il trasferimento di proteine. Incubare la membrana in metanolo al 100% per 1 min, seguita da un'incubazione di 2 min in acqua ultrapura. - Dopo il trasferimento di proteine, incubare il gel di SDS-PAGE con Coomassie soluzione per 3 h, seguito da tre fasi di lavaggio con acqua ultrapura, ogni 30 min.
- Alla fine del trasferimento di proteina, lasciate la membrana PVDF asciugare per 1 h. riattivare la membrana come indicato al punto 4.5. Bloccare la membrana 1 h con 5% BSA in 1 x TTBS.
- Incubare la membrana con il primo anticorpo: HuR o mesotelina, entrambi diluiti 1: 1000 in 5% BSA in 1 x TTBS per 4 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
- Lavare la membrana tre volte per 7 min in 1 x TTBS e incubare coniglio anti-topo alla perossidasi di rafano (HRP)-anticorpo secondario coniugato diluito 1: 10.000 in 5% BSA, 1 x TTBS.
- Visualizzare le proteine usando chemiluminescenza e un dispositivo di imaging digitale.
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Representative Results
In questo esperimento, un frammento lungo 25-nt di calretinin 3' UTR harboring sono motivo (CALB2 3' UTR (ARE) 25-nt) è stato utilizzato per verificare se si lega specificamente alla proteina umana-antigene R (HuR), un noto stabilizzatore di mRNA. Per verificare la specificità dell'elemento sono, un RNA 25-nt sonda CALB2 3' UTR (mtARE) contenente una mutazione sono-motivo, che precedentemente è stata indicata ad abolire l'effetto di stabilizzazione del motivo sono, era usato6. il RNA terzo sonda rappresenta il controllo negativo, che è un 28-nt estranei RNA che contiene l'elemento ferro-reattivo ben definito (non correlati RNA (IRE)), conosciuto per legare la proteina ferro-reattiva citosolica13,14. Poiché HuR è prevalentemente localizzata all'interno del nucleo ma funzioni come mRNA-stabilizzatore nel cytosol15, estrazione citosolica/nucleare è stato effettuato per ottenere proteine attive dal cytosol.
Per dimostrare la purezza delle frazioni citosolica/nucleare, proteine sono state analizzate mediante Western blot, che ha mostrato che quello α-tubulina è stato rilevato solo nella frazione citosolica, mentre la proteina PARP è stata rilevata solo nella frazione nucleare, come anticipato ( Figura 1). L'eluato dal CALB2 3' UTR sono-sonda hanno dimostrato associazione di HuR mentre HuR era assente nell'eluito dal mutante sonda CALB 3' UTR (mtARE). HuR era anche assente nell'eluito dalla sonda RNA estraneo che lega la proteina ferro-sensible a reagire (Figura 2A). Per illustrare ulteriormente la specificità tra la CALB 3' UTR (ARE) e HuR, la membrana è stata inoltre sondata con anticorpo anti-mesotelina (MSLN), come questa proteina non interagire con il RNA. Eluati da tutti e tre i campioni hanno mostrato nessuna presenza di mesotelina. Presi insieme, questo indica che lo stabilizzazione sono motivo all'interno di CALB2 3' UTR può legano specificamente HuR proteina.
Coomassie macchiatura del gel (Figura 2B) dimostra che uguali quantità di proteine sono stati utilizzati per incubare con le tre diverse sonde di RNA. A causa della bassa quantità di Estratto citosolico utilizzato e trasferimento alla membrana, questa colorazione non ha consentito per la rilevazione delle proteine nell'eluito corsie (E), che altrimenti sono state rilevate dall'analisi Western blot.
Figura 1: analisi di Western blot di 5 µ g di proteine citosoliche e nucleari. La proteina PARP è presente nella frazione nucleare (N), ma assente dalla frazione citosolica (C). Α-tubulina è presente nella frazione citosolica (C), ma assente nella frazione nucleare (N). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Western blot viene illustrato che HuR è catturato da 25-nt CALB2 3' UTR (ARE). A) FT: fluire attraverso dopo incubazione con sonda RNA; E: proteine eluite sopra incubazione e sonde di legame al RNA. Sonde: CALB2 3' UTR (mtARE) - frammento 25-nt di calretinin 3' UTR che contiene 3 nucleotidi mutati all'interno del motivo sono; UR RNA (IRE) - sonda RNA 28-nt con un ben definito elemento ferro-sensible a reagire che lega le proteine ferro-sensible a reagire. La membrana è stata ulteriormente sondata per mesotelina (MSLN), una proteina che non interagisce con RNA. B) sonde di Coomassie macchiatura del gel dopo il trasferimento della proteina, dimostrando che la stessa quantità di proteine sono state incubate con RNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Sonda del RNA | Sequenza | Concentrazione |
| CALB2 3' UTR (ARE) 25nt | UCGCUGUAUGAUUUAGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| CALB2 3' UTR (mtARE) 25nt | UCGCUGUAUGGUCUGGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| Indipendenti di RNA - IRE 28nt | UCCUGCUUCAACAGUGCUUGGACGGAAC | 10 ΜM |
Tabella 1 : Sonde di sequenze di RNA
| Tampone Tris inferiore per l'esecuzione di gel | |
| 1.5 M | Tris Base |
| 0,40% | Soluzione di SDS |
| addjust pH a 8,8 utilizzando HCL (6 mol/L) | |
| riempire con | dH2O |
| Tris superiore per l'impilamento del gel SDS-PAGE | |
| 500 mM | Tris base |
| 0,4% | Soluzione di SDS |
| Aggiustare il pH a 6,8 utilizzando HCL (6 mol/L) | |
| riempire con | dH2O |
| 10 x Running buffer | |
| 250 mM | Tris base |
| 1,92 M | Glicina |
| Regolare il pH a 8,3 utilizzando HCL (6 mol/L) | |
| riempire con | dH2O |
| Filtro o autoclave e conservare a 4° C | |
| 1 tampone di X in esecuzione | |
| 100 mL | 10 x Running buffer |
| 0.05% | Soluzione di SDS |
| Riempire fino a 1 L con | dH2O |
| 10X tampone di trasferimento | |
| 480 mM | Tris base |
| 390 mM | Glicina |
| 0,38% | Soluzione di SDS |
| riempire con | dH2O |
| Nota: Filtro 0.22 um e conservare a 4 ° C | |
| 1 X trasferimento buffer (per sistema semi-secco) | |
| 20 mL | 10X tampone di trasferimento |
| 40 mL | metanolo |
| riempire fino a 200 mL | dH20 |
| 10 X TBS (soluzione fisiologica tamponata) | |
| 250 mM | Tris base |
| 1.36 M | NaCl |
| 27 mM | KCl |
| Regolare il pH a 7,4 | |
| riempire con | dH2O |
| Filtro | |
| 1 X Immunotyping (soluzione salina tampone Tris con 0.1 Tween-20) | |
| 1 X | 10 X TBS |
| 0,10% | Tween-20 |
| riempire con | dH2O |
| Buffer di acquisizione di RNA (1 X) | |
| 20 mM | Tris (pH 7,5) |
| 2. | NaCl |
| 1 mM | EDTA |
| Proteina-RNA Binding Buffer (10x) | |
| 200 mM | Tris (pH 7,5) |
| 500 mM | NaCl |
| 20 mM | MgCl2 |
| 1% | Tween-20 |
| Tampone di lavaggio (1x) | |
| 20 mM | Tris (pH 7,5) |
| 10 mM | NaCl |
| 0,1% | Tween-20 |
| Tampone di eluizione | |
| 4 mM | biotina |
| 20 mM | Tris (pH 7,5) |
| 50 mM | NaCl |
| Soluzione di Coomassie | |
| 0,02% | G-250 di Coomassie |
| 5% | Aluminiumsulfate-(14-18)-idrato |
| 10% | EtOH |
| 2% | acido ortofosforico |
Tabella 2: Ricette
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Discussion
3' UTR appartengono al genoma non codificante3e tutti gli RNA non codificanti possa interagire con proteine al fine di esercitare la loro funzione7. Quando il genoma dei mammiferi è stato trovato per essere trascritto pervasively e prodotto una porzione significativa di lunghi non codificanti RNA16, emergenti evidenze hanno dimostrato che questi RNA non codificante lungo funzionano nella regolazione dell'espressione genica come essi interagiscono con complessi di rimodellamento della cromatina17. Questa conoscenza è stata acquisita utilizzando l'analisi di RNA-pulldown. Così, per iniziare a decifrare gli Interactiani di un RNA specifico, il primo passo potrebbe essere saggi biochimici in vitro come RNA-pulldown, come è semplice da eseguire.
Di nota, non solo motivi di sequenza, ma anche la struttura secondaria del RNA svolge un ruolo critico nella funzionalità di RNA come formano domini essenziali per l'interazione con le proteine. La struttura secondaria può variare in fisiologico e condizioni in vitro e RNA-pulldown possono condurre all'identificazione di falsepositives. Ad esempio, RNA-pulldown identificato EZH2, un componente di polycomb repressive complex 2 (PRC2), come un interactor di X inattivo trascrizione specifici (Xist)18, considerando che un recente studio che ha usato purificazione del RNA antisenso con massa la spettrometria (RAP-MS) identificato altri Interactiani come SHARP (SMRT e HDAC associata proteina repressore), SAF-1 (fattore di fissaggio ponteggio A) e LBR (recettore lamin B)19. Pertanto, se nessun altro test funzionale supporta l'interazione tra un RNA e una data proteina, i risultati dovrebbero essere ulteriormente completati con un approccio basato su proteina complementare, quali immunoprecipitating la proteina data, seguita da estrazione e caratterizzazione del RNA associato.
Il presente protocollo presentato è stato utilizzato per rilevare HuR associazione al motivo sono in CALB2 3' UTR, che precedentemente era stato funzionalmente caratterizzato da pmiRGLO-luciferase assay6. A causa della piccola quantità di proteine, questo protocollo non è adatto per l'analisi a valle come la spettrometria di massa dove sono necessarie grandi quantità di proteine. Invece, il protocollo utilizzabile per riconvalidare il RNA-interattori identificati mediante spettrometria di massa, ma utilizzando una quantità significativamente inferiore di proteine.
Poiché il metodo include il lavoro con RNA, che è suscettibile di degradazione, si consiglia di pulire le superfici di lavoro con una soluzione di decontaminazione di RNAsi oltre alle buone prassi di laboratorio standard. Se possibile, eseguire la preparazione di RNA di etichettatura e di purificazione sotto flusso laminare. La purezza dell'oligo RNA può anche influenzare le condizioni di associazione; così, le sonde commercialmente sintetizzate erano HPLC purificato. Se modificato, più a lungo ed estremamente puro RNA oligos sono necessari, utilizzare il metodo di purificazione di pagina. Preparare aliquote di proteine native da congelamento, evitando così danni delle proteine a causa del metodo di congelamento lento e ripetuti di congelamento e di scongelamento a scatto.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione Swiss National Science Foundation Sinergia CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung e Zürich Krebsliga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | - | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - α - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin - streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | - | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | - | the synthesis scale - 0.04 µmol - HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 - 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
References
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