Summary
Desthiobiotin bir adenin-zengini eleman (vardır) motifi içeren bir sentetik 25-nükleotit RNA oligo, etiketleme sitozolik vardır-bağlayıcı proteinin belirli bağlantı verir.
Abstract
Vitro RNA-açılan özel RNA yapıları ve motifleri tanımak RNA bağlanıcı proteinler belirlenmesi amaçlı iletişim kurallarının ilk adımda hala büyük ölçüde kullanılır. Bu RNA-açılan iletişim kuralında, biotin, desthiobiotin, 3' terminus streptavidin için geri döndürülebilir olarak bağlar ve böylece daha fazla altında proteinlerin elüsyon sağlayan RNA iplikçiğinin, değiştirilmiş bir formu ile ticari olarak sentezlenmiş RNA probları etiketlenir fizyolojik koşullar. RNA-desthiobiotin ile özellikle faiz RNA ile etkileşim proteinler aşağı çekmek için kullanılan manyetik boncuklar streptavidin etkileşimi aracılığıyla immobilize. Mesothelioma hücreleri sitozolik kısmını gelen sigara denatüre ve aktif proteinler, protein kaynağı olarak kullanılır. Burada anlatılan yöntem bilinen RNA proteinler ve bir faiz dizisini içeren 25-nükleotit (nt) uzun RNA prob arasındaki etkileşimi algılamaya uygulanır. Bu sabitleme veya öğeleri RNA molekülleri bir muhabir vektör tahlil kullanılarak elde mevcut istikrarsızlaştırıcı fonksiyonel karakterizasyonu tamamlamak yararlıdır.
Introduction
Gen ekspresyonu ve gen ürünü son seviyesi sıkıca mRNA kararlılığı ve mRNA çeviri hızı1etkileyen tarafından düzenlenmiş. Çoğu yasal mekanizmaların kodlamayan RNA ve/veya RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) etkileşimleri ile hedeflenen mRNA aracılığıyla sarf. Bu genellikle 3' Çevrilmeyen mRNA (3' UTR - genom2kodlamayan bölümüne ait) belirli CISiçeren bölgedir- transtarafından tanınan düzenleyici elemanlarının (CRE),-miRNA ya da RBPs gibi faktörler rol 3. en çok çalışılmış CIS-içinde 3' UTR, öğedir belirli AU bağlanıcı proteinler (AUBP) tarafından ve sırayla tanınır, adenin-zengini eleman (vardır) motifi neden olmaktadır ya mRNA bozulması/deadenylation (ARE-aracılı decay) veya mRNA sabitleme4.
Boyutu olduğunu 3' UTR'nin calretinin, mRNA (CALB2) 573 bp uzun ve AREsite2, bir bioinformatic araç5tarafından tahmin ettiği gibi sözde AUUUA pentamer içerir. Bir sözde olan motif varlığı ile tutarlı, pmirGLO vektör-muhabir tahlil bir istikrar rol CALB2 mRNA6içinde bu öğesinin gösterdi. Son olarak, vitro RNA-açılan calretinin stabilize AUBP tanımlamak için kullanılan olan motif aracılığıyla mRNA.
Tüm kodlamayan RNA'ların proteinler7ile etkileşim, vitro RNA-açılan bir iyi yolu ve RNA-interactors tanımlamak için seçim ilk tahlil moleküler mekanizmaları çözmekte yardımcı olmak için çünkü. Bu RNA-açılan yönteminde biotin (desthiobiotin) 3' terminus RNA iplikçiğinin, değiştirilmiş bir formla etiketli, ticari olarak sentezlenmiş RNA probları kullanılmıştır. RNA-desthiobiotin ile özellikle ilgi bağlı-RNA ile etkileşim proteinler aşağı çekmek için kullanılan manyetik boncuklar streptavidin etkileşimi aracılığıyla immobilize. Mesothelioma hücreleri sitozolik kısmını gelen sigara denatüre ve aktif proteinler, protein kaynağı olarak kullanılır. Böyle RNA bağlı proteinler manyetik boncuklar, % 12'si SDS-sayfa jel çalıştırmak, bir membran transfer ve farklı antikorlar ile probed üzerinden eluted.
Standart streptavidin-biotin benzeşme arıtma yordam, sert denatürasyon koşulları ilişkili proteinler8, elute için güçlü geri dönüşü olmayan biotin streptavidin bağ bozmak için gerekli olan ayrılma neden olabilir protein kompleksleri. Biotin, aksine desthiobiotin ters streptavidin için bağlar ve rekabetçi biotin için protein elüsyon nazik bırakılınca koşar ve doğal olarak biotinylated molekülleri9yalıtım kaçınarak, tamponlu bir çözüm ile yerlerinden olduğunu, Teknik yerli protein kompleksleri yerel koşullar altında yalıtmak için ideal olduğunu düşündüren.
Tuz konsantrasyonu, azalan bakiyeli ajanlar ve deterjan yüzde tarafından belirlenir, vitro bağlayıcı koşulları ve sıkılık, yakın bu hücresel bağlamda mevcut gerçek vivo içinde etkileşimleri tanımlamak için olması gerekir. Burada uygulanan bağlama koşulları daha önce bir AU-bağlayıcı protein10Hur kimliği için uygun olarak gösterilmiştir. Uygun ciltleme koşullardan en iyi duruma getirme zaman alıcı ve zor olabilir bu yana bu yaklaşım zaman kazanmak. Buna ek olarak, bu yöntem bir başlangıç iletişim kuralı olarak herhangi bir RNA-açılan deneme için kullanılan ve yavaş yavaş tuzları ve deterjanlar konsantrasyon değiştirme gliserol yüzdesini değiştirerek ve diğer tuzları ekleyerek optimize edilebilir. Ayrıca, biz bile bir kısa 25-nükleotit RNA-bir pentamer yataklık sonda vardır-motif belirli bir AUBP ile etkileşim göstermek için kullanılabileceğini gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması sitozolik ve nükleer Protein fraksiyonu
- Plaka 4 x 106 ACC-MESO-4 hücreleri RPMI - 1640 orta yetiştirilen bir T150 hücre kültür şişeye %10 FBS, 1 x penisilin/streptomisin (100 x) ve 2 mM L-glutamin (200 mM) ile desteklenmiştir. Hücrelerin % 80-90 (~5-5.5 x 106 hücreler) bir izdiham ulaştığınızda, nükleer ve sitozolik kesir protein çıkarılması ile devam edin.
Not: ACC-MESO-4 hücre kültürünü RIKEN BioResource Merkezi11' den elde edildi. - Orta Aspire edin, hücreleri 15 mL 1 x PBS ekleyerek yıkama, plaka birkaç kez hafifçe eğimli ve 1 x PBS Aspire edin. 3 mL % 0.25 ekleyin tripsin-EDTA ve kültür şişesi 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
Not: dekolmanı için mikroskop altında hücreleri bakın; Eğer hala dokunun bağlı 3 avucunun karşı şişeye kez. - %10 FBS, 1 x penisilin/streptomisin (100 x) ve 2 mM L-glutamin (200 mM) ile RPMI-1640 Orta 7 mL ekleyin, bir 15 mL tüp hücrelerde toplamak ve spin aşağı 200 x g 5 min için de.
- Orta Aspire edin ve hücre Pelet 1,5 mL 1 x PBS ile resuspend sonra hücreleri 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Spin aşağı vasıl 500 x g ve 4 ° C 5 dk. atma süpernatant.
Not: Bu adım ileriye doğru 4 ° C'de tüm Santrifüjü adımlarını gerçekleştirin ve buz üzerinde tüm reaktifler tutmak. - Hücre Pelet buz gibi 1.5 mL 1 x PBS ile resuspend ve 500 x g ve 4 ° C'de 3 dakika süreyle hücreleri aşağı spin süpernatant atın.
Not: Ben, CER II ve NER Kimyasalları 10, 0,55 ve 5 cilt cilt, sırasıyla Paketli tahmini hücre Pelet CER gerekli miktarda vardır; Aşağıdaki protokol 20 µL hacmi varsayar. Biz sadece reaktif CER gerekli miktarda hazırlanması tavsiye ben. - Buz gibi sitoplazmik ayıklama reaktif 200 µL ekleyin (CER ben) 1 x İndinavir inhibitörü, örneğin, 2 µL ile takıma proteaz inhibitörü (EDTA içermeyen) 1 tablet 500 µL 100 x hisse senedi almak için su içinde seyreltik. Bu miktar reaktif CER ben da birim Paketli bir hücre Pelet 20 µL koşullar için yeterlidir.
- Hücre Paketli Pelet birim tahmin etmek için 1 x PBS 10, 20, 50 veya 100 µL ile dolu 1.5 mL tüp ile hücre Pelet içeren tüp karşılaştırın.
- Hücre pelet tarafından şiddetle vortexing 15 için tüp resuspend s ve buz için 10 dk. 11 eklemek µL buz gibi sitoplazmik ayıklama reaktif II (CER II) tüp, 5 için şiddetle girdap tüp kuluçkaya s ve 1dk buz üzerinde kuluçkaya.
- Şiddetle için 5 s ve santrifüj tüpü 16.000 g x, girdap ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle Transfer süpernatant temiz önceden soğutulmuş tüp buz üzerinde. Daha fazla sitoplazmik kesir süpernatant olduğunu RNA-açılan deneyde kullanılan.
- 1 µL İndinavir inhibitörü (100 x) ve şiddetle 15 için girdap ile takıma kalan Pelet 100 µL buz gibi nükleer ayıklama reaktif (NER) içinde resuspend s. Proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş NER reaktif yalnızca gerekli miktarda hazırlanması tavsiye ediyoruz.
- Örnek zaman zaman vortexing 15 ile 40 dakika buz üzerinde kuluçkaya s (her 10 min).
- Tüp 16. 000 x g 10 dk. Transfer için de (bu nükleer protein fraksiyonu) süpernatant temiz bir önceden soğutulmuş tüp santrifüj kapasitesi.
- Hemen bicinchoninic (BCA) yöntemini kullanarak protein konsantrasyonu ölçerek devam ( Tablo malzemelerigörmek). Her kesir protein saflık için denetlemek için α-tübülin (sitozolik kesir pozitif algılamasını sadece) ve poli ADP-riboz polimeraz - PARP (nükleer kesir pozitif algılamasını sadece) karşı immunoblotting (şekil 1) gerçekleştirin. Protein görselleştirme için 4 bölümüne bakın.
- Protein etkinlik ve yerel durumlarına tutmak için aliquots sitozolik ve nükleer özler 25 µL hazırlayın. Ek-bu aliquots donma 5 s ve-80 ° C'de doğrudan mağaza için sıvı azot yerleştirerek
2. RNA Desthiobiotin ile etiketleme
- Ticari olarak sentezlenmiş RNA probları ve saf HPLC hakkına sahiptir. Nükleaz ücretsiz su 10 µM ile resuspend.
Not: Sonda dizileri Tablo 1' de listelenmiştir. - RNA, RNA-açılan tepki başına 50 pmol kullanın. Çözülme ve tüm reaktifler için % 30, etiket 3' terminus için RNA oligo, kullanılan PEG dışında buz üzerinde tutun.
- CALB2 3' UTR (vardır) etiketli 10 µM RNA probları 5 µL transfer, CALB2 3' UTR (mtARE) ve ilgisiz-RNA (IRE), 0,5 mL ince duvar microcentrifuge içine borular ve PCR makinesi 85 ° C'de 5 dk. yerleştirmek için tüpler hemen buz üzerinde kuluçkaya.
Not: gevşeme ve etiketleme için RNA sonda erişilebilirliğini teşvik gibi bu adım önemlidir. - Bir tek 30 µL tepki için aşağıdaki 10 µL karıştırmak için RNA içeren tüp ekleyin: nükleaz boş su 3 µL, 10 RNA ligaz tepki arabellek, RNase inhibitörü 1 µL x 3 µL (40 U/µL), Desthiobiotinylated sitidin Bisphosphate (1 mM) 1 µL ve T4 RNA ligaz (20 U/µL) 2 µL.
Not: Ana mix A aşırı (3.2) 3 örnekleri hazırlamak için 9.6 µL nükleaz, ücretsiz su, 10 RNA ligaz tepki arabellek, RNase inhibitörü 3.2 µL x 9,6 µL mix (40 U/µL), 3.2 µL Desthiobiotinylated sitidin Bisphosphate (1 mM) ve T4 RNA ligaz (20 U/µL) 6.4 µL. - Dikkatle 15 µL PEG tepki için % 30 ekleyin. Başka bir ipucu tepki karıştırmak için kullanın. Gecede 16 ° C'de tepki kuluçkaya
- Ertesi gün, aşağıdaki hazırlamak: 5 M NaCl (taze/nükleaz-free), kloroform: 24:1 oranında (örneğin, tepki - 96 µL kloroform ve izoamil alkol 4 µL başına), izoamil alkol buz gibi % 100 etanol ve buz gibi % 70 etanol.
- Nükleaz ücretsiz su 70 µL RNA etiketleme tepki tüpler için ekleyin. Kloroform 100 µL ekleyin: izoamil alkol ve girdap kısaca. Spin aşağı de 13.000 x g 3 dk. dikkatli bir şekilde çıkarın için yalnızca üst aşaması ve aktarımı için yeni bir 1,5 mL nükleaz ücretsiz tüp; daha düşük faz dokunmaktan kaçının.
- 5 M NaCl, glikojen 1 µL ve buz gibi % 100 etanol 300 µL 10 µL ekleyin. -20 ° c 2 h için tüpü yerleştirin.
Not: Bu adımda, ertesi gün deneme devam edilebilir. - 13.000 g x ve 4 ° C de 15 dakika süreyle santrifüj dikkatli atmak süpernatant Pelet bozmadan. Buz gibi % 70 etanol ve santrifüj 13.000 x g ve 4 ° C tekrar 5 min için 300 µL ekleyin.
- Tamamen süpernatant atın ve Pelet (15 dk) kuruması. Pelet nükleaz ücretsiz su 20 µL içinde resuspend.
Not: Aynı gün RNA-açılan ile devam edin. - 2 dk 90 ° C'de RNA kuluçkaya ve Buza koyun. Etiketli RNA streptavidin manyetik boncuklar ön yıkama aşağıdaki adımı sırasında Buza koyun.
Not: Daha uzun bir kuluçka süresi RNA sonda zarar verebilir.
3. RNA-Protein açılan
-
Streptavidin manyetik boncuklar ve kuluçka desthiobiotin-RNA ile ön yıkama
- Streptavidin manyetik boncuklar 50 pmol RNA başına 50 µL kullanın. Ancak, bu deney bağlı olarak optimize edilmelidir.
- Girdap 15 s ve hızlı bir şekilde temiz 1.5 mL kullanarak güvenli kilit tüp içine Kaldır 200 µL (ana mix; 3 + 1 reaksiyonlar için yeterli) için streptavidin manyetik boncuklar ile tüp pipet ipuçları kesmek. Tüp manyetik bir stand üzerine boncuk tüp tarafında toplamak ve 1 dk. Kaldır resuspension sıvı bekleyin yerleştirin.
- Boncuk yıkamak için manyetik standından tüpü çıkarması, 0.1 M NaOH, 0,05 M NaCl çözüm ve hafifçe yukarı ve aşağı birkaç kez damlalıklı 400 µL ekleyin. Tüp manyetik sandalyesine koyun. 1 dk bekleyin ve süpernatant toplamak. Yine bu adımı yineleyin.
- Boncuk 200 µL 100 mm NaCl ile yıkayın. Süpernatant kaldırın.
- 200 µL 20 mm Tris (pH 7.5), boncuk pipetting tarafından resuspend, tüp manyetik kürsüye getirin, için 1 dakika bekleyin ve süpernatant kaldırmak ekleyin. Adımı tekrarlayın.
- Manyetik standından tüpü çıkarması, RNA yakalama arabelleğinin x 1 200 µL eklemek ve streptavidin manyetik boncuklar kısaca vortexing tarafından resuspend. Streptavidin manyetik boncuklar 50 µL kaldırın ve her etiketli-RNA tüp kesme pipet ucu kullanarak ekleyin. Tüpler, oda sıcaklığında bir rulo üzerinde 30 dk için kuluçkaya.
-
Bağlayıcı protein RNA
- Tüpler manyetik bir stand içine koyun, 1 dk bekleyin ve süpernatant kaldırın.
- 20 mm Tris (pH 7.5) 50 µL için boncuk ekleyin ve pipetting tarafından resuspend. Tüpler manyetik bir stand içine koyun, 1 dk bekleyin ve süpernatant kaldırın. Bu adımı yineleyin.
- 1 Protein-RNA bağlama arabellek x 100 µL için boncuk ekleyin ve pipetting tarafından resuspend.
- Bu arada, aşağıdaki karışımı hazırlayın: 10 x Protein-RNA bağlama arabellek, % 50 gliserol 30 µL, 50 µg sitoplazmik proteinlerin ve nükleaz ücretsiz 10 µL su 100 µL.
Not: Ana mix B aşırı (3,3) 3 örnekleri aşağıdaki gibi hazırlamak: 10 Protein-RNA bağlama arabellek x 33 µL, 99 µL % 50 gliserol, sitoplazmik protein ve nükleaz ücretsiz su kadar 330 µL. 165 µg tutmak ana mix B buz üzerinde tüp. - Tüpler manyetik stand içine koyun, 1 dk bekleyin ve süpernatant toplamak. Ana Mix B 100 µL eklemek, yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend ve kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Reaksiyon tüpler bir rulo üzerinde 4 ° C'de 60 dk için kuluçkaya.
-
Çamaşır ve elüsyon
- Tüpler manyetik bir stand içine yerleştirin, (bu akışı - FT) süpernatant toplamak ve yeni bir tüp içine aktarın.
Not: Bu FT daha sonraki analizler için buz üzerinde tutun. - 1 yıkama arabellek boncukları üzerinde x 100 µL pipet, hafifçe resuspend, manyetik stand içine koy, 1 dk bekleyin ve süpernatant atmak. Bu 2 kez tekrarlayın.
- Yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix ve 30 dk bir tüp shaker (950 devir/dakika) olarak 37 ° C'de kuluçkaya elüsyon arabelleği 40 µL manyetik boncuklar ekleyin.
- Tüpler manyetik bir stand içine yerleştirin, 1 dk bekleyin ve (Bu eluate - E) eluted örnek toplamak. Buz üzerinde ve aşağı akım analizi için kullanın.
Not: Bu adımda, her test RNA sonda bir akışı aracılığıyla (FT) ve eluate (E) örnek oluşur.
- Tüpler manyetik bir stand içine yerleştirin, (bu akışı - FT) süpernatant toplamak ve yeni bir tüp içine aktarın.
4. polyacrylamide Elektroforez ve Western Blot analizi
Not: Bu bölümde kullanılan arabellekleri için yemek tarifleri için Tablo 2 bakın. Gerçekleştirmek bir Western blot Laemmli yöntemi12göre.
- Handcast % 12 SDS-sayfa jelleri (10-wells, 1.5 mm rondela, 66 µL). Çalışan bir jel karışım hazırlamak: 4 mL % 30 Akrilamid-bisacrylamide stok çözeltisi, alt Tris 2.4 mL tampon, dH2O, TEMED, 96 µL % 10 amonyum persülfat çözüm (APS) 9.6 µL 3.2 mL. Yığın jel karışımı hazırlayın: 3.25 mL dH2O, % 30 Akrilamid - bisacrylamide hisse senedi çözüm, üst Tris arabelleği 1.3 mL 0.5 mL, TEMED, 20 µL % 10 10 µL APS.
- 6 x Laemmli arabelleği 16.6 µL ekleyin (örneğin, 14 mL (üst Tris arabellek) Tris/HCl/SDS pH 6.8, SDS, DTT, 6 mL gliserol ve %0.012 bromophenol mavi; 1.86 g, 2 g-20 ° C'de depolanan) FT örnek ve 6 x Laemmli arabellek içine E örnek 6.6 µL içine. Örnekleri 95 ° C'de 5 min için kuluçkaya
- (20 µL FT ve bütün Elute ~ 40 µL) örnekleri yüklemek ve 30 dk 60 V, gecede 20 V ile devam için çalıştırabilirsiniz.
- Yarı kuru electroblotting sistemiyle, proteinler için 80 dk 15 V PVDF membran üzerine aktarın.
Not: PVDF membran protein transferi yapmadan önce etkinleştirilmesi gerekir. % 100 metanol için 1 dakika, 2 dk kuluçka ultrasaf su ardından membran kuluçkaya. - Protein transferden sonra SDS-sayfa jel ile Coomassie çözüm, her 30 dk ultrasaf su ile yıkama üç numaralı adımları takip 3 h için kuluçkaya.
- Protein aktarımı sonunda 4.5 adımda gösterildiği gibi membran 1 h. yeniden etkinleştirmek için Kuru PVDF membran izin. Membran 1 x TTBS %5 BSA ile 1 h blok.
- Membran ile ilk antikor kuluçkaya: HuR veya mesothelin, her ikisi de seyreltilmiş 1: 1000 1 x TTBS 4 h oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de % 5 BSA içinde
- 7 dk. için üç kez membran 1 x TTBS yıkama ve tavşan Anti-fare horseradish peroksidaz (HRP) kuluçkaya-konjüge ikincil antikor seyreltilmiş %5 BSA, 1 x TTBS 1:10,000.
- Proteinler gelişmiş Kemiluminesan ve dijital görüntüleyici kullanarak görselleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu deneyde, calretinin 3' UTR barındıran ARE motifi (CALB2 3' UTR (vardır) 25-nt) 25-nt uzun parçası özellikle insan-antijen R (HuR) protein için bilinen bir mRNA sabitleyici bağlar olup olmadığını test etmek için kullanılmıştır. ARE öğesi, bir 25-nt RNA özgüllük test etmek için daha önce olan motif sabitleme etkisini ortadan kaldırmak için gösterildi, ARE-motif mutasyon içeren CALB2 3' UTR (mtARE) kullanılan6yoklamaydı. Üçüncü RNA sonda 28 nt olan negatif kontrol sitozolik protein demir-yanıt veren13,14bağlamak için bilinen iyi tanımlanmış demir duyarlı elemanı (ilgisiz RNA (IRE)), içeren RNA ilgisiz temsil eder. HuR mRNA sabitleyici sitozol15olarak çekirdek ama işlevleri içinde lokalize ağırlıklı olduğu için nükleer/sitozolik ayıklama etkin proteinler sitozol elde etmek için gerçekleştirildi.
Nükleer/sitozolik kesirler saflığı göstermek için proteinler PARP protein sadece beklenen ( olarak nükleer kesir olarak algılandı, ancak gösterdi o α-tübülin sadece sitozolik kesir algılandı Western blot tarafından analiz edildi Şekil 1). CALB2 3' UTR üzerinden eluate vardır-sonda gösterdi bağlama Hur HuR yoktu Oysa mutant üzerinden eluate içinde CALB 3' UTR (mtARE) sonda. HuR yapıldı Ayrıca demir duyarlı protein (şekil 2A) bağlar ilgisiz RNA sonda eluate içinde yok. Bu protein RNA ile etkileşimde bulunmaz gibi daha fazla özgüllük CALB 3' UTR (vardır) ve HuR arasında göstermek için membran Ayrıca anti-mesothelin (MSLN) antikor ile probed. Eluates tüm üç örnek üzerinden hiçbir varlığı mesothelin gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu teskin olan motif CALB2 içinde 3' UTR özellikle HuR protein bağlayabilirsiniz gösterir.
Coomassie jel (şekil 2B) Boyama proteinler eşit miktarda üç farklı RNA probları ile kuluçkaya kullanılmıştır gösterir. Sitozolik özü kullanılan düşük miktarda ve membran aktarmak nedeniyle bu boyama eluate proteinleri algılanması için aksi takdirde Western blot analizi ile tespit edildi (E) şerit izin vermedi.
Şekil 1: Western blot analizi sitozolik ve nükleer protein fraksiyonu 5 µg. PARP protein nükleer kesir (N) var, ancak sitozolik (C) kesir yok. Α-tübülin sitozolik kesir (C) var, ancak nükleer kesir (N) yok. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Western blot gösterir HuR tarafından 25-nt CALB2 3' UTR (vardır) yakalanır. A) FT: akış yoluyla kuluçka sonra RNA sonda ile; E: proteinler kuluçka eluted ve bağlama RNA sondalar. Probları: CALB2 3' UTR (mtARE) - calretinin 3' olan motif içinde 3 mutasyona uğramış nükleotit içerir UTR'nin parçası 25-nt; UR RNA (IRE) - 28-nt RNA sonda demir duyarlı proteinleri bağlar iyi tanımlanmış bir demir-yanıt veren öğe ile. Membran daha fazla mesothelin (MSLN), RNA ile etkileşimde bulunmaz bir protein için sondaj. B) Coomassie proteinler eşit miktarda RNA ile inkübe gösteren protein transferden sonra jöleyi boyama sondalar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| RNA sonda | Sıra | Konsantrasyon |
| CALB2 3' UTR (vardır) 25nt | UCGCUGUAUGAUUUAGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| CALB2 3' UTR (mtARE) 25nt | UCGCUGUAUGGUCUGGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| İlgisiz RNA - IRE 28nt | UCCUGCUUCAACAGUGCUUGGACGGAAC | 10 ΜM |
Tablo 1 : RNA dizisi probları
| Jel çalıştırmak için alt Tris arabellek | |
| 1,5 M | Tris Bankası |
| %0.40 | SDS çözüm |
| addjust pH HCL kullanarak 8.8 için (6 mol/L) | |
| ile doldur | dH2O |
| İstifleme için üst Tris SDS-sayfa jel | |
| 500 mM | Tris Bankası |
| %0,4 | SDS çözüm |
| PH HCL kullanarak 6,8 için ayarlamak (6 mol/L) | |
| ile doldur | dH2O |
| 10 x çalışan arabellek | |
| 250 mM | Tris Bankası |
| 1.92 M | Glisin |
| PH HCL kullanarak 8,3 için ayarlamak (6 mol/L) | |
| ile doldur | dH2O |
| Filtre veya basınçlı kap ve mağaza 4° c | |
| 1 X çalıştıran arabellek | |
| 100 mL | 10 x çalışan arabellek |
| % 0.05 | SDS çözüm |
| 1 L ile doldurmak | dH2O |
| 10 x Aktarım arabellek | |
| 480 mM | Tris Bankası |
| 390 mM | Glisin |
| %0,38 | SDS çözüm |
| ile doldur | dH2O |
| Not: 0.22 um filtre ve 4 ° C'de depolayın | |
| 1 X Aktarım arabellek (yarı kuru sistemler için) | |
| 20 mL | 10 x Aktarım arabellek |
| 40 mL | metanol |
| 200 mL doldurulması | dH20 |
| 10 X TBS (Tris arabelleğe alınmış serum) | |
| 250 mM | Tris Bankası |
| 1,36 M | NaCl |
| 27 mM | KCl |
| PH 7.4 için ayarlamak | |
| ile doldur | dH2O |
| Filtre | |
| 1 X TTBS (0.1 ara-20 Tris-tampon serum) | |
| 1 X | 10 X TBS |
| %0.10 | Ara-20 |
| ile doldur | dH2O |
| RNA yakalama arabelleğinin (1 X) | |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 1 M | NaCl |
| 1 mM | EDTA |
| Protein-RNA bağlama arabellek (10 x) | |
| 200 mM | Tris (pH 7.5) |
| 500 mM | NaCl |
| 20 mM | MgCl2 |
| % 1 | Ara-20 |
| Arabellek yıkayın (1 x) | |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 10 mM | NaCl |
| % 0.1 | Ara-20 |
| Elüsyon arabellek | |
| 4 mM | biotin |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 50 mM | NaCl |
| Coomassie çözüm | |
| %0.02 | Coomassie G-250 |
| % 5 | Aluminiumsulfate-(14-18)-hidrat |
| % 10 | Alkol |
| % 2 | Orto fosforik asit |
Tablo 2: Yemek tarifleri
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kodlamayan genom3' e 3' UTRs ait ve onların işlev7uygulamak için tüm kodlamayan RNA'ların proteinler ile etkileşim kurabilir. Ne zaman memeli genom pervasively transkripsiyonu için kurmak ve uzun kodlamayan RNA'ların16önemli bir kısmını üretilen, delillerin ortaya çıkan bu uzun kodlamayan RNA'ların ile etkileşimde bulunan gen ifadesinin düzenlenmesine çalışması gösterdi kompleksleri17Kromatin remodeling. Bu bilgi RNA-açılan tahlil kullanarak elde edilen. Gerçekleştirmek basit olarak böylece, interactors belirli bir RNA'ın deşifre başlatmak için ilk adım vitro biyokimyasal deneyleri RNA-açılan gibi olabilir.
Not, sadece sıra motifleri aynı zamanda RNA'ın ikincil yapı bir kritik rol oynar RNA işlevindeki etki alanları proteinler ile etkileşim için temel biçimi olarak. İkincil yapı fizyolojik olarak değişebilir ve vitro koşulları ve RNA-açılan falsepositives tanımlaması için neden olabilir. Örneğin, RNA-açılan EZH2, baskıcı karmaşık 2 (PRC2), polycomb bir parçası bir etkileşen etkin olmayan belirli transkript X tespit (Xist)18, RNA antianlamlı Arıtma kullanılan bir çalışmada kitle ile birleştiğinde ise spektrometresi (RAP-MS) tanımlanan diğer interactors gibi keskin (SMRT ve HDAC ilgili önleyici protein), SAF-1 (iskele ek faktör A) ve LBR (Okan B reseptör)19. Diğer fonksiyonel test yok bir RNA ve verilen bir protein arasındaki etkileşimi destekliyorsa, bu nedenle, bulgular daha fazla ile çıkarma tarafından takip immunoprecipitating verilen protein gibi tamamlayıcı bir protein-merkezli yaklaşım takıma ve bağımlı RNA karakterizasyonu.
Burada sunulan Protokolü HuR bağlama ARE motif için CALB2 içinde 3' UTR, daha önce işlevsel olarak pmiRGLO-luciferase tahlil6tarafından karakterize algılamak için kullanılan. Proteinlerin az miktarda nedeniyle, bu iletişim kuralı daha büyük protein miktarları gerekli nerede kütle spektrometresi gibi aşağı akım analizi için uygun değil. Bunun yerine, protokol RNA-kütle spektrometresi tarafından tanımlanan ama proteinler daha düşük bir miktarda kullanarak interactors düzeltin için kullanılabilir.
Beri düşmesine duyarlı olan RNA ile çalışma yöntemi içerir RNase enstrümanlarının çözüm ek olarak standart laboratuvar iyi uygulama ile çalışma yüzeyleri Temizleme öneririz. Mümkünse, RNA etiketleme ve arıtma laminar akış altında hazırlanması gerçekleştirin. RNA oligo saflığı da bağlayıcı koşulları etkileyebilir; Böylece, ticari olarak sentezlenmiş probları saf HPLC vardı. Değiştirilmiş, daha uzun ve son derece saf RNA oligos gerekiyorsa, sayfa arıtma yöntemini kullanın. Yerel proteinlerin aliquots buz gibi bu nedenle yavaş dondurma yaklaşım ve tekrarlanan dondurma ve çözme nedeniyle proteinlerin zarar kaçınarak ek hazırlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Sinergia grant CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung ve Zürih Krebsliga tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | - | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - α - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin - streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | - | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | - | the synthesis scale - 0.04 µmol - HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 - 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
References
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
- von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
- Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
- Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013).
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
- Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
- Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
- Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
