Summary
Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.
Abstract
GABAergic interneuronen (INs) zijn kritieke onderdelen van neuronale netwerken dat station cognitie en gedrag. INs bestemd voor het vullen van de cortex tangentieel migreren van hun plaats van herkomst in het ventrale telencephalon (met inbegrip van de mediale en caudal ganglionaire eminenties (MGE, CGE)) naar de dorsale corticale plaat in reactie op een verscheidenheid van intrinsieke en extrinsieke signalen. Verschillende methoden zijn ontwikkeld de afgelopen jaren genetisch manipuleren van specifieke studierichtingen en onderzoeken hoe zij de dynamische cytoskeletal veranderingen die nodig zijn voor goede werking regelen IN migratie. In utero electroporation is uitgebreid gebruikt voor het bestuderen van het effect van gene onderdrukking of overexpressie in specifieke IN subtypen terwijl het beoordelen van de effecten op de morfologie en definitief standpunt. Echter, terwijl deze aanpak gemakkelijk gebruikt wordt voor radiaal migreren piramidale cellen wijzigen, het is meer technisch uitdagende wanneer gericht op INs. In utero electroporation een lage opbrengst gegeven de verminderde overlevingscijfers van pups genereert wanneer Electroporation geschiedt vóór e14.5, zoals gebruikelijk is bij de studie van INs MGE-afgeleide. In een alternatieve benadering, MGE explantaten bieden gemakkelijk toegang tot de MGE en vergemakkelijken van de beeldvorming van genetisch gemodificeerde INs. Echter, in deze explantaten, INs migreren naar een kunstmatige matrix, verstoken van endogene begeleiding signalen en de thalamus ingangen. Dit leidde ons te optimaliseren van een methode waar INs in een meer natuurlijke omgeving, migreren kunt terwijl het omzeilen van de technische uitdagingen van in utero benaderingen. In dit artikel beschrijven we de combinatie van ex utero electroporation van muis embryonale hersenen gevolgd door organotypic segment culturen gemakkelijk bijhouden, afbeelding en reconstrueren van genetisch gemodificeerde INs migreren over hun natuurlijke paden in reactie op endogene signalen. Deze aanpak maakt het mogelijk voor zowel de kwantificering van de dynamische aspecten van migratie met time-lapse confocal beeldvorming, evenals de gedetailleerde analyse van verschillende morfologische parameters met behulp van neuronale reconstructies op vaste immunolabeled weefsel.
Introduction
Corticale GABAergic interneuronen (INs) zijn divers met betrekking tot hun eigenschappen van biochemische, fysiologische eigenschappen en connectiviteit, en bemiddelen zij verschillende functies in volwassen netwerken1,2,3 ,4,5. De specificatie van verschillende subtypen van corticale INs is strak geregeld door middel van genetische cascades die uitgebreid bestudeerde1,2 zijn. Het merendeel (70%) van corticale GABAergic INs zijn afkomstig uit de vermelding in de mediale ganglionaire eminentie (MGE), een ventrally gelegen embryonale structuur, en moet migreren over relatief lange afstanden te bereiken van de corticale plaat1, 2 , 6. terwijl de corticale piramidale cellen migreren radiaal van de ventriculaire zone (VZ) naar de corticale plaat langs de radiale glia steiger, de tangentiële migratie van INs, die zijn niet gekoppeld aan een dergelijke steiger, vereist een verscheidenheid van intrinsieke en Extrinsieke signalen te trekken migreren neuronen richting de corticale plaat, terwijl begeleiden hen uit de buurt van niet-corticale structuren2,7,8. Na het verlaten van de celcyclus, INs zijn afgestoten uit de MGE door middel van chemo-afstotend signalen uitgedrukt binnen de VZ van de MGE, die triggers van tangentiële migratie naar de corticale plaat9,10. Migreren van INs voorkomen het striatum met behulp van verschillende afstotend aanwijzingen11 en, na het bereiken van de corticale plaat, ze overschakelen van een tangentiële naar een radiale migratiemodus en bereiken hun definitieve laminaire standpunt, mede in reactie op signalen van piramidale cellen12 en andere cellulaire bevolking13. De migratie van INs, wat betreft andere neuronale populaties, omvat verschillende dynamische morfologische veranderingen zodat de werkelijke beweging van het neuron. Deze zogenaamde neuronale motoriek wordt gekenmerkt door herhaalde cycli van drie opeenvolgende stappen: de rek van een toonaangevende proces, een actieve anterograde motie van de kern (nucleokinesis), en de intrekking van de afsluitende proces14. Migratie is gereglementeerd door talrijke intrinsieke en extrinsieke signalen dat station de vertakking en actieve verbouwing van het toonaangevende proces begeleiden INs in de juiste richting, bepalen van zowel de richting en de snelheid van migratie14,15 ,16.
De regulering van de corticale migratie determinanten zijn uitvoerig bestudeerd in de afgelopen jaren1,2,7,17,18,19,20, en ontwrichting in sommige van deze moleculaire actoren heeft geweest gepostuleerd leiden tot neurologische aandoeningen, zoals pediatrische Refractaire Epilepsie of autisme spectrum stoornissen1,2,21, 22 , 23 , 24. daarom de ontwikkeling van verschillende benaderingen van in vitro en in vivo heeft uitgeoefend om ons vermogen om te studeren dit dynamisch proces, als eerder gerecenseerd25aanzienlijk verder te gaan. In vitro methoden, met inbegrip van de bepaling van Boyden kamer en de Stripe keuze Assay, bieden de snelste en meest reproduceerbare middelen voor de beoordeling van de eis en de cel-autonome impact van specifieke genen of eiwitten tijdens de neuronale migratie zonder de invloed van andere factoren-25. Deze testen zijn met name handig wanneer gecombineerd met live-imaging8,26,27. Met deze technieken, INs gemakkelijk kunnen worden opgehaald van e13.5 MGE en geïsoleerd door enzymatische en mechanische dissociatie, waarna verschillende signaalroutes en begeleiding signalen kunnen worden onderzocht, zoals eerder geïllustreerd8,28 . Echter, deze tests vinden plaats in een kunstmatige extracellulaire matrix in de afwezigheid van drie-dimensionale weefsel architectuur, die van neuronale gedrag en cel eigenschappen veranderen kan, potentieel op het gebied van migratie en/of overleving van de cel25. Om te omzeilen deze beperkingen, zijn ex vivo MGE explantaten ontwikkeld als een alternatieve instrument te kwantificeren van de dynamische morfologische veranderingen die zich voordoen tijdens de migratie samen met parameters zoals snelheid en oriëntatie14, 29. Genereren van MGE explantaten is betrekkelijk eenvoudig en uitgebreid is geweest30elders beschreven. Goed bestuur houdt de beplating van een klein uittreksel van de MGE op een monolayer van gemengde corticale cellen of in een mengsel van matrigel en collageen in de aanwezigheid van aantrekkelijke of weerzinwekkend signalen25, hoewel de laatste optionele31 zijn. MGE explantaten toestaan voor hoge resolutie imaging van dunbevolkte gelabelde cellen, vereenvoudiging van de studie van intracellulaire processen, zoals het cytoskeletal remodelleren toonaangevende tijdens vertakking, zoals eerder32,33 ,34 en in de huidige studie. MGE explantaten hebben met succes gebruikt om te beoordelen van dynamische cytoskeletal veranderingen tijdens de migratie in een 2D omgeving, bijvoorbeeld na specifieke farmacologische of Chemotactische manipulaties (zie bijvoorbeeld Tielens et al. 201633) . Echter, met deze benadering, INs migreren binnen een kunstmatige matrix, en dit kan worden gewijzigd IN het gedrag en de reproduceerbaarheid en de betekenis van de experimentele resultaten.
Daarentegen, in utero electroporation kan de genetische manipulatie van INs in hun eigen omgeving en is een veel gebruikte methode om snel en efficiënt beoordelen de impact van winst en verlies van de genfunctie tijdens het omzeilen van de beperkingen van kostbare en tijdrovende knock-out en knock-in strategieën25,35. In utero electroporation kan een vertekend beeld geven richting IN de progenitoren met behulp van cel type specifieke initiatiefnemers en door positionering van de elektroden naar ventromediale structuren, met inbegrip van de MGE36. Bovendien, in utero electroporation zorgt voor de tijdige uitdrukking van experimentele constructies binnen 1-2 dagen, in vergelijking met de 7-10 dagen nodig voor construct expressie met behulp van virale vectoren25. Echter, in utero electroporation van IN progenitoren neigt te zijn van lage-opbrengst. Inderdaad, hoewel piramidale cel progenitoren gelegen in de dorsale ventriculaire zone kunnen efficiënt zijn transfected gebruiken in utero electroporation, gericht op meer ventrally gelegen structuren, zoals de MGE, is meer technisch uitdagende, vooral in kleine e13.5 vermindert embryo's en het hoge tempo van embryonale letaliteit verder de experimentele opbrengst25.
Te omzeilen enkele technische beperkingen in vitro gekoppeld MGE explant experimenten en in vivo in utero electroporation, ex vivo organotypic segment culturen geweest ontwikkelde8,37, 38,39. Hersenen organotypic segment culturen bieden het voordeel van het nabootsen van in vivo voorwaarden, terwijl het minder dure en tijdrovende dan genereren25 diermodellen. Inderdaad, deze preparaten toestaan een gemakkelijke toegang tot de MGE, samen met de specifieke visualisatie van INs, en kunnen worden gecombineerd met focal electroporation te onderzoeken van specifieke moleculaire pathways in INs migreren in een meer fysiologische omgeving8 , 39 , 40 , 41. Wij hebben daarom een aanpak voor organotypic culturen38, waarin we gecombineerd met ex utero electroporation en time-lapse confocal imaging geoptimaliseerd, verdere beoordeling van de morfologische en dynamische proces optreedt tijdens de tangentiële migratie van MGE-INs. Dit protocol werd aangepast en geoptimaliseerd van anderen die hebben gebruikt ex utero of in utero hersenen electroporation en organotypic segment culturen bij het bestuderen van de migratie van piramidale cellen42,43 en corticale INs36,39,44. In het bijzonder muis embryo's zijn onthoofd en de MGE is electroporated ex vivo na de intraventricular injectie van de experimentele plasmiden, waardoor meer efficiënte en nauwkeurige targeting van MGE voorlopercellen dan wat kan worden bereikt met in utero electroporation. De hersenen worden vervolgens uitgepakt en gesegmenteerd in hele hersenen coronale plakjes die kunnen worden gekweekt voor een paar dagen, waardoor continu bijhouden en beeldvorming van transfected INs. Deze aanpak meestal etiketten het tangentieel migreren INs 5-20 per segment van de hersenen, het minimaliseren van het aantal experimentele iteraties verplicht te bereiken van statistische significantie, terwijl het labelen van een voldoende neuronale bevolkingsdichtheid zodat eenvoudige scheiding van Individuele neuronen voor wederopbouw en fijne morfologische beoordeling. Bovendien, in vergelijking met MGE explantaten, organotypic culturen zorgen dat migreren INs worden blootgesteld aan een meer natuurlijke omgeving, met inbegrip van lokaal secreted chemokines en inbreng van de thalamus afferents. Deze aanpak is dus zeer geschikt voor het kwantificeren van de directionaliteit en trekkende pad goedkeuring door transfected INs, terwijl het aanbieden van voldoende anatomisch gedetailleerde informatie over de karakterisatie van fijnere dynamische processen zoals het leidende proces vertakking, zodat nucleokinesis en afsluitende proces intrekking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door het Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) in het CHU Sainte-Justine Research Center en werden uitgevoerd volgens de Canadese Raad op Animal Care guide de zorg en het gebruik van proefdieren (Ed. 2).
Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd voor electroporation van embryo's ten embryonale dage (e) 13,5, op een moment wanneer MGE afkomstige INs zijn actief gegenereerd, voordat de piek van CGE afkomstige INs productie45,46. Bovendien, om te bias de electroporation richting GABAergic INs, we gebruiken een promotor selectief uitgedrukt in INs (bijvoorbeeld de promotor van de Dlx5/6 met haar minimale versterker)47.
1. bereiding van oplossingen voor Electroporation en Organotypic Slice culturen
- 125 mL steriele kweekvloeistof voor te bereiden.
- 125 mL voor regelmatige neuron-specific kweekmedium meten (Zie Tabel van materialen voor formulering) in een gesteriliseerde fles in een eerder UV-gesteriliseerde bioveiligheid kabinet gespoten met 70% ethanol. Voeg 2,25 mL 50 x serumvrij neuron-specifieke aanvulling, 1,75 mL 200mM glutamine (eindconcentratie van 0,5 mM) en 6,25 mL van warmte-geïnactiveerd paard serum eerder aliquoted onder steriele omstandigheden. Meng grondig, aliquot in 15 mL steriele conische buizen en bewaren bij 4 ° C.
Opmerking: Bereid kweekmedium kunnen worden opgeslagen voor maximaal 3 weken bij 4 ° C. - Verdeel een 100 X stockoplossing van Botteinstein de N-2 formulering48 in 150 µL aliquots onder steriele omstandigheden en bevriezen bij-20 ° C tot gebruik.
- 125 mL voor regelmatige neuron-specific kweekmedium meten (Zie Tabel van materialen voor formulering) in een gesteriliseerde fles in een eerder UV-gesteriliseerde bioveiligheid kabinet gespoten met 70% ethanol. Voeg 2,25 mL 50 x serumvrij neuron-specifieke aanvulling, 1,75 mL 200mM glutamine (eindconcentratie van 0,5 mM) en 6,25 mL van warmte-geïnactiveerd paard serum eerder aliquoted onder steriele omstandigheden. Meng grondig, aliquot in 15 mL steriele conische buizen en bewaren bij 4 ° C.
- Bereiden 1 L van steriele kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF).
- Maat 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1 L. Voeg 25.67 g van sacharose, 5.08 g natriumchloride (NaCl), 2.18 g natriumbicarbonaat (NaHCO3), 1,80 g glucose, 0,19 g van kaliumchloride (KCl), 0.15 g van monobasisch watervrij natriumfosfaat (NaH2PO4), 1 mL van de 1 M voorraad CaCl2 .2H2O en 2 mL 1 M voorraad MgSO4.7H2O. roer te ontbinden bij kamertemperatuur. Voeg gedistilleerd water te bereiken van een totaal volume van 1 L.
- Met behulp van een 0,22 µm filter, filtreer de oplossing in een steriele fles in een gesteriliseerde bioveiligheid kabinet en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
- Bereid een verse oplossing van 4% agarose in ACSF voor elk experiment.
- Meten van 25 mL eerder bereid ACSF in een steriele conische buis van 50 mL en voeg 1 g van lage-melting point agarose.
- Verwarm gedurende 45 s in een magnetron. Voorkom morsen, onderbreken verwarming elke 3-4-s wanneer het koken begint, opent u de buis zodat de druk uit, sluit u deze opnieuw en handmatig te mengen de agarose doorroeren. Herhaal totdat de agarose oplossing homogeen is. Bewaar de agarose oplossing bij 42 ° C gedurende de rest van het experiment te voorkomen van stollen.
Opmerking: Hogere temperaturen zal hersenen weefsels beschadigen.
2. voorbereiding van plasmiden voor injectie
- Trek een glazen microinjection pipet
- De trekker van de micropipet met de juiste parameters instellen, de glazen viscometerbuizen in de verstrekte ruimte beveiligen en ervoor te zorgen dat het met de gloeidraad is gecentreerd.
- Druk op de knop trek.
- Verwijder voorzichtig de nieuw gemaakte microinjection pipetten van de trekker van de warmte en de plaats in een doos of schone petrischaal tot verder gebruik om te voorkomen beschadiging van de tip.
- Set-up het biosafety kast met alle instrumenten nodig voor dit experiment (Zie figuur 1A), royaal spuiten alle instrumenten in het biosafety kabinet met 70% ethanol en steriliseren van instrumenten en omgeving met UV-licht voor 15-20 min.
- Tijdens de sterilisatie stap, ontdooi plasmiden op ijs (4 ° C).
- Meet 10 µL van de plasmide van een stamoplossing (4 µg/µL) in een centrifugebuis schone 1,5 mL. 0,01% voor snel groen FCF toevoegen. Meng voorzichtig, kort draaien en houden op ijs tot gebruik.
Opmerking: Maxi-prep DNA moet worden opgesteld volgens de fabrikant protocol met behulp van een endotoxine-gratis maxi-prep-kit. DNA kan worden solubilized in TE buffer of nuclease-vrije H2O en de voorbereiding van de plasmide met kleurstof oplossing kan, maar hoeft niet te worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Plasmiden van Maxi-prep moet aliquoted om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien cycli. Aliquoted plasmiden moeten worden gemengd met de kleurstof niet meer dat 2 uur vóór gebruik en niet voor verder gebruik moeten worden refrozen. - Na sterilisatie, bereidt u als volgt de nano-injector.
- Kies een van de eerder bereid glazen microinjection pipet opgeslagen in een schoon vak of petrischaal en gebruik kleine pincet te snijden het uiteinde van de pipet op schuine wijze tot een buitendiameter van ongeveer 15 µm.
Opmerking: De hier gegeven buitendiameter is een benaderende maatregel om de gebruiker een idee geven van wat we in onze experimenten gebruiken en ter vergemakkelijking van de piercing van de schedel voor plasmide injectie zonder beschadiging van de hersenen, terwijl voor de vloeistof is geoptimaliseerd laden en vrijval van het DNA. De buitendiameter kan worden gemeten door te kijken naar het uitgesneden topje van de glazen microinjection pipet apposed aan een bar Micrometrische schaal onder een Microscoop helder veld. - Gebruik een spuit te vullen van de micropipet met minerale olie van het unpulled einde (tot uitzetting van alle lucht).
- Plaats de micropipet gevuld glas in de nano-injector door het volgen van de instructies van de fabrikant.
- Lege 2/3rds van het glas micropipet (Houd er genoeg olie om te voorkomen dat de vermelding van de lucht).
- Kies een van de eerder bereid glazen microinjection pipet opgeslagen in een schoon vak of petrischaal en gebruik kleine pincet te snijden het uiteinde van de pipet op schuine wijze tot een buitendiameter van ongeveer 15 µm.
- Zorgvuldig de bereid micropipet invoegen in de buis met de plasmide/kleurstof oplossing en vul de glazen micropipet met de plasmide/kleurstof oplossing.
3. collectie van muis embryo's van zwangere koeien
- Het bewaken van vrouwelijke fokdieren dagelijks te beoordelen voor vaginale inpluggen, bij voorkeur op hetzelfde moment dagelijks (begin van de middag). Dag e0.5 komt overeen met de eerste dag wanneer een vaginale plug wordt waargenomen.
Opmerking: De hier beschreven experimenten kunnen worden uitgevoerd in wild-type muizen. Ter vergemakkelijking van de identificatie van de MGE en op het etiket van alle GABAergic INs (of zoals MGE afkomstige INs specifieke sub sets), transgene dieren kunnen echter worden gebruikt (bijvoorbeeld: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre met een Cre-reporter allel,4947,enz.). In deze situatie moet de experimentele plasmide geïnjecteerd express een andere fluorophore (bijvoorbeeld mCherry of TdTomato) zodat de visualisatie van de transfected INs (geel) die kan worden vergeleken met niet-transfected INs (groen). - Het vrouwtje op embryonale dag e13.5, offeren door nek dislocatie.
Opmerking: Verdoving agenten gegeven op het moment van offer IN migratie en overleving50,51 invloed kunnen en moeten worden vermeden. - Verzamelen van embryo's door C-section als volgt.
- Royaal spuiten de vrouwelijke buik met 70% ethanol. De buikhuid optrekken met een paar van gesteriliseerde pincet en, met de andere hand, gebruik gesteriliseerd chirurgische schaar te snijden van de huid van de buik.
- Met een tweede paar van gesteriliseerde pincet en schaar, de abdominale fascia optrekken en snijd het terwijl het zorgvuldig het vermijden van de baarmoeder.
- Met behulp van een derde paar gesteriliseerde pincet en schaar, trek de baarmoeder horens en snij ze uit het bekken holte. Plaats de ontleed uteriene hoorns in een steriele 60 mm petrischaal gevuld met neurale gebaseerde kweekmedium aangevuld met aminozuren, vitaminen en anorganische zouten (Zie Tabel van materialen voor commercieel beschikbaar product).
- Gebruik in een steriele bioveiligheid kabinet, twee paar fijne pincet (één in elke hand) om te ontleden de embryo's uit de placenta en de hoofden isoleren door onthoofding.
- Schuine kant-knippen de tip van een steriele 3 mL kunststof transfer pipette, gecombineerd de hoofden en overdracht hen in een nieuwe steriele petrischaal van 60 mm gelaagd met gestolde zwarte wax en gevuld met hetzelfde neurale gebaseerde aangevuld kweekmedium als hierboven.
Opmerking: Deze stap minimaliseert de overdracht van contaminanten (muis haar, bloed). De zwarte wax wordt gebruikt om het hoofd te stabiliseren tijdens dissectie. Voedingsbodems hoeft niet te worden zuurstof tijdens deze procedures.
4. intraventricular plasmide injecties en Ex Vivo Electroporation van de MGE
Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in het eerder bereid biosafety kabinet.
- Plaats de petrischaal 60 mm gelaagd met zwarte wax en met de onthoofde hoofden in neurale gebaseerde kweekmedium onder de verrekijker in het kabinet biosafety aangevuld.
- Stabiliseren van het hoofd, de rostraal deel naar rechts, met een fijne pincet met de linkerhand en gebruik de nano-injector in de rechterhand te injecteren van 1-2 µL van de plasmide/kleurstof-oplossing in de rechts laterale ventrikel.
Opmerking: Co expressie experimenten kunnen worden uitgevoerd door co-electroporating een plasmide redding en een plasmide shRNA-uitdrukken door het mengen van beide plasmiden bij de concentraties van het mengsel. - Electroporate de ingespoten hersenen.
- Plaats het hoofd tussen de elektroden met de negatieve elektrode geplaatst dorsally en evenwijdig aan het hoofd en de positieve elektrode naar de ventrale zijde van het hoofd te richten op de MGE.
- Zodra de elektroden goed geplaatst zijn, leveren 4 vierkante pulsen van 40 V voor 50 ms bij 500 ms Inter pulse intervallen.
- Verwijder eventuele resterende weefsel van de elektroden met pincet reeds geplaatst in het biosafety kabinet.
Opmerking: Deze parameters zijn geoptimaliseerd specifiek voor de electroporator gebruikt in onze experimenten. Het is raadzaam dat de gebruikers optimaliseren tests vooraf uitvoeren als gebruiken van een verschillend type van electroporator. - Herhaal stap 4.1 tot 4.3 voor alle resterende hersenen.
Opmerking: Hoewel dit protocol de manipulaties vereist voor één hersenen beschrijft, is het mogelijk om te injecteren maximaal 4 hersenen sequentieel voordat electroporating elke hersenen, waardoor de opbrengst. Deze strategie is vooral voordelig wanneer 2 of meer verschillende plasmiden zijn ingespoten sequentieel (bijvoorbeeld controle of experimentele plasmide) tijdens hetzelfde experiment (waardoor vergelijking tussen nestgenoten). Daarnaast is het mogelijk om te injecteren en electroporate tegelijk beide kanten van de hersenen te verhogen van het rendement, door de positionering van de elektroden volledig parallel aan het oppervlak van de hersenen.
5. brain dissectie en Organotypic Slice culturen
- Terwijl nog manipuleren in de steriele omgeving van het biosafety kabinet, ontleden de hersenen uit de schedel.
- Het stabiliseren van het hoofd op de laag van zwarte was door het invoegen van een naald in elk van beide ogen terwijl het zorgvuldig het vermijden van de hersenen.
- Gebruik een paar fijne pincet te houden van de linker zijkant van de nek en een tweede paar fijne pincet te scheuren van de huid van de schedel, van terug naar voorzijde.
- Houd het hoofd zijdelings met een pincet in de ene hand en kunt een ander paar pincet in de andere hand zorgvuldig gesneden de schedel op het niveau van de hersenstam en trek voorzichtig de schedel. Met elke pincetten, snij de schedel in het sagittale vlak (middellijn) naar voren en vervolgens incise lateraal te bevrijden van de fragmenten van de schedel.
- Til de hersenstam en de hersenvliezen en de hersenzenuwen zorgvuldig gesneden tot de hersenen volledig uit de schedel is.
Opmerking: Alle stappen die worden beschreven in punt 5.1 moeten worden uitgevoerd onder strenge steriele omstandigheden in een kabinet bioveiligheid.
- De hersenen in 4% laag-melting point agarose voor afdelen insluiten.
- Vul een 35-mm petrischaal met de agarose oplossing bereid boven (vloeibare gehouden bij 42 ° C).
- Breng snel een electroporated hersenen aan de agarose gevulde schotel met behulp van de eerder gesneden overdracht pipet. De schotel houden bij kamertemperatuur.
- Roer de agarose met een metalen stok om te houden van de hersenen in het midden van de put (om te voorkomen dat zinken) en de positie van de hersenen in een rostro-caudal vlak evenwijdig aan de schotel. Stoppen met roeren wanneer het agarose begint te stollen, om te voorkomen dat eventuele schade aan de hersenen.
- Gebruik een scheermesje te snijden de agarose rond de hersenen om te vormen van een rechthoekig blok, waardoor een marge van 1-2 millimeter rond de hersenen. Zorg ervoor dat de rostraal deel van de hersenen loodrecht op de voorste grens van het blok om de afdrukstand voor de volgende vectorafbeeldingsbestanden stappen.
- Herhaal voor elke hersenen.
Opmerking: Het is mogelijk om meer dan één hersenen tegelijk (maximaal 3) gesneden door de indeling van afzonderlijke agarose blokken tijdens het instellen van elke hersenen op verschillende hoogtes.
- Vibratome coronale secties en segment cultuur.
- Dooi een aliquoot gedeelte van het 100 X N-2 (150 µL) aanvulling op ijs en voeg aan 15 mL aliquoted kweekmedium onder steriele omstandigheden.
- 750 µL cultuurmedium (met 1 X N2 supplement) overdragen aan elk putje van de plaat van een 6-well cultuur.
- Met gebogen pincet, één cel cultuur invoegen (30 mm diameter, 0.4 µm poriegrootte, PTFE) in elk medium gevulde goed te plaatsen.
- Vul het vibratome bad met continu zuurstofrijk ACSF. Koelen tot 4 ° C met ijs rond het bad, of gebruik een gekoelde vibratome.
- Zet de snelheid van de vibratome naar 0.150 mm/s en de frequentie aan 80 Hertz.
- Lijm het agarose blok op het platform van de vibratome, de rostraal rand naar beneden en de ventrale rand geconfronteerd met de gebruiker.
- Snijd de hersenen in coronale secties te verkrijgen van 250 µm dik secties (bij 4 ° C).
- Verzamelen met gesteriliseerde spatels, 2-3 secties met de MGE en plaats alle secties van de hersenen van het ene dier op een enkel 30 mm membraan invoegt, terwijl het vermijden van overlapping tussen secties zorgvuldig. Plaats de invoegen in een put van een 6-well cultuur plaat (met 750 µL cultuurmedium aangevuld, zoals hierboven beschreven). U kunt ook kan elke sectie worden geplaatst op een aparte 13-mm diameter membraan in een 12-well cultuur bord gevuld met 500 aangevuld µl cultuurmedium. De hoeveelheid kweekmedium aanbevolen voor elk putje kunt de gedeelten van de hersenen te worden gevoed door de media zonder wordt ondergedompeld.
Opmerking: De stappen die worden beschreven in 5.3.6 en 5.3.7 worden niet uitgevoerd onder volledige steriele condities, tenzij de vibratome kan worden gesteriliseerd en kan worden gebruikt in een kabinet bioveiligheid. Het is daarom van cruciaal belang voor het uitvoeren van deze stappen zorgvuldig om elke besmetting te voorkomen. Passende beschermende uitrusting (schone masker, chirurgische handschoenen en laboratoriumjas) moet gedragen worden in alle tijden en lichaamsdelen, zelfs vallen, zoals haren, gezicht en handen, moet cultuur platen (met of zonder kweekmedium) nooit voorbij. Het is ook aanbevolen om het spuiten van 70% ethanol vaak op de handschoenen en spatels gebruikt voor het verzamelen van de secties van de hersenen. - Plaats de plaat van de cultuur in een geventileerde steriele incubator bij 37 ° C met 60% vochtigheid en 5% CO2 voor 48 of 72 h.
Opmerking: Deze incubatie tijden werden geoptimaliseerd voor time-lapse beeldvorming van MGE afkomstige INs en confocal beeldvorming van vaste segmenten, respectievelijk. Optimale incubatie keer moeten vooraf worden getest voor elk experimenteel design. Bovendien, behoeft als de gekozen incubatie 72 h is en onder, niet te veranderen van het kweekmedium. Voor langere momenten van de incubatie, moet het kweekmedium worden gewijzigd om 2-3 dagen. - Na de gewenste incubatietijd, de secties van belang overbrengen in een 8-chambered dekglaasje aan en voeg 3-5 µL cultuurmedium. Plaats het dekglaasje aan in een milieu kamer (37 ° C, luchtvochtigheid van 60%, 5% CO2) op een omgekeerde aangesloten draaiende schijf confocal uitgerust met de software van een computer-assisted verwerving aan opstelling de time-lapse imaging sessie.
Opmerking: U kunt ook secties kunnen worden opgelost met 4% paraformaldehyde ('s nachts bij 4 ° C of 2 h bij kamertemperatuur) en vervolgens immunostained met verschillende antilichamen voor visualisatie van de morfologische kenmerken van electroporated INs onder een confocale Microscoop. Hoewel eGFP en mCherry kunnen worden gevisualiseerd door confocale microscopie zonder contra kleuring van proces, is het raadzaam het uitvoeren van immunohistochemistry tegen GFP en mCherry ter versterking van het signaal omdat de fixatie proces fluorescentie verminderen kan, verminderen het opsporen van fijnere onderdelen van embryonale neuronen, zoals kleinere takken in de voorloop- of naloopspaties processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze sectie bieden wij representatieve resultaten verkregen na de ex utero electroporation van een controle-plasmide of een experimentele plasmide gericht op een gen van belang, in de MGE van e13.5 muis embryo's gevolgd door organotypic segment culturen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 48 uur (voor time-lapse imaging) of 72 h (voor fixatie en labelen van immunohistochemical) (Zie figuur 1B voor schematisch protocol). Representatieve voorbeelden van INs migreren vanuit een MGE explant zijn ook geïllustreerd (Zie Figuur 1 c voor schematisch protocol) als een vergelijking met de hier beschreven methode. De electroporation van een plasmide in MGE progenitoren lijkt te vertragen van de uitgang van INs uit de MGE en cultuur tijd moet dienovereenkomstig worden aangepast.
In een succesvolle experiment, organotypic plakjes gezond onder de confocal microscoop lijken, d.w.z. corticale lagen zijn gemakkelijk te onderscheiden met de heldere veld modus en er is geen zichtbare verontreiniging op het oppervlak van het segment (herkenbaar door intens autofluorescence en de aanwezigheid van fluorescerende filamenten zichtbaar onder epifluorescence). In gezonde chronische organotypic plakjes ondergaan ongeveer 20% van de cellen apoptosis na 72 uur in cultuur (Figuur 2), zoals eerder is beschreven in chronische organotypic culturen (bv postnatale culturen)52. Bruto cytoarchitectural hersenstructuur blijft echter goed gedefinieerd, als geïllustreerd hier met behulp van DAPI kleuring (figuur 2A). Ons protocol voor ex vivo electroporation van de MGE levert een gemiddelde van 50-100 transfected cellen per segment (figuur 3AB), van welke 5-20 cellen zal blijken migreren dorsally na 72 uur in cultuur. Na fixatie en immunohistochemische kleuring, kan INs tangentieel naar de corticale plaat migreren gemakkelijk worden geïdentificeerd met confocale microscopie als ze aanwezig een langwerpige/ovaal cel lichaam, de occasionele achterstand proces en een toonaangevende proces tangentieel georiënteerd. De toonaangevende proces meestal leidt tot een of twee takken en is herkenbaar door de aanwezigheid van een af en toe zwelling voor de nucleus (huisvesting de centrosoom vóór nucleokinesis) en de groei kegels aan het einde van elke tak. (Figuur 3 c-G).
Dit protocol werd ontworpen voor de waarneming van migreren MGE afkomstige INs op het niveau van de eencellige met behulp van time-lapse imaging. Voor dit bijzondere experiment (Figuur 4), coronale organotypic hersenen segmenten waren gegenereerd op basis van Dlx5/6Cre; RCEEGFP embryo's electroporated op e13.5 met een plasmide uiting geven aan een experimentele shRNA (gericht op een gen van belang) en de cassette TdTomato . De plakjes waren gedurende 48 uur geïncubeerd, overgebracht naar een 8-well chambered dekglaasje aan schotel (1 schijfje per kamer drijvend op een dun laagje aangevuld kweekmedium) en beeld van elke 3 minuten voor 6-8 h met gebruikmaking van een doelstelling van de lucht (0.70 nvt) 20 x op een omgekeerde Microscoop uitgerust met een draaiende schijf confocal kop, een software voor computerondersteunde overname en een etappe-top milieu kamer. Tijdens imaging, werden de segmenten werden bewaard bij 37 ° C en continu zuurstof en bevochtigde in het milieu huis (5% CO2 en 60% H2O). INs Electroporated MGE afkomstige werden als zodanig geïdentificeerd door hun expressie van eGFP, bevestiging van de identiteit van hun GABAergic IN, en hun uitdrukking van TdTomato, waarin wordt bevestigd dat zij de experimentele plasmide (figuur 4AB) uiten. Electroporated INs zijn gemakkelijk herkenbaar en goed geïsoleerd, zoals te zien in Figuur 4, waardoor voor de fijnere analyse van migratie dynamische parameters, zoals snelheid en afstand reisde. Daarnaast gelabelde INs zijn gezien tangentieel migreren naar de corticale plaat, terwijl in hun natuurlijke omgeving, waardoor we om dynamische morfologische veranderingen zoals de vertakking van de leidende proces en de nucleokinesis (figuur 4C te identificeren -F).
De ex vivo electroporation van MGE afkomstige INs kan ook worden gecombineerd met MGE explantaten om hoge resolutie beeldvorming van dynamische cytoskeletal processen die zich voordoen tijdens de migratie als een aanvulling op de studie van de directionaliteit en trekkende dynamiek in organotypic culturen. Als voorbeeld, de verschillende fasen van neuronale voortbewegen denken aan degenen die zich voordoen tijdens de tangentiële migratie van INs in organotypic segment culturen kunnen worden waargenomen in electroporated INs migreren vanuit een MGE explant 48 h na electroporation, zoals regelafstand de verlenging van de neurite en nucleokinesis (figuur 5B-E). Diverse cytoskeletal processen kunnen vervolgens worden bestudeerd op hoge resolutie in geïsoleerde cellen migreren vanuit een MGE explant, bijvoorbeeld door F-actine structuren met phalloidin (figuur 6A), die niet optimaal worden verwezenlijkt in organotypic plakjes kleuring gezien de hoge dichtheid van de cellulaire (en dus van cytoskeletal elementen) in een inheemse milieu. Deze cytoskeletal processen, en in het bijzonder F-actine Remodellerend, kunnen verder bestudeerd worden dynamisch door het combineren van Lifeact expressie met time-lapse beeldvorming. Bijvoorbeeld, laten we een voorbeeld van high-resolution time-lapse beeldvorming van een IN afgeleid van een MGE explant verkregen uit een Nkx2.1Cre; RCEEGFP muis hersenen voeren een gerichte schrapping van een gen van belang in modules. Deze IN was transfected met de mCherry-Lifeact-7 plasmide onder de controle van de CMV-promotor (geschenk van Michael Davidson), met behulp van de methode geschematiseerde in Figuur 1 c, waardoor het volgen van het F-actine remodelleren die zich voordoen in real-time (figuur 6b). dus, terwijl organotypic culturen moet goed beoordelen directionaliteit of migratie pad van genetisch gemodificeerde INs, MGE explantaten aanvulling kunnen zijn op dergelijke studies door het verstrekken van betere toegang tot geïsoleerde cellen voor hoge resolutie beeldvorming van dynamische cytoskeletal processen.
Technische valkuilen kunnen leiden tot falen van de experimenten die hierboven beschreven. Bijvoorbeeld, de hersenen insluiten in een warmer dan 42 ° C agarose-oplossing kan leiden tot weefselvernietiging en neuronale dood, onthuld door een verlies van doorschijnendheid van de hersenen of de segmenten, die ondoorzichtig geworden. Echter, de temperatuur moet niet worden gehouden te laag is, zoals een solidifying agarose oplossing de fragiele embryonale hersenen tijdens het insluiten vernietigen kan. Ten tweede kan besmetting aanzienlijk verminderen de opbrengst van de experimentele benaderingen die hier worden beschreven. Dus, alle stappen moeten worden uitgevoerd met zorg, onder strenge steriele voorwaarden zoveel mogelijk. Alle oplossingen en apparatuur moeten vóór gebruik worden gesteriliseerd en apparatuur moet regelmatig worden besproeid met 70% ethanol om verontreiniging van bacteriën of schimmels te voorkomen. Besmetting kan worden zichtbaar rechtstreeks in de cultuur-putten, naarmate het kweekmedium gele of ondoorzichtig. Besmetting kan onopgemerkt wanneer het kweekmedium duidelijk en vloeistof blijft. Echter, een laag van schimmel op het oppervlak van het segment kan meestal worden waargenomen of de segmenten worden uiterst kwetsbaar tijdens de fixatie en kleuring stappen. Wanneer deze segmenten worden gevisualiseerd onder de Microscoop, besmetting kan zich manifesteren als een laag van autofluorescence over gelabelde neuronen of worden onthuld door de aanwezigheid van lange fluorescerende filamenten. Organotypic segmenten in verontreinigde putten gehouden moeten worden gegooid, maar de plakjes gekweekt in de andere putjes van de dezelfde plaat kunnen worden gehouden voor verdere stappen. Bacteriële besmetting is heel zeldzaam maar serieus moet worden genomen, wat betekent dat alle apparatuur, met inbegrip van gedeelde starterscentra en cultuur kamer handmatig moet worden gereinigd en gesteriliseerd.
Figuur 1: Schematische voorstellingen van de ex utero electroporation protocollen gevolgd door organotypic segment cultuur of MGE explants. A. voorbeeld van een kabinet setup van bioveiligheid met alle gesteriliseerde instrumenten die nodig zijn voor het protocol beschreven hier. B. Schematische weergave van het protocol dat wordt gebruikt voor de ex utero electroporation en organotypic segment culturen. Kortom, de embryo's zijn onthoofd, de experimentele plasmide wordt geïnjecteerd in de laterale ventrikel (1) en electroporated in de MGE (2). De hersenen is van microdissected uit de schedel (3) en ingebed in de agarose (4). Organotypic secties zijn gegenereerd op een vibratome (5) en geplaatst in cultuur op 37 °C(6) voor 48 h voor time-lapse microscopie (7.1) of 72 h voor cel reconstructies (7.2). C. schematische weergave van het protocol van Myers et al. 201353 aangepast en gebruikt voor de generatie van MGE explants. Kort, dorsolateral cortices zijn eerste ontleed uit van e12.5 naar e14.5 wild-type muis embryo's (1) en losgekoppeld mechanisch aangevuld kweekmedium (2). De cellen van de corticale zijn uitplaten aan een dichtheid van 5.25 x 105 corticale cellen/cm2 en gekweekte gedurende 2 uur bij 37 ° C in een collageen/poly-L-lysine-coated 8-chambered dekglaasje aan (3). Dan, e13.5 Dlx5/6Cre; RCEEGFP embryo's worden verwerkt voor ex utero electroporation van de MGE (4, 5) en de MGE handmatig is geïsoleerd van de hersenen en snijd in 100 µm2 fragmenten (6). Deze explantaten zijn vervolgens geplaatst op de top van de laag eerder bereid corticale feeder, bedekt met kweekmedium en co gekweekt voor 48u vóór time-lapse imaging (7). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: bewaard cytoarchitecture in plakjes van gezonde organotypic. De generatie van organotypic slice culturen na ex vivo electroporation van Nkx2.1Cre; RCEEGFP muis embryo's (A) niet leidt tot significante weefselschade, zoals geopenbaard door bewaarde cytoarchitecture (DAPI (blauw) en Cre-reporter (GFP)), in vergelijking met een 18 µm-dikke cryosection van een Nkx2.1Cre; RCEEGFP embryo transcardially geperfundeerd met 4% PFA op e15.5. D en M geven dorso-ventrale en latero-mediale assen, respectievelijk. (B). hoge vergroting beelden genomen met een omgekeerde confocal microscoop voorzien van een 63 x / 1.4 olie doelstelling na kleuring met een anti-gekloofd-Caspase 3 antilichaam (Cl-cas3) onthullen dat ongeveer 20% van de cellen in de corticale plaat ondergaan Apoptosis (witte pijlpunten) na 72 uur in cultuur, terwijl GFP-positieve INs gezond te blijven (witte pijl), zoals in de photomicrographs in C-C'' '. Ter vergelijking: cellulaire apoptosis is bijna volledig afwezig in de dunne cryosection van een perfused dier (D-D'' '). Schaal van de balken: 250 µm (A-B) en 15 µm (C-D'' '). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Organotypic segmenten van muizen brain embryo's en hoge vergroting photomicrographs van electroporated interneuronen (INs). A. een organotypic stukje cultuur uit een Dlx5/6Cre; RCEEGFP muis hersenen (waarin alle INs zijn groen) electroporated met een Dlx5/6::shRNAkrabbelde-IRES-TdTomato plasmide. Het segment werd bevestigd met 4% PFA na 72 uur in cultuur en immunostained voor GFP en mCherry. Electroporated INs waren beeld in 3D (50-60 µm-dikke z-stacks met optische secties genomen elke 0,5 µm) met behulp van een confocal microscoop uitgerust met een 63 x / 1.3 nb olie doelstelling. INs tangentieel migreren in de sub ventriculaire zone van de dorsale pallium zijn duidelijk herkenbaar (rood, open pijl). D en M geven dorso-ventrale en latero-mediale assen, respectievelijk. B. een representatieve organotypic segment cultuur vanuit een electoporated embryo wildtype (WT) met een besturingselement Dlx5/6::shRNAkrabbelde-IRES-TdTomato plasmide, vastgesteld op 72 h en immunostained voor mCherry alleen. Electroporated INs (rood) worden gezien naar de corticale plaat dorsally migreren. Electroporated INs worden geïdentificeerd door hun mede uitdrukking van TdTomato en EGFP in Dlx5/6Cre; RCEEGFP muizen (C-D), of door hun uitdrukking van TdTomato alleen in WT muizen (E-H), en door hun typische morfologie, d.w.z. een ovaal cel lichaam, een vertakte leidende proces (witte pijlpunten, D-H), een af en toe een achterstand van proces (witte pijl, C-D) en een occasionele zwelling van het toonaangevende proces huisvesting van het centrosoom voordat nucleokinesis (witte ster in C-C' en G). Schaal van de balken: 250 µm (A-B) en 25 µm (C-H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Time-lapse live-imaging van electroporated INs in organotypic plakjes gekweekte voor 48 h. INs electroporated op e13.5 met een experimentele plasmide uiting geven aan de cassette TdTomato en een shRNA gericht op een gen van belang zijn te zien in de tangentiële migratie in een organotypic hersenen segment verkregen uit een Dlx5/6Cre; RCEEGFP muis embryo na 48u van cultuur (A, Witte vierkantje). In B, de zelfde electroporated IN (wit vierkantje) is gezien in het proces van nucleokinesis, tijdens de migratie tangentieel in de cortex, dat wil zeggen parallel aan het pial oppervlak, en wordt gevolgd in time-lapse imaging elke 3 minuten voor 8 h met gebruikmaking van een 20 x / 0,85 nb lucht doelstelling (uitgebreide dozen, C-F). Een langwerpige cel lichaam (open pijl) in het proces van nucleokinesis (C), weergegeven het neuron in eerste instantie evenals een achterstand (witte pijl) en een vertakte leidende proces (witte pijlpunten). Na 3U voor live-imaging, de nucleokinesis is voltooid, de afsluitende proces heeft ingetrokken en de toonaangevende proces is het uitbreiden van twee lange takken (D, witte pijlpunten). Na 5 h 30 min, een van de toonaangevende proces tak heeft ingetrokken (witte pijlpunten) en het neuron cel lichaam (open pijl) is verhuisd naar voren ongeveer 10 µm (E). Ten slotte, na 8u voor imaging, migratie heeft onderbroken, het neuron heeft opnieuw haar leidende proces uitgebreid en een afsluitende proces (witte pijl) is verschenen, maar de kern (open pijl) heeft nog niet verplaatst toekomen (F). Schaal van de balken: 250 µm (A), 70 µm (B) en 30 µm (C-F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Time-lapse beeldvorming van INs afgeleid van een MGE explant gekweekte voor 48 h. INs worden gezien migreren uit een MGE explant verkregen uit een Nkx2.1Cre; RCEEGFP muis (in welke allemaal MGE-afgeleide INs express eGFP) electroporated met de CMV::mCherry-LifeAct-7 plasmide op e13.5, met behulp van de methode aangepast van Myers et al. 201353 en geschematiseerde in Figuur 1 c, en gekweekte voor 48 h (A). INs waren gevisualiseerd met behulp van time-lapse live-imaging voor 5 h (B-E). In dit voorbeeld een mede uiting geven aan eGFP en LifeAct in eerste instantie wordt gezien in het proces van nucleokinesis (open pijl) en strekt zich uit twee toonaangevende proces takken (witte pijlpunten; B). deze IN voltooit nucleokinesis na 1 h (zie pijl openen), zoals de cel lichaam voorwaarts heeft verplaatst en een afsluitende proces verscheen bij de achterzijde van het lichaam van de cel (witte pijl), en nog steeds een toonaangevende proces met twee takken (witte pijlpunten; weergeven C). een tweede nucleokinesis loopt na 2 h 30 min (open pijlen) en de IN is nu uitgerust met twee toonaangevende processen afkomstig van de cel lichaam en een meer achterstand proces (witte pijl; D). ten slotte, na 5 uur, de IN trekt een neurite terwijl translocating de centrosoom in de resterende leidende proces tak (witte pijlpunt) ter voorbereiding van een derde nucleokinesis, met een achterstand proces (witte pijl) nog aanwezig aan de achterzijde van de cel lichaam (E). Schaal bars: 70 µm (A) en 20 µm (B-E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: hoge-resolutie time-lapse imaging aan het remodelleren van actine in modules van een MGE explant gekweekt voor 48 h. A. Een segment van de organotypic van een Nkx2.1Cre; RCEEGFP muis hersenen wordt vastgesteld op e15.5, gekleurd met Alexa-594 Phalloidin, waardoor de visualisatie van draadvormige actine. INs zijn beeld met behulp van een 63 x / 1.3 nb olie doelstelling op een confocal microscoop. In gezonde modules, draadvormige actine is gezien de achterzijde van het lichaam van de cel na de intrekking van het afsluitende proces na de voltooiingvan nucleokinesis cupping (witte pijl, A'-A'' '). B. een MGE explant wordt zoals hierboven verkregen uit een Nkx2.1Cre; RCEEGFP muis hersenen een gerichte schrapping van een gen van belang en electroporated met een uiting van mCherry-Lifeact-7 onder de controle van de promoter CMV plasmide aan boord. Time-lapse levende imaging wordt uitgevoerd na 48u van cultuur en electroporated INs worden gevolgd om de 3 minuten gedurende 3 uur met een 40 x / 0,85 lucht doelstelling. Actieve verbouwing van het cytoskelet actine treedt op in de IN transfected met LifeAct, zoals wordt geïllustreerd door het verkeer van rood (wit in de zwart-wit beelden) TL stippen binnen de leidende proces en groei kegels (witte pijlpunten) en aan de achterzijde van de cel lichaam tijdens nucleokinesis (B-B'' ', witte pijlen). Schaal bars: 7 µm (A-A'' ') en 10 µm (B-B'' '). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel bieden wij een betrouwbare methode voor het uitvoeren van ex utero electroporation van de muis MGE op e13.5 en voor de generatie van organotypic culturen van embryonale hersenen segmenten. Hoewel in vitro methoden, zoals de Boyden kamer Assay, zijn relatief gemakkelijk uit te voeren en kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de specifieke rol van verschillende genen en eiwitten zonder tussenkomst van andere factoren, zij het onderzoek van de IN de weg dat migratie dynamiek met betrekking tot de directionaliteit en migratie pad25. MGE explantaten bieden een nuttig middel om te bestuderen van de dynamische cytoskeletal veranderingen tijdens de migratie, zoals we hier laten zien, maar zij verstoken van meest endogene signalen zijn en vereisen vaak de toevoeging van begeleiding signalen ter bevordering van neuronale migratie (hoewel dit aanzienlijk verbeterd wanneer MGE explantaten worden gekweekt op corticale feeder lagen)25,54. Toch kunnen testen op basis van MGE explantaten mislukken om te ontdekken de implicatie van moleculaire signalen die betrokken zijn bij de meer subtiele mechanismen zoals die begeleiden de specifieke directionaliteit of migratie pad van INs29. Dit probleem werd uiteindelijk omzeild door in utero electroporation25, waarmee de specifieke etikettering van MGE afkomstige INs migreren in hun oorspronkelijke omgeving13,29,41. Echter die techniek is vaardigheid-uitdagend, te wijten aan de betrokken chirurgische procedures, en de opbrengst wordt beperkt door de laag overlevingspercentage van embryo's en het feit dat de MGE moeilijk te richten in utero is, vaak vereist het gebruik van meerdere nesten te betekenis55bereiken. Vandaar, ex utero electroporation van de MGE gevolgd door organotypic cultuur van muizen hersenen embryo's biedt een goedkope, tijd-efficiënte en betrouwbare methode voor het onderzoeken van de dynamiek van de migratie en de morfologie van MGE afkomstige INs in hun natuurlijke milieu, terwijl het omzeilen van de chirurgische procedures van in utero electroporation en de behoefte aan begeleiding cues in MGE explantaten. Verder staat deze techniek een gemakkelijker toegang tot de MGE, die kan worden gericht door het rechtstreeks apposing van de positieve elektrode onder de hals en de negatieve boven op het hoofd, een moeilijker te nemen in uteroconfiguratie. U kunt ook de MGE focally kan worden geïnjecteerd en electroporated direct na het genereren van organotypic plakjes13,25,29, maar die techniek heeft bewezen moeilijker en minder effectief is in onze handen dan het protocol beschreven hier. De in dit artikel beschreven stappen volgt, krijgt een 50-100 electroporated MGE afkomstige INs per segment van de organotypic, 5-20 van die tangentieel migreren uit de MGE blijken zal na 72 h. Transfected INs live kunnen worden gevisualiseerd met time-lapse beeldvorming of verbeelde en gereconstrueerde na fixatie en labelen van immunohistochemical.
Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd om te studeren IN migratie ex vivo en was geïnspireerd door verschillende gepubliceerde protocollen beschrijven in utero electroporation van MGE afkomstige INs, ex vivo MGE injectie en electroporation, of de generatie van chronische organotypic hersenen segment culturen36,38,39,42,43,56,,57,58. Onze benadering van potentiële schade aan MGE progenitoren beperkt met behulp van lagere hartslag intensiteit (40 V) en intraventricular plasmide injecties in plaats van intra MGE injecties met hoogspanning pulsen (100 V), zoals elders beschreven39,56 ,57,58. Bovendien, terwijl anderen een combinatie van streptomycine, penicilline en gentamycine gebruiken ter voorkoming van bacteriële besmetting39,56,,57,58, wij hebben gekozen om te voorkomen dat antibiotica in onze cultuur medium omdat ze theoretisch IN migratie beïnvloeden kunnen. In het bijzonder penicilline is een antagonist van de GABAA receptor59,60, en GABAA receptor activering activeert en later stopt IN migratie afhankelijk van intracellulaire chloride verlopen en KCC2 expressie in verschillende fasen van migratie61. Echter, met behulp van de verschillende voorzorgsmaatregelen vermeld in het huidige protocol, besmetting effectief vermeden worden zelfs in de afwezigheid van antibiotica.
Ondanks de efficiëntie van deze aanpak in onze handen heeft ex utero electroporation ook zijn nadelen. Terwijl een natuurlijke driedimensionale omgeving voor cellen om te migreren, kan het moeilijk uit te voeren van farmacologische testen in organotypic segmenten in de context van migratie. Inderdaad, de migratie van MGE afkomstige INs hangt meestal extracellulaire signalen2,13,19 en de toepassing van farmacologische remmers of activators op organotypic segmenten niet mogelijk de precieze dissociatie van cel autonome effecten van globale effecten op de algehele gezondheid van het segment of de activiteit. Voor dergelijke experimenten wellicht MGE explantaten gegroeid van gemengde gedissocieerde corticale cellen beter organotypic segment culturen, omdat INs migreren uit de explant gemakkelijker kan worden geïsoleerd en selectief blootgesteld aan specifieke verbindingen62. Bovendien ex utero electroporation weliswaar eenvoudiger uit te voeren dan in utero electroporation, kan nog steeds worden technisch uitdagende op de embryonale leeftijd geïllustreerd hier gezien de kleine omvang en de fragiele staat van embryonale hersenen op E13.5. de onderzoekers moet een paar proeven efficiënt het uitpakken van de hersenen van de electroporated op e13.5 zonder beschadiging van de hersenen oppervlak. Bovendien, in tegenstelling tot de postnatale segmenten, kunnen niet embryonale organotypic segmenten worden bewaard in cultuur gedurende lange perioden van tijd. Hoewel embryonale organotypic segment culturen kunnen worden gehouden voor ten minste 7 dagen in vitro63, dit was niet gecombineerd met electroporation en de experimenten die hier beschreven zijn getest voor maximaal 3 dagen in vitro met betrouwbare resultaten in onze handen. Daarom, onderzoekers optimalisatie tests uitvoert vooraf als langere incubatietijd tijden nodig zijn. Verder, het onderzoek van ontwikkeling bij late embryonale of vroege postnatale stadia niet met deze techniek wordt aanbevolen bij het gebruik van e13.5 embryo's25, maar met in utero electroporation, kan worden bereikt indien met succes electroporated embryo's terug in de baarmoederholte worden gebracht en worden geboren en geanalyseerd op latere stadia21,64kunnen worden overgelaten. Ten slotte, ex utero electroporation gevolgd door organotypic segment culturen staat voor de analyse van zowel de morfologie en de dynamiek van de migratie van ontwikkelingslanden INs. Echter, zoals het al eerder aangaf voor de in utero electroporation techniek36, ex utero electroporations opbrengst van 50-100 electoporated cellen per segment van de hersenen en zijn dus niet geschikt voor analyse van de bevolking. Dergelijke onderzoeken zijn beter in diermodellen uitvoering van een volledige of voorwaardelijke schrapping (of knock-in) van het gen van belang. Indien beschikbaar, deze modellen kunnen vervolgens efficiënt worden gebruikt voor het genereren van organotypic segment culturen of MGE explants om te visualiseren van de werkelijke dynamiek van migratie, zoals hier aangetoond (Zie Figuur 5 en Figuur 6).
Veel stappen in dit protocol moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om het verkrijgen van optimale resultaten. Bijvoorbeeld, is het primordiaal dat alle stappen worden uitgevoerd onder strenge steriele condities, zoals besmetting kan vrij gemakkelijk optreden. Handschoenen en instrumenten die worden gebruikt buiten de kast bioveiligheid moeten worden besproeid met 70% ethanol vaak gedurende de gehele procedure. Bovendien oplossingen zoals cultuurmedia en kunstmatige cerebrospinale vloeistof steriel moeten worden bewaard en koud (4 ° C), en maakte fresh elke 2-3 weken. Om MGE afkomstige INs meer in het bijzonder een label, plasmiden die zal worden gebruikt in dergelijke experimenten onder de controle van de promotor van een IN-specifieke moeten worden gekloond (ex: Dlx5/649, Lhx665), in plaats van simpelweg vertrouwen op de anatomische doelgerichtheid van de MGE. De generatie van organotypic segmenten vereist de hersenen in leven te blijven. Dus, om te bewaren cell gezondheid en voortbestaan, dit experiment moet worden uitgevoerd in minder dan 3 uur vanaf het moment dat de embryo's tot de segmenten van de organotypic worden in cultuur gebracht worden opgehaald. Voor tijd-efficiëntie, kunnen cultuur platen vooraf gevuld met zelfgemaakte kweekmedium net voordat het experiment en gebracht worden in de 37 ° C incubator voor de cultuur van de cel tot gebruik. Bovendien, de hersenen moeten worden zorgvuldig ontleed uit de schedel zonder schade aan de corticale oppervlakte teneinde goede inbedding in de agarose oplossing en de daaropvolgende vibratome-segmenteren. Bijvoorbeeld, kan schade aan de corticale oppervlak, zelfs minimale, resulteren in het detachement van de 250 µm dik secties uit de omliggende agarose gel of in afbraak van de secties tijdens de vibratome segmenteren. Voor neuronale overleven, het is ook cruciaal dat de agarose oplossing temperatuur dicht bij 42 ° C blijft, zoals hogere temperaturen tot weefsel schade en cel dood, leiden terwijl lagere temperaturen zal onmogelijk zijn de juiste inbedding van de hersenen (of beschadigen tijdens het insluiten van het proces). Eenmaal in cultuur, om te voorkomen dat andere bronnen van verontreiniging, de segmenten moeten niet worden gemanipuleerd voordat ze worden overgebracht naar de Microscoop voor afbeeldingen. Deze stappen moeten worden uitgevoerd in een gesteriliseerde omgeving en aandacht moet worden besteed niet te besmetten de platen na deze manipulaties, vooral als ze nodig hebben worden terug te zetten in cultuur voor latere opnieuw denkbaar. We raden ten slotte niet herstellende van een DNA-monster gemengd met laden kleurstof uit eerdere experimenten voor toekomstig gebruik, zoals we een aanzienlijke vermindering van de opbrengst van de electroporated neuronen met dergelijk materiaal constateren.
Kortom, het ex utero electroporation en organotypic segment cultuur protocol hierboven beschreven voorziet in de specifieke etikettering van MGE afkomstige INs op het niveau van eencellige en kan worden gebruikt om genetisch te manipuleren specifieke moleculaire emissieroutes naar studie van hun rol bij het reguleren van de morfologische veranderingen en migratie dynamiek van tangentieel migreren INs. Deze methode zorgt voor het snelle en goedkope vroege functioneel onderzoek van nieuwe kandidaat-genen geïdentificeerd door eencellige RNA sequencing van trekkende INs66,67 , of via Next Generation Sequencing van patiënten met neurologische stoornissen68,69,70. Deze techniek is uitgebreid gebruikt voor het bestuderen van de migratie in andere cel populaties, met inbegrip van piramidale cellen in de cortex en hippocampus70,71,72,73. Eenmaal onder de knie, zou het kunnen worden gebruikt om het imago van de recycling en handel van membraaneiwitten, zoals receptoren en kanalen met behulp van GFP-gelabelde proteïnen; de activering van de specifieke cellulaire signalering cascades met behulp van biosensoren74; of zelfs het toezicht op en de manipulatie van cellulaire activiteit met behulp van calcium imaging gekoppeld aan optogenetics in corticale INs, maar ook in andere hersengebieden, zoals de hippocampus, de amygdala of zelfs het striatum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen. De standpunten die hierin noodzakelijkerwijs niet de visie van de Minister van volksgezondheid of de regering van Canada.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de exploitatiesubsidies van de Savoy-Stichting en de Stichting CURE epilepsie en door apparatuur verleent van de Canadese Stichting voor innovatie E.R (confocal microscoop) en G.H (draaiende schijf confocal microscoop). E.R. ontvangt een carrière award van de Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) en uit de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek (CIHR; Young Investigator Award). G.H. is een senior geleerde van de FRQ-S. Le is de ontvanger van de Steriade-Savoy postdoctorale opleiding award van de Savoy Foundation, de CHU Sainte-Justine Stichting postdoctorale opleiding award en de FRQ-S postdoctorale opleiding award, in samenwerking met de Stichting van de sterren. Dit project is mogelijk gemaakt door hersenen Canada via het Canada hersenen onderzoeksfonds, met de financiële steun van Health Canada, toegekend aan L.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 serum-free supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 50X Serum-free neuron specific supplement |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11415064 | Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Horse serum, heat inactivated | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| Neurocell supplement N-2 100X | Wisent | 305-016 | Botteinstein's N-2 Formulation |
| VWR Square PETG Media Bottles 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| Class II Type A Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-540 | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.1 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.1 | |
| Sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| D+ glucose | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| Potassium Chloride | ThermoFisher Scientific | P217-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | BioShop | SPM400.500 | |
| Calcium chloride dihydrate | ThermoFisher Scientific | C79-500 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | BiosShop | MAG522 | |
| Agarose | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube | Drummond scientific | 1-000-800/12 | |
| Ethanol | VWR | E193 | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson & Co | 309646 | |
| Mineral Oil (heavy) | Rougier Pharma | ||
| WPI Swiss Tweezers #5 | World Precision Instruments | 504511 | 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these. |
| WPI Swiss Tweezers #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips |
| HTC Tweezers | World Precision Instruments | 504617 | 11 cm, Straight, flat |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these. |
| Dressing Forceps | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm, straight, serrated |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 504478 | 10.2 cm, full curve, serrated |
| DeBakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501996 | 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide |
| Fisherbran Microspatula with rounded ends | FisherScientific | 21-401-5 | You will need 2 of these. |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond scientific | 3-000-204 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm dish |
| Tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800 | 35-mm dish |
| Black Wax | FisherScientific | S17432 | |
| Transfer pipettes | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL, small bulb |
| Stereo Microscope | Leica Biosystems | Leica M80 | In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific) |
| Electro Square Porator | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & Co | 305127 | |
| Leica VT1000S Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM, Single edge razor blade | Electron Microscopy Sciences | 71952-10 | Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome |
| µ-Slide 8 well | Ibidi | 80827 | Pack of 15 |
| Millicell cell culture insert | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. |
| Leica DMi6000 microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Spinning disk confocal head Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 acquisition software | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell Stage top incubation system | Pathology devices | LC30030 | Provides Temperature, CO2 and humidity control. |
| SP8 confocal microscope | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Gift from Michael Davidson |
| Fast Green FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission |
References
- Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325 (2011).
- Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562 (Pt 1), 9-26 (2005).
- Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61 (2011).
- Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38 (1), 2019-2029 (2013).
- Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44 (2), 251-261 (2004).
- Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
- Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28 (1), 62-73 (2008).
- Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59 (5), 733-745 (2008).
- Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69 (4), 763-779 (2011).
- Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30 (20), 7072-7077 (2010).
- Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25 (24), 5691-5699 (2005).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H.
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30 (25), 8660-8670 (2010).
- Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. , (2017).
- Chu, J., Anderson, S. A.
- Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23 (4), 894-900 (2006).
- Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2 (2), e00031 (2010).
- Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63 (4), 466-481 (2009).
- Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120 (4), 503-535 (2010).
- McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165 (3), 775-784 (2004).
- Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109 (4), 400-404 (2005).
- Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7 (5), (2017).
- Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25 (15), 1221-1226 (2014).
- Zito, A., et al.
- Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25 (4), 991-1003 (2015).
- van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77 (1), 70-82 (2013).
- Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
- Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22 (3), 680-692 (2012).
- Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34 (14), 4941-4962 (2014).
- Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26 (10), 1131-1148 (2016).
- Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15 (3), S371-372 373-380 (2012).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
- Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97 (2), 287-292 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32 (2), 738-745 (2012).
- Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27 (14), 3875-3883 (2007).
- Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524 (2014).
- Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
- Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
- Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
- Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59 (5), 722-732 (2008).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20 (2), (2000).
- Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. , Plenum Press. (1985).
- Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30 (15), 5334-5345 (2010).
- Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118 (3), 516-526 (2013).
- Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865 (2016).
- Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92 (12), 1785-1791 (2014).
- Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34 (23), 7787-7801 (2014).
- Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28 (7), 1613-1624 (2008).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32 (49), 17690-17705 (2012).
- Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19 (1), 27-37 (1997).
- Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129 (1), 245-252 (2002).
- Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23 (4), 729-744 (2012).
- Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
- Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496 (1-3), 23-32 (2004).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62 (1), 53-71 (2009).
- Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15 (2), 229-237 (2016).
- Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
- Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7 (1), 4897 (2017).
- Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27 (12), 3078-3089 (2007).
- Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93 (5), e1035 1035-1048 (2017).
- Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656 (2017).
- Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23 (18), 4846-4858 (2014).
- Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501 (7466), 217-221 (2013).
- Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33 (21), 9122-9139 (2013).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
- Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
- Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).
