Summary
כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.
Abstract
GABAergic interneurons (INs) הם מרכיבים קריטיים של רשתות עצביים לנהוג קוגניציה והתנהגות. תוספות נועד לאכלס את קליפת להעביר tangentially את מקומם המוצא telencephalon הגחוני (ובכלל זה המדיאלי, סימטרית ganglionic הרוחביים (MGE, CGE)) לצלחת בקליפת המוח הגבי בתגובה מגוון של פנימי, חיצוני רמזים. מתודולוגיות שונות פותחו במהלך השנים גנטית לתמרן מסלולים ספציפיים ולחקור כיצד הם להסדיר את השינויים הדינמיים cytoskeletal הדרושים עבור נאות בהעברה. אלקטרופורציה בתוך הרחם נעשה שימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעה של דיכוי גנים או ביטוי ב- IN מסוימים תת תוך הערכת ההשפעה על מורפולוגיה והמיקום הסופי. עם זאת, בעוד גישה זו משמשת ברצון לשנות בצורה רדיאלית העברת תאים כפירמידה, זה יותר מבחינה טכנית מאתגר כאשר המיקוד מהווה בתוך הרחם אלקטרופורציה יוצרת תשואה נמוכה נותן שיעורי ההישרדות ירידה של הגורים כאשר אלקטרופורציה מבוצע לפני e14.5, כפי שמקובל כשלמדתי נגזר MGE הארצי. בגישה אלטרנטיבית, MGE explants מספקים גישה נוחה אל MGE וכדי להקל על ההדמיה של In מהונדסים. עם זאת, ב- explants אלה, תוספות נודדים אל מטריצה מלאכותיים, ללא הדרכה אנדוגני רמזים, תשומות דפנות התלמוס. זה הוביל אותנו כדי למטב את שיטת איפה הארצי יכול להעביר בסביבה יותר נטורליסטי, תוך עקיפת האתגרים הטכניים של גישות בתוך הרחם . בנייר זה, אנו מתארים את השילוב של הרחם לשעבר אלקטרופורציה מוח עובריים בעכבר ואחריו organotypic תרבויות פרוסה בקלות לעקוב אחר, תמונה, לשחזר מהונדסים תוספות מעבר לאורך שבילים טבעיים שלהם, בתגובה רמזים אנדוגני. גישה זו מאפשרת כימות שני של ההיבטים דינמי בהעברה עם הדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, כמו גם את ניתוח מפורט של פרמטרים שונים מורפולוגית באמצעות שחזורים העצבית על רקמת immunolabeled קבוע.
Introduction
GABAergic קורטיקלית interneurons (INs) מגוונים לגבי תכונותיהם הביוכימי, מאפיינים פיזיולוגיים וקישוריות, ולסיים הם פונקציות שונות רשתות בוגר1,2,3 ,4,5. המפרט של תתי סוגים שונים של תוספות קורטיקלית מוסדר בחוזקה דרך מפלי גנטי כי כבר למדה בהרחבה1,2. הרוב (70%) של תוספות GABAergic קורטיקלית מקורן אבות ב המדיאלי ganglionic קדושתו (MGE), מבנה עובריים ממוקם ventrally, ו עליך להעביר על פני מרחקים ארוכים יחסית כדי להגיע את צלחת קורטיקלית1, 2 , 6. בזמן תאים קורטיקליים כפירמידה להעביר בצורה רדיאלית מאזור חדרית (VZ) לצלחת קורטיקלית לאורך לגרדום עכשיו רדיאלי, דונלד, ההעברה וקולו של תוספות, אשר לא צורפו כזה גרדום, דורש מגוון מהותי ו הסימנים החיצוניים כדי למשוך נוירונים נודדים כלפי הלוח בקליפת המוח, בזמן מנחה אותם הרחק מבני קורטיקלית-2,-7,-8. לאחר היציאה מחזור התא, תוספות הם שמופץ מ MGE על-ידי רמזים כימותרפיה-דוחה הביע בתוך VZ של MGE, אשר מפעיל העברה משיק לקראת9,קורטיקלית צלחת10. העברת תוספות למנוע את סטריאטום בעזרת רמזים שונים דוחה11 והם, כשמגיעים לצלחת קורטיקלית, להחליף בין וקולו מצב ההעברה רדיאלי להגיע אל המיקום למינריות הסופי שלהם, חלקית בתגובה רמזים של פירמידה תאים12 ו אחרים אוכלוסיות הסלולרית13. ההעברה של In, עבור אוכלוסיות עצביים אחרים, כרוך שינויים מורפולוגיים דינמיים שונים להתיר תנועת בפועל של הנוירון. ומכניקה עצביים כביכול זו מאופיינת מחזורים חוזרות של שלושה שלבים רצופים: התארכות של תהליך מוביל, של תנועה anterograde פעיל של הגרעין (nucleokinesis), משיכת תהליך נגרר14. בהעברה מוסדר על ידי רמזים רבים פנימי ולא חיצוני להסיע את מסעף ו שיפוץ פעיל של התהליך מוביל להנחות הארצי בכיוון הנכון, קביעת כיוון ומהירות ההעברה14,15 ,16.
גורמים ויסות קורטיקלית בהעברה נחקרו בהרחבה בשנים האחרונות1,2,7,17,18,19,20, יש כבר שמהווה שיבוש בחלק מן השחקנים מולקולרית להוביל להפרעות התפתחותיות, כגון רפואת ילדים עקשן אפילפסיה או אוטיזם ספקטרום הפרעות1,2,21, 22 , 23 , 24. לפיכך, הפיתוח של גישות שונות במבחנה , ויוו יש כנראה תפס לקדם בצורה משמעותית את היכולת שלנו ללמוד תהליך דינמי זה, כפי שנבדקו בעבר25. במבחנה שיטות, כולל וזמינותו קאמרית בוידן, פס בחירה וזמינותו, לספק את האמצעים והמהירה ביותר לשחזור להעריך את הדרישה וההשפעה התא האוטונומי של גנים ספציפיים או חלבונים במהלך ההעברה עצביים, ללא השפעת גורמים אחרים25. אלה מבחני שימושיות במיוחד בשילוב עם הדמיה live8,26,27. עם שיטות אלה, הן בקלות שאוחזר מ- e13.5 MGE והתבניות מבודדת על ידי דיסוציאציה אנזימטי ועל מכניים, אחרי אשר איתות המסלולים שונה, הדרכה רמזים יכול ייחקרו, כמופיע בעבר8,28 . עם זאת, אלה מבחני לקחת את המקום מטריצה חוץ-תאית מלאכותי בהיעדרו של רקמות תלת מימדי אדריכלות, אשר עשוי לשנות מאפייני התנהגות של תאים עצביים, פוטנציאל להשפיע תא העברה ו/או הישרדות25. כדי לעקוף את מגבלות אלה, פותחו vivo לשעבר MGE explants ככלי חלופי כדי לכמת את השינויים מורפולוגי דינמיים המתרחשים במהלך ההעברה יחד עם פרמטרים כגון מהירות וכיוון14, 29. MGE explants הוא יחסית פשוט ושוויונית כבר בהרחבה תיאר במקום30. היא מצריכה את ציפוי של תמצית קטנה של MGE על טפט של תאים קורטיקליים מעורבת, או בתערובת של matrigel וקולגן בנוכחות רמזים מושך או דוחה25, למרות האחרונים הם אופציונליים31. MGE explants לאפשר רזולוציה גבוהה הדמיה של תאים עם תוויות בדלילות, לפשט את המחקר של תהליכים תאיים, כגון שיפוץ cytoskeletal בתהליך המוביל הסתעפות, כפי שמוצג בעבר32,33 ,34 , במחקר הנוכחי. MGE explants שימשו בהצלחה כדי להעריך שינויים cytoskeletal דינמי במהלך ההעברה בסביבה דו-מימדית, למשל לאחר ספציפי מניפולציות תרופתי או chemotactic (ראה, לדוגמה, Tielens. ואח 201633) . אולם, עם גישה זו, תוספות להעביר במסגרת מלאכותי, זה עשוי לשנות ב התנהגות הפארמצבטית ואת המשמעות של תוצאות הניסוי.
לעומת זאת, בתוך הרחם אלקטרופורציה מאפשר מניפולציה גנטית של תוספות בסביבתם הטבעית, היא שיטה הנפוצה להעריך במהירות וביעילות את ההשפעה של רווח הפסד של תפקוד הגן תוך עקיפת המגבלות של נוקאאוט יקר וארוך, טוק-in אסטרטגיות25,35. אלקטרופורציה בתוך הרחם עלולים להיות מוטים לכיוון בבית אבות באמצעות תא סוג ספציפי היזמים ועל ידי מיקום האלקטרודות לכיוון מבני ventromedial, כולל את MGE36. יתר על כן, בתוך הרחם אלקטרופורציה מאפשר ביטוי בזמן של בונה ניסיוני בתוך 1-2 ימים, לעומת 7-10 ימים נדרש לבנות ביטוי באמצעות ויראלי המומנט25. עם זאת, בתוך הרחם אלקטרופורציה של בבית אבות נוטה להיות תפוקה נמוכה. למרות אבות תא כפירמידה ממוקם באזור הגבי חדרית יכולה להיות transfected ביעילות באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה, פילוח יותר ventrally ממוקם מבנים, כגון MGE, הוא יותר מבחינה טכנית מאתגר, בפרט קטן e13.5 עוברי, השיעור הגבוה של עובריים קטלני עוד יותר מפחית את התשואה ניסיוני25.
כדי לעקוף חלק המגבלות הטכניות הקשורות במבחנה MGE explant הניסויים ולא אלקטרופורציה ויוו ברחם , שמחוץ organotypic פרוסה תרבויות היה מפותח8,37, 38,39. המוח organotypic פרוסה תרבויות מציעים תנאים היתרון מחקה ויוו , בעת היותו פחות יקרים ולגזול מאשר חיה ביצירת מודלים25. אכן, הכנות אלה מאפשרים גישה נוחה MGE, יחד עם הפריט החזותי ספציפי של תוספות, ולא יכול להיות משולב עם מוקד אלקטרופורציה לחקור מסלולים מולקולריים ספציפי ב- INs נודדות סביבה יותר פיזיולוגית8 , 39 , 40 , 41. אנחנו ולכן יש אופטימיזציה גישה עבור organotypic תרבויות38, אשר אנחנו בשילוב עם רחם לשעבר אלקטרופורציה והדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, בכדי להעריך את תהליך דינמי מורפולוגיים המתרחשים במהלך ההעברה וקולו של MGE-In. בפרוטוקול הנוכחי הותאם וממוטב אחרים אשר השתמשו לשעבר הרחם או בתוך הרחם המוח אלקטרופורציה organotypic פרוסה תרבויות ללמוד את ההעברה של תאים כפירמידה42,43 ו בקליפת המוח תוספות36,39,44. באופן ספציפי, העכבר העוברים נמצאים ערף, MGE הוא electroporated vivo לשעבר לאחר הזרקה ע של פלסמידים ניסיוני, ומאפשר יותר יעיל, מדויק פילוח של אבות MGE מאשר מה ניתן להשיג באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם . המוח ואז מופקים למחלקה לפרוסות הילתית כל המוח זה יכול להיות תרבותי לכמה ימים, ובכך מאפשר רציפה מעקב, הדמיה של transfected In. גישה זו תוויות בדרך כלל 5-20 tangentially העברת תוספות לחתיכה המוח, למזער את מספר האיטראציות ניסיוני נדרש להגיע מובהקות סטטיסטית, תוך תיוג אוכלוסיה עצביים דליל מספיק כדי להבטיח הפרדת קל נוירונים בודדים עבור שחזור והערכה מורפולוגי משובחים. יתר על כן, בהשוואה ל- MGE explants, organotypic תרבויות להבטיח כי העברת תוספות נחשפים סביבה טבעית יותר, כולל נוגדנים מופרשים באופן מקומי, תשומות מ afferents דפנות התלמוס. גישה זו מתאימה מאוד ובכך לכמת את כיוון והנתיב נודדות שאומצה על ידי transfected In, תוך מתן פרטים אנטומיים מספיקים כדי לאפשר אפיון תהליכים דינאמיים עדינה יותר כגון מוביל תהליך הסתעפות, nucleokinesis, נגררים תהליך הכחשה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המערבות בעלי חיים אושרו על-ידי les avec Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques Animaux דה Recherche (CIBPAR) במרכז המחקר Sainte-ז'וסטין צ'ו ולא נערכו על פי המועצה הקנדית על המדריך של חיה אכפת טיפול ושימוש של חיות ניסוי (גליון 2).
הפרוטוקול המתואר כאן היה ממוטב אלקטרופורציה העובר ביום עובריים (e) 13.5, בכל פעם כאשר נגזר MGE הארצי באופן פעיל נוצרים, לפני שיא של CGE, נגזר תוספות ייצור45,46. יתר על כן, הטיה של אלקטרופורציה לכיוון GABAergic הארצי, אנו משתמשים מקדם באופן סלקטיבי לידי ביטוי תוספות (למשל Dlx5/6 יזם עם שיפור מינימלי שלה)47.
1. הכנה של פתרונות אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic
- להכין 125 מ של אמצעי התרבות סטרילי.
- למדוד 125 מ של מדיום תרבות ספציפית נוירון רגיל (ראה טבלה של חומרים ניסוח) בבקבוק מעוקר ב אבטחה קודם לכן עיקור UV ארון ריסס עם 70% אתנול. הוסף 2.25 מ של 50 x ספציפי נוירון סרום ללא תוספת, 1.75 מ של גלוטמין 200 מ"מ (הריכוז הסופי של 0.5 מ מ), 6.25 מ של הסוס לא פעיל חום סרום בעבר aliquoted בתנאים סטריליים. לערבב ביסודיות, aliquot ב- 15 מ"ל צינורות חרוט סטרילי, ולאחסן ב 4 º C.
הערה: בינוני תרבות מוכן ניתן לאחסן עד 3 שבועות ב 4 º C. - לחלק 100 X פתרון מניות של ניסוח של Botteinstein N-248 aliquots µL 150 בתנאים סטריליים ומקפיאים ב-20 ° C עד השימוש.
- למדוד 125 מ של מדיום תרבות ספציפית נוירון רגיל (ראה טבלה של חומרים ניסוח) בבקבוק מעוקר ב אבטחה קודם לכן עיקור UV ארון ריסס עם 70% אתנול. הוסף 2.25 מ של 50 x ספציפי נוירון סרום ללא תוספת, 1.75 מ של גלוטמין 200 מ"מ (הריכוז הסופי של 0.5 מ מ), 6.25 מ של הסוס לא פעיל חום סרום בעבר aliquoted בתנאים סטריליים. לערבב ביסודיות, aliquot ב- 15 מ"ל צינורות חרוט סטרילי, ולאחסן ב 4 º C.
- להכין 1 ליטר של נוזל מוחי שדרתי מלאכותי סטרילי (כלנית חדד).
- למדוד 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1 ליטר. להוסיף 25.67 גר' סוכרוז, 5.08 גר' נתרן כלורי (NaCl), 2.18 גר' נתרן ביקרבונט (NaHCO3), 1.80 גר' גלוקוז, 0.19 g של אשלגן כלורי (אשלגן), 0.15 גרם monobasic נטול מים סודיום פוספט (NaH2PO4), 1 מ"ל של 1 מ' מניות CaCl2 .2H2O ו- 2 מ של 1 מ' במניה MgSO4.7H2O. מערבבים כדי להמיס בטמפרטורת החדר. להוסיף מים מזוקקים להגיע הנפח הכולל של 1 ל'
- באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22, לסנן את הפתרון לתוך בקבוק סטרילי ב אבטחה סטיריליים ארון ולאחסן ב 4 ° C עד כחודש.
- להכין פתרון טריים של 4% agarose ב כלנית חדד לפני ניסוי.
- למדוד 25 מ של חנה המבר בעבר מוכן צינור חרוטי סטרילי 50-mL ולהוסיף 1g של agarose נקודת התכה נמוכה.
- חום במשך 45 s בתנור מיקרוגל. כדי למנוע את שפיכת, פסיקה חימום כל 3-4 s כאשר רותחים מתחיל, פתח הצינור לשחרר את הלחץ החוצה, יסגרו אותו שוב, להתסיס באופן ידני כדי לערבב את agarose. חזור עד הפתרון agarose הוא הומוגני. שמור את הפתרון agarose ב 42 ° C במהלך השארית של הניסוי כדי למנוע ייבוש.
הערה: טמפרטורות גבוהות יותר יגרום נזק לרקמות המוח.
2. הכנה של פלסמידים להזרקה
- משוך על פיפטה microinjection זכוכית
- הגדר את פולר micropipette עם הפרמטרים הנכון, לאבטח את נימי זכוכית בחלל סיפק וודא כי ממורכזת עם חוט הלהט.
- לחץ על לחצן משיכה.
- הסר בזהירות פיפטות microinjection עשה לאחרונה את החום פולר, מקום בתיבה או צלחת פטרי נקי עד שימוש נוסף כדי למנוע נזק את הטיפ.
- אבטחה ארון עם כל הכלים הדרושים בשביל זה ניסוי (ראה איור 1 א'), בנדיבות לרסס כל הכלים באבטחה ארון עם 70% אתנול הקמה לעקר את הכלים ואת הסביבה עם אור UV למשך 15-20 דקות.
- במהלך השלב עיקור, להפשיר פלסמידים על קרח (4 ° C).
- מודדים 10 µL של פלסמיד פתרון מניות (4 µg/µL) לתוך שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 נקי. הוסף 0.01% FCF ירוק. לערבב בעדינות, ספין בקצרה, לשמור על הקרח עד השימוש.
הערה: מקסי-הכנה DNA כדאי להיערך על פי הפרוטוקול של היצרן באמצעות ערכת נטולת אנדוטוקסין מקסי-הכנה. יכול להיות solubilized DNA במאגר טה או נטול נוקלאז H2O והכנת פלסמיד עם צבע יכול פתרון, אבל לא צריך להתבצע בתנאים סטריליים. פלסמידים של מקסי-הכנה צריך להיות aliquoted כדי למנוע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה. פלסמידים aliquoted אמור. להיות מעורב עם לצבוע אין יותר את 2 h לפני השימוש, לא צריך להיות והוקפאו לשימוש נוסף. - לאחר עיקור, להכין את הננו-מזרק כדלקמן.
- בחר באחד פיפטה microinjection זכוכית בעבר מוכן מאוחסנים בתיבת נקי או צלחת פטרי, פינצטה קטנה להשתמש כדי לחתוך את קצה פיפטה בדרך משופע כדי להשיג את הקוטר החיצוני של בערך 15 מיקרומטר.
הערה: הקוטר החיצוני שניתנו כאן הוא אמצעי המשוער כדי להעניק למשתמש מושג במה להשתמש בניסויים שלנו ואת מוטבה כדי להקל על אקט של הגולגולת להזרקה פלסמיד ללא פגיעה במוח, תוך מתן אפשרות לקבלת נוזל טעינת ושחרור של ה-DNA. ניתן למדוד את הקוטר החיצוני על ידי הסתכלות על הקצה לחתוך הזכוכית microinjection פיפטה. אני בטוח לבר סולם מיקרומטר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. - השתמש במזרק כדי למלא את micropipette עם שמן מינרלי מסופה unpulled (לגרש את כל האוויר).
- הכנס את micropipette זכוכית מלא הננו-מזרק לפי הוראות היצרן.
- ריקה 2/3rds של micropipette זכוכית (שמירה מספיק שמן למניעת כניסת אוויר).
- בחר באחד פיפטה microinjection זכוכית בעבר מוכן מאוחסנים בתיבת נקי או צלחת פטרי, פינצטה קטנה להשתמש כדי לחתוך את קצה פיפטה בדרך משופע כדי להשיג את הקוטר החיצוני של בערך 15 מיקרומטר.
- בזהירות להוסיף את micropipette מוכן בצינור המכיל את הפתרון פלסמיד/לצבוע ולמלא את micropipette זכוכית עם הפתרון פלסמיד/צבע.
3. אוסף של העכבר העוברים מן הנקבות בהריון
- לפקח על רבייה נקבות מדי יום כדי להעריך המיועדים הנרתיק, רצוי באותו זמן מדי יום (בשעות הצהריים). יום e0.5 מקביל ביום הראשון כאשר נצפית פקק הנרתיק.
הערה: הניסויים המתוארים כאן יכול להתבצע בעכברים פראי-סוג. עם זאת, כדי להקל על הזיהוי של MGE לתייג כל תוספות GABAergic (או ערכות משנה ספציפיות כגון תוספות נגזר MGE), חיות הטרנסגניים ניתן להשתמש (למשל: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre עם אלל Cre-עיתונאי,47,וכו '49). במצב זה, פלסמיד ניסיוני מוזרק צריך לבטא fluorophore אחרת (למשל mCherry או TdTomato) כדי לאפשר ויזואליזציה של ה In transfected (צהוב) אשר ניתן להשוואה עם תוספות שאינן transfected (ירוק). - להקריב את הנקבה-עובריים ביום e13.5, על ידי הצוואר.
הערה: סוכנים הרדמה שניתן במועד של הקרבה עשוי להשפיע ב-50,של ההעברה והישרדות -51 , יש להימנע. - לאסוף העוברים על ידי קיסרי כדלקמן.
- תרסיס בנדיבות בבטן הנקבה עם 70% אתנול. תמשוך בעור בטן עם זוג מלקחיים סטיריליים ולהשתמש, ביד האחרת, מספריים כירורגיים סטיריליים לחתוך את העור מן הבטן.
- עם זוג השני של סטיריליים מלקחיים ומספריים, תעלה fascia בטן וחותכים אותו תוך הימנעות בקפידה את הרחם.
- באמצעות זוג שלישי סטיריליים מלקחיים ומספריים, משוך את הקרניים הרחם, לגזור אותם חלל האגן. מניחים את הקרניים הרחם ביתור בצלוחית סטרילי 60 מ מ מלא מבוסס על עצבי בינוני תרבות בתוספת חומצות אמינו, ויטמינים ומלחים אורגניים (ראה טבלה של חומרים למוצר זמין מסחרית).
- ב- cabinet אבטחה סטרילי, להשתמש שני זוגות של פינצטה בסדר (אחת בכל יד) כדי לנתח את העוברים מחוץ השליה ולבודד את ראשי ע י עריפת ראשו.
- שיקוע-חתך קצה פיפטה העברה פלסטיק mL 3 סטרילי, תשאף ראשי, העברת אותם בצלוחית חדש סטרילי 60 מ מ שכבתית עם שעווה שחור הקרושה ומלא אותו עצבית מבוססת שיושלם תרבות בינוני כמפורט לעיל.
הערה: שלב זה ממזער את העברת מזהמים (העכבר שיער, דם). שעווה שחור משמש כדי לייצב את הראש במהלך ניתוח. תרבות המדיה לא צריך להיות חמצן במהלך הליכים אלה.
4. ע פלסמיד זריקות ואלקטרופורציה Vivo לשעבר של MGE
הערה: השלבים הבאים חייב להתבצע בתנאים סטריליים ב אבטחה מוכן קודם לכן ארון.
- במקום 60-מ מ הפטרי שכבתית עם שעווה שחור, המכיל את ראשים ערופים ב עצבית מבוססת שיושלם תרבות בינוני תחת המשקפת ב אבטחה הקבינט.
- לייצב את הראש, החלק rostral פונה, עם פינצטה בסדר עם יד שמאל ולהשתמש הננו-מזרק ביד ימין להחדיר µL 1-2 של הפתרון פלסמיד/צבע לתוך החדר הימנית.
הערה: ניתן ביטוי שיתוף ניסויים שערך co-electroporating של פלסמיד הצלה, פלסמיד לבטא shRNA על ידי ערבוב בשני פלסמידים בריכוזים equimolar. - Electroporate המוח מוזרק.
- שים את ראשך בין האלקטרודות עם האלקטרודה השלילית dorsally ממוקם ומקבילי בראש את האלקטרודה החיובית כלפי הצד הבטני של הראש כדי למקד את MGE.
- ברגע האלקטרודות ממוקמות היטב, מספקים פולסים מרובע 4 של 40 V עבור ms 50-500 ms במרווחים הבין-דופק.
- הסר כל רקמות שיורית האלקטרודות באמצעות פינצטה שכבר התבצעו באבטחה הקבינט.
הערה: פרמטרים אלה מוטבו במיוחד עבור electroporator להשתמש בניסויים שלנו. אנו ממליצים כי המשתמשים לבצע בדיקות אופטימיזציה מראש אם באמצעות סוג אחר של electroporator. - חזור על הצעדים 4.1 4.3 כל המוח הנותרים.
הערה: למרות פרוטוקול זה מתאר המניפולציות נדרש מוח אחד, זה ניתן להזריק עד 4 מוח ברצף לפני electroporating כל המוח, ובכך מגדילים את התשואה. אסטרטגיה זו היא יתרון במיוחד כאשר פלסמידים 2 או יותר שונים מוזרקים ברצף (למשל שליטה או ניסיוני פלסמיד) במהלך הניסוי אותו (המאפשר השוואה בין הארנבונים מאותה). בנוסף, זה אפשרי להזריק electroporate בו זמנית שני הצדדים של המוח, כדי להגדיל את התשואה, על-ידי מיקום האלקטרודות מקביל לחלוטין פני השטח של המוח.
5. המוח לנתיחה ותרבויות פרוסה Organotypic
- זמן מניפולציה עדיין בסביבה סטרילית של אבטחה הקבינט, לנתח את המוח מחוץ לגולגולת.
- ייצוב הראש על השכבה של שעווה שחור על ידי החדרת מחט לתוך כל עין תוך הימנעות המוח.
- השתמש זוג מלקחיים בסדר להחזיק בצד שמאל של הצוואר וזוג תגליתו בסדר להרוס את העור מן הגולגולת, מתוך מהסוף השני.
- בעוד אתה מחזיק את הראש רוחבית עם פינצטה ביד אחת, להשתמש עוד זוג מלקחיים וביד השנייה כדי לחתוך בזהירות את הגולגולת ברמה של גזע המוח ומשוך בעדינות את הגולגולת למעלה. עם כל פינצטה, לחתוך את הגולגולת במטוס sagittal (קו האמצע) לחזית ולאחר מכן פצעים וחתכים רוחבית לשחרור חלקי הגולגולת.
- הרם את גזע המוח, לחתוך בזהירות את קרומי המוח ואת עצבי עד המוח היא לחלוטין לא הגולגולת.
הערה: כל השלבים המתוארים 5.1 צריכה להתבצע בתנאים סטריליים מחמירים ב אבטחה ארון.
- להטביע את המוח ב- 4% התכה נמוכה נקודת agarose על חלוקתה.
- למלא צלחת פטרי 35 מ מ עם הפתרון agarose המוכן מעל (כל הזמן נוזלי ב 42 ° C).
- במהירות העברה של המוח electroporated המנה מלא agarose באמצעות פיפטה של העברת לחתוך קודם לכן. שמור את המנה בטמפרטורת החדר.
- מערבבים את agarose עם מקל מתכת לשמור על המוח באמצע הבאר (כדי למנוע שוקע) ומקם את המוח על מטוס rostro-סימטרית במקביל המנה. תפסיק לערבב agarose מתחיל לגבש, כדי למנוע כל נזק מוחי.
- השימוש סכין גילוח לחתוך את agarose המקיפים את המוח כדי ליצור בלוק מלבני, משאיר שוליים של 1-2 מילימטרים מסביב למוחו. ודא כי החלק rostral של המוח הוא בניצב למגבלת הקדמי של הבניין כדי להקל על ההכוונה אופטים והשלבים הבאים.
- חזור על כל המוח.
הערה: זה אפשרי לחתוך מוח יותר מפעם אחת בכל פעם (מקסימום 3) ידי בעיצוב אבני agarose נפרד בעת הגדרת כל המוח בגבהים שונים.
- Vibratome מקטעים הילתית ותרבות פרוסה.
- הפשרה aliquot אחד של 100 X N-2 תוספת (150 µL) על קרח והוסף לבינונית תרבות aliquoted 15 mL, בתנאים סטריליים.
- העברת µL 750 תרבות בינוני (עם תוספת X N2 1) כל טוב של צלחת 6-ובכן תרבות.
- עם פינצטה מעוקל, מקום אחד הוספה התרבות התא (בקוטר 30 מ מ, גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.4, PTFE) בכל אחד בינוני מלא טוב.
- למלא את האמבטיה vibratome חנה המבר מחומצן ללא הרף. מגניב עד 4 ° C עם קרח המקיפים את האמבטיה, או להשתמש vibratome בקירור.
- הגדר את מהירות vibratome 0.150 מ"מ/s ואת התדירות ל- 80 הרץ.
- דבק הרחוב agarose על פלטפורמה vibratome, rostral הקצה פונה כלפי מטה, הגחוני / edge בפני המשתמש.
- לחתוך את המוח בסעיפים הילתית להשיג חלקים מיקרומטר בעובי 250 (ב 4 ° C).
- עם שפכטלים מעוקר, לאסוף את סעיפים 2-3 המכילות את MGE ואת המקום להוסיף כל המקטעים המוח מחיה לחיה על קרום 30-מ מ יחיד, תוך הימנעות חפיפה בין מקטעים. מקם את תותב טוב אחד של צלחת 6-ובכן תרבות (המכיל 750 µL של תרבות שהושלם בינוני, כפי שתואר לעיל). לחלופין, כל מקטע להנחה על קרום בקוטר 13 מ מ נפרד בצלחת 12-ובכן תרבות מלא 500 µl בתוספת תרבות בינוני. הכמות של תרבות בינוני מומלצת מכל קידוח מאפשר את הסעיפים המוח כדי להיות מוזנת ע י התקשורת מבלי להיות מתחת למים.
הערה: השלבים המתוארים 5.3.6, 5.3.7 אינן נעשות בתנאים סטריליים מלאה, אלא אם כן vibratome ניתן לעקר, בשימוש של אבטחה בארון. לכן, זה הכרחי לבצע שלבים אלה בקפידה כדי למנוע כל זיהום. ציוד מגן מתאים (נקי מסכה, כפפות כירורגי, חלוק המעבדה) צריך ללבוש בכל הזמנים ובכל חלקי הגוף, אפילו מכוסה, כגון שיער, פנים, ידיים, צריך לעולם לא תעבור על הצלחות תרבות (עם או בלי תרבות בינוני). כמו כן מומלץ לרסס 70% אתנול לעתים קרובות על כפפות ועל שפכטלים נהג לאסוף את החלקים של המוח. - מקם את הצלחת תרבות חממה סטרילי מאוורר ב 37 ° C עם 60% לחות ו-5% CO2 48 או 72 h.
הערה: אלו פעמים הדגירה אופטימציה להצגה הדמיה בצילום מואץ של In MGE, נגזר והדימות קונאפוקלית של פרוסות קבוע, בהתאמה. הדגירה אופטימלית פעמים צריך להיבדק מראש עבור כל עיצוב ניסיוני. בנוסף, אם הדגירה שבחרת הוא 72 h, תחת, יש צורך לשנות את המדיום תרבות. משכי זמן ארוכים יותר דגירה, המדיום תרבות יש לשנות כל 2-3 ימים. - לאחר זמן הדגירה הרצוי, להעביר את המקטעים של עניין coverslip תאיים 8 ולהוסיף 3-5 µL של תרבות בינוני. המקום coverslip בתא סביבתיים (37 מעלות צלזיוס, 60% לחות, 5% CO2) מחובר הפוך ספינינג דיסק וידאו מצוידים עם תוכנת המחשב בסיוע רכישה שיבנו ההפעלה הדמיה בצילום מואץ.
הערה: לחלופין, סעיפים ניתן לתקן עם 4% paraformaldehyde (בן לילה ב 4 ° C או 2 h בטמפרטורת החדר) ובעקבות כך immunostained עם נוגדנים שונים עבור ויזואליזציה של התכונות מורפולוגי של electroporated תוספות תחת קונפוקלי מיקרוסקופ. למרות eGFP ו- mCherry ניתן לאבחן על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ללא כל הליך נגד מוכתמים, אנו ממליצים על ביצוע אימונוהיסטוכימיה נגד ה-GFP, mCherry כדי לשפר את האות מאז תהליך פיקסציה. המצמצמים פלורסצנטיות, הפחתת זיהוי רכיבי עדינה יותר של נוירונים עובריים, כגון סניפים קטנים יותר בתהליכי מובילים או נגררים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בחלק זה, אנו מספקים תוצאות נציג שהושג בעקבות אלקטרופורציה את הרחם לשעבר של פלסמיד הבקרה, או על פלסמיד ניסיוני מיקוד גנים של עניין, MGE של e13.5 העכבר העוברים ואחריו organotypic פרוסה תרבויות הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות (עבור הדמיה בצילום מואץ) או 72 h (עבור קיבוע, תיוג immunohistochemical) (ראה איור 1B סכימתי פרוטוקול). דוגמאות מייצגות של תוספות מעבר מ- explant MGE הם גם מאוירים (ראה איור 1C עבור פרוטוקול סכמטי), לשם השוואה לפעולת השירות המתוארים כאן. אלקטרופורציה של פלסמיד בבית אבות MGE נראה לעכב את היציאה של In MGE, זמן תרבות שתישמר בהתאם.
בניסוי מוצלח, פרוסות organotypic מופיעים בריא תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, קרי קורטיקלית שכבות בקלות ניתן להבחנה באמצעות מצב שדה בהיר ויש ללא זיהום גלויה על פני השטח פרוסה (לזיהוי על-ידי אינטנסיבי autofluorescence ואת נוכחותם של פלורסנט חוטים גלויים תחת epifluorescence). פרוסות organotypic כרונית בריא, כ-20% של תאים עוברים אפופטוזיס לאחר 72 h בתרבות (איור 2), כפי שתואר קודם לכן ב- organotypic כרונית תרבויות (למשל כמחנכת תרבויות)52. למרות זאת, מבנה המוח cytoarchitectural מגעיל נשאר מוגדרת היטב, כמו מאויר כאן על ידי שימוש דאפי מכתים (איור 2 א). פרוטוקול שלנו עבור ex-vivo אלקטרופורציה של MGE התשואות ממוצע של 50-100 תאים transfected לכל פרוסה (איור 3 אב'), של אילו תאים 5-20 ניתן לראות מעבר dorsally לאחר 72 h בתרבות. לאחר קיבוע נוגדן, תוספות מעבר tangentially לעבר הצלחת קורטיקלית ניתן לזהות בקלות עם מיקרוסקופיה קונפוקלית כפי שהם מהווים גוף התא/אליפסה מוארכת, תהליך נגררים פה ושם, תהליך המוביל אוריינטציה tangentially. התהליך מוביל בדרך כלל מעניקה עלייה ענפים אחד או שניים, לזיהוי על-ידי נוכחות נפיחות ומדי פעם מול גרעין (דיור את centrosome לפני nucleokinesis) צמיחה קונוסים בקצה של כל סניף. (איור 3C-G).
פרוטוקול זה תוכנן עבור התצפית של העברת נגזר MGE In ברמת תא בודד באמצעות הדמיה בצילום מואץ. עבור ניסוי מסוים (איור 4) פרוסות המוח organotypic הילתית נוצרו מן Dlx5/6Cre; רבניEGFP electroporated עוברי-e13.5 עם פלסמיד ביטוי של shRNA ניסיוני (פילוח הגן עניין), את הקלטת TdTomato . הפרוסות היו הדגירה במשך 48 שעות, הועבר צלחת 8-ובכן תאיים coverslip (1 פרוסה לכל תא צף על שכבה דקה של בינוני תרבות שהושלם), עם תמונה כל 3 דקות עבור 6-8 h באמצעות מטרה אוויר (0.70 NA) 20 x על מיקרוסקופ הפוכה מצויד עם ראש קונאפוקלית של הדיסק מסתובב, תוכנת המחשב בסיוע רכישת תא סביבתיים הבמה-העליון. במהלך דימות, הפרוסות הוחזקו ב 37 מעלות צלזיוס, היו ללא הרף חמצן, humidified בבית הבליעה סביבתיים (5% CO2 ו- 60% H2O). תוספות Electroporated MGE, נגזר אותרו ככזה על ידי הבעת רגשותיהם eGFP, המאשר את זהותם GABAergic IN, ואת הבעת רגשותיהם TdTomato, המאשר כי הם מביעים את פלסמיד ניסיוני (איור 4Aב'). Electroporated הארצי הן קלות לזיהוי ומבודדים היטב, כפי שניתן לראות באיור 4, המאפשר ניתוח עדינה יותר של העברת פרמטרים דינמיים, כגון מהירות, מרחק נסע. בנוסף, שכותרתו תוספות נראים נודדים tangentially לעבר הצלחת בקליפת המוח, בעוד בסביבתם הטבעית, המאפשרת לנו לזהות שינויים מורפולוגיים דינמי כגון הסתעפות של התהליך המוביל ו- nucleokinesis (איור 4C -F).
אלקטרופורציה ex-vivo In נגזר MGE של יכול גם להיות משולב עם MGE explants כדי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תהליכים דינאמיים cytoskeletal המתרחשים במהלך ההעברה, כהשלמה ללימוד כיוון ואת הדינמיקה נודדות בתרבויות organotypic. לדוגמה, ניתן לעקוב אחר השלבים השונים של המזכירים את אלה המתרחשים במהלך ההעברה וקולו של In בתרבויות פרוסה organotypic עצביים ומכניקה ב electroporated תוספות מעבר מ- MGE explant 48 שעות לאחר אלקטרופורציה, כגון מובילים nucleokinesis (דמות 5B-E) והסיומת neurite. לאחר מכן ניתן יהיה ללמוד תהליכים cytoskeletal שונים ברזולוציה גבוהה בתאים מבודדים מעבר מ- explant MGE, למשל על ידי צביעת F-אקטין מבנים עם phalloidin (איור 6A), אשר אינה יכולה להיות מושגת בצורה אופטימלית לפרוסות organotypic בהתחשב הסלולר צפיפות גבוהה (ומכאן של אלמנטים cytoskeletal) בסביבה הטבעית. תהליכים אלה cytoskeletal, בפרט F-אקטין שיפוץ, יכול עוד להיות למד באופן דינאמי על-ידי שילוב הביטוי Lifeact עם הדמיה בצילום מואץ. למשל, נוכל להראות דוגמה של הדמיה ברזולוציה גבוהה בצילום מואץ של IN נגזר של explant MGE המתקבל Nkx2.1Cre; רבניEGFP מוח העכבר נושא מחיקה יישוב של גנים עניין ב- INs. IN זה היה transfected עם פלסמיד mCherry-Lifeact-7 תחת השליטה של האמרגן CMV (מתנה מיכאל דוידסון), שימוש בשיטת schematized ב איור 1C, ומאפשר לעלייתו של F-אקטין שיפוץ המתרחשים בזמן אמת (איור 6B). לכן, בעוד organotypic תרבויות נדרשים להעריך נכונה את נתיב כיוון או העברה של In מהונדסים, MGE explants יוכלו להשלים מחקרים כאלה על-ידי מתן גישה טובה יותר עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים cytoskeletal תהליכים דינאמיים.
החסרונות הטכניים עלולה לגרום לכשל של הניסויים שתוארו לעיל. למשל, הטבעה המוח בפתרון agarose חם יותר מאשר 42 ° C יכול לגרום הרס רקמות ומוות עצביים, נחשף על ידי איבוד המוגבהת במוח או פרוסות, אשר יהפוך אטום. עם זאת, הטמפרטורה לא צריך להישמר נמוך מדי, כמו פתרון agarose solidifying יכול להרוס את המוח העוברי שביר במהלך תהליך ההטבעה. שנית, זיהום יכול להפחית באופן משמעותי את התשואה של הגישות ניסיוני המתוארים כאן. לפיכך, כל הצעדים צריך להתבצע בזהירות, בתנאים סטריליים מחמירים ככל ריאלי. כל פתרונות וציוד צריכים לעקר לפני השימוש, ציוד צריך ריסוס לעתים קרובות עם אתנול 70% כדי למנוע זיהום חיידקים או עובש. זיהום יכול להיות גלוי ישירות הבארות תרבות, המדיום תרבות הופך צהוב או אטום. זיהום יכול ללכת מעיניהם כאשר המדיום תרבות נשאר נוזל וברורה. עם זאת, בדרך כלל יכול להיות שנצפו שכבת עובש על פני פרוסה או הפרוסות להיות שביר בצורה מוגזמת במהלך הקיבעון ואת השלבים מכתימים. כאשר פרוסות כאלה הם דמיינו מתחת למיקרוסקופ, זיהום יכול להתבטא כמו שכבה של autofluorescence על נוירונים שכותרתו או להתגלות על ידי הנוכחות של חוטים זמן פלורסנט. פרוסות Organotypic שמרו על בארות מזוהמים צריך לפסול, אך הפרוסות תרבותי ב בארות אחרים באותה הצלחת יכול להישמר על עוד צעדים. זיהום חיידקי הוא די נדיר, אבל צריך לקחת ברצינות, כלומר כל הציוד, כולל חממות משותף, חדר תרבות צריך להיות באופן ידני נקי מחוטא.
איור 1: ייצוגים סכמטי של הפרוטוקולים עבור אלקטרופורציה לשעבר עם רחם ולאחריו התרבות פרוסה organotypic או MGE explants. א דוגמה של התקנה בארון אבטחה בכלים סטיריליים כל הדרוש עבור פרוטוקול המתוארים כאן. B. ייצוג סכמטי של פרוטוקול המשמש את התרבויות פרוסה עם רחם לשעבר אלקטרופורציה ו- organotypic. בקצרה, העוברים הם ערף, פלסמיד ניסיוני מוזרק לרוחב החדר (1) ו- electroporated ב MGE (2). המוח microdissected מתוך הגולגולת (3), המוטבעות agarose (4). Organotypic מקטעים שנוצר ב- vibratome (5) והניח בתרבות °C(6) 37 במשך 48 שעות עבור זמן לשגות מיקרוסקופ (7.1) או 72 h עבור תא שחזורים (7.2). ג. ייצוג סכמטי של פרוטוקול הותאם מאיירס. ואח 201353 ומשמש לדור של MGE explants. בקצרה, cortices דורסולטרלי קודם גזור החוצה מ e12.5 כדי e14.5 פראי-סוג העכבר עוברי (1) הינם חלופה מועדפת מכנית תרבות שהושלם בינוני (2). תאים קורטיקליים מצופה ב צפיפות של 5.25 x5 10 תאים קורטיקליים/cm2 , תרבותי עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס קולגן/פוליפוני-L-ליזין-מצופה תאיים 8 coverslip (3). לאחר מכן, e13.5 Dlx5/6Cre; רבניEGFP עוברי מעובדים עבור ex עם רחם אלקטרופורציה של MGE (4, 5), MGE זה באופן ידני מבודד מן המוח ותזמין אותה 100 מיקרומטר2 קטעים (6). לאחר מכן, explants האלה הם הממוקמת מעל השכבה בעבר מוכן מזין קורטיקלית, מקורה עם תרבות בינוני, תרבותי משותף במשך 48 שעות לפני זמן לשגות הדמיה (7). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נשמר cytoarchitecture לפרוסות בריא organotypic. הדור של organotypic לחתוך תרבויות לאחר אלקטרופורציה ex-vivo של Nkx2.1Cre; רבניEGFP עכבר עוברי (א) לא תגרום נזק לרקמות משמעותי, כפי cytoarchitecture משומר (דאפי (כחול) ו- Cre-כתב (GFP)), בהשוואה למצבם cryosection מיקרומטר בעובי 18 מ Nkx2.1Cre; רבניEGFP transcardially העובר perfused עם 4% מחברים ב- e15.5. D ו- M מציינים dorso-הגחוני / latero-המדיאלי וציר, בהתאמה. (B). בהגדלה תמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה מצויד עם 63 x / 1.4 מטרת שמן לאחר צביעת עם נוגדן anti-ביקע-קספאז 3 (Cl-cas3) לגלות כי כ-20% של התאים בצלחת בקליפת המוח עוברים אפופטוזיס (חץ לבן) לאחר h 72 בתרבות, בזמן השהייה ב GFP-חיוביות תוספות בריא (חץ לבן), למשל, ב- photomicrographs ב C-C ' '. לשם השוואה, אפופטוזיס הסלולר הוא כמעט לחלוטין נעדרו cryosection דק מחיה perfused (D-D ' '). גודל ברים: 250 מיקרומטר (A-B) ו- 15 מיקרומטר (C-D ' '). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Organotypic פרוסות של עכברים מוח עוברי, בהגדלה photomicrographs של electroporated interneurons (INs). א תרבות פרוסה organotypic מ Dlx5/6Cre; רבניEGFP מוח העכבר (שבו כל In הם ירוק) electroporated עם Dlx5/6::shRNAמקושקשות-IRES-TdTomato פלסמיד. הפרוסה היה קבוע עם 4% PFA לאחר 72 h ב תרבות ו immunostained עבור ה-GFP ו- mCherry. Electroporated הארצי היו עם תמונה תלת-ממד (50-60 מיקרומטר בעובי z-ערימות עם מקטעים אופטי נלקח כל 0.5 מיקרומטר) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם 63 x / 1.3 נה שמן אובייקטיבי. תוספות מעבר tangentially חדרית תת איזור פליום הגבי הן לזיהוי (אדום, פתוח חץ). D ו- M מציינים dorso-הגחוני / latero-המדיאלי וציר, בהתאמה. B. תרבות organotypic נציג פרוסה של electoporated העובר wildtype (WT) עם פקד Dlx5/6::shRNAמקושקשות-IRES-TdTomato פלסמיד, קבוע ב 72 h ו- immunostained עבור mCherry בלבד. Electroporated הארצי (אדום) נראים נודדים dorsally לעבר הצלחת קורטיקלית. Electroporated הארצי מזוהים על ידי שלהם ביטוי משותף של TdTomato ו EGFP Dlx5/6Cre; רבניEGFP עכברים (C-D), או על ידי הבעת רגשותיהם TdTomato רק בעכברים WT (E-H), ועל -ידי מורפולוגיה אופיינית שלהם, קרי אליפסה תא הגוף, תהליך המוביל קנים (לבן ראשי חץ, D-H), ומדי פעם נגררים תהליך (חץ לבן, C-D) ונפיחות ומדי פעם של התהליך המוביל הדיור את centrosome לפני nucleokinesis (כוכב לבן ב- C-C' ו- G). גודל ברים: 250 מיקרומטר (A-B) ו- 25 מיקרומטר (C-H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: זמן לשגות לחיות-הדמיה של electroporated תוספות בפרוסות organotypic תרבותי עבור ה 48 תוספות electroporated ב e13.5 עם פלסמיד ניסיוני המבטאת את הקלטת TdTomato ו shRNA מיקוד הגן עניין נראים בהעברה העוסקות ב פרוסה המוח organotypic המתקבל Dlx5/6Cre; רבניEGFP עכבר עובר לאחר 48 שעות של תרבות (ריבועA, לבן). ב- B, electroporated אותו (ריבוע לבן) נתפסת בתהליך של nucleokinesis, בעת העברת tangentially בקליפת, קרי מקביל פני השטח pial, ו היא בעקבותיו כל 3 דקות עבור 8 שעות באמצעות 20 x / 0.85 הדמיה בצילום מואץ נה אוויר המטרה (תיבות מוגדלת, C-F). הנוירון מציג בתחילה גוף התא מוארך (חץ פתוח) בתהליך nucleokinesis (C), כמו גם תהליך נגררים (חץ לבן), תהליך המוביל קנים (חץ לבן). לאחר 3 שעות של הדמיה לחיות, nucleokinesis השלמת תהליך נגרר יש מההצעה, תהליך המוביל היא הרחבת שני ענפים ארוכים (ד, ראשי חץ לבן). לאחר 5 שעות 30 דקות, אחד של הענף תהליך המוביל יש מההצעה (חץ לבן), בגוף התא נוירון (חץ פתוח) עברה קדימה כ- 10 מיקרומטר (E). בסופו של דבר, אחרי 8 שעות של ההדמיה, ההעברה הושהה, הנוירון האריך את התהליך המוביל שלה שוב, תהליך נגרר הופיע (חץ לבן), אבל הגרעין (חץ פתוח) לא עברה עדיין קדימה (F). גודל ברים: 250 מיקרומטר (א), מיקרומטר 70 (ב) ו- 30 מיקרומטר (C-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: הדמיה בצילום מואץ של תוספות שמקורם בתרבית עבור ה 48 MGE explant תוספות נראים נודדים מפה explant MGE המתקבל Nkx2.1Cre; רבניEGFP עכבר (ב eGFP אקספרס אילו תוספות כל הנגזרות MGE) electroporated עם פלסמיד CMV::mCherry-LifeAct-7 -e13.5, באמצעות השיטה הותאם מאיירס. ואח 201353 ו schematized ב איור 1C, בתרבית במשך 48 שעות (A). תוספות היו visualized באמצעות הדמיה לחיות זמן לשגות במשך 5 שעות (B-E). בדוגמה זו, אחת משותפת לבטא eGFP ו- LifeAct נתפסת בתחילה בתהליך nucleokinesis (פתוח חץ) ומרחיב שני סניפים תהליך המוביל (חץ לבן; B). ב זה משלים nucleokinesis לאחר 1 h (ראו חץ פתוח), כמו בגוף התא עברה קדימה תהליך נגרר הופיע בחלקו האחורי של גוף התא (חץ לבן) ולאחר עדיין מציג תהליך מוביל אחד עם שני סניפים (חץ לבן; C). nucleokinesis השני הוא לדרך אחרי 2 שעות 30 m בתוך (חיצים פתוח), IN ניחן כעת שני תהליכים המובילים שמקורם לגוף התא, תהליך כבר נגרר (חץ לבן; D). סוף סוף, לאחר 5 שעות, IN המופרע neurite אחד תוך כדי translocating את centrosome בענף הנותרים מוביל תהליך (חץ לבן) כהכנה nucleokinesis השלישי, עם נגרר תהליך (חץ לבן) עדיין נוכחים בחלק האחורי של לגוף התא (E). גודל ברים: 70 מיקרומטר (A) ו- 20 מיקרומטר (B-E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: תרבותי זמן לשגות הדמיה של אקטין שיפוץ ב תוספות מ explant MGE ברזולוציה גבוהה עבור 48 ה א פרוסה organotypic מ Nkx2.1Cre; רבניEGFP מוח העכבר הוא קבוע ב- e15.5, צבעונית עם אלקסה-594 Phalloidin, המאפשר החזיית אקטין filamentous. תוספות הן עם תמונה באמצעות סימן x 63 / 1.3 נה שמן המטרה של מיקרוסקופ קונפוקלי. ב- In בריא, אקטין filamentous נתפסת cupping האחורי של גוף התא בעקבות התנצלות של תהליך נגרר לאחר סיום nucleokinesis (חץ לבן, א '-A ' '). B. MGE explant המתקבל לעיל Nkx2.1Cre; רבניEGFP מוח העכבר נושא מחיקה יישוב של גנים של עניין electroporated עם פלסמיד לבטא mCherry-Lifeact-7 תחת השליטה של האמרגן CMV . הדמיה חיה זמן לשגות מתבצע לאחר 48 שעות של התרבות, electroporated תוספות עוקבים כל 3 דקות במשך 3 שעות באמצעות 40 x / 0.85 אוויר המטרה. שיפוץ פעיל של שלד התא אקטין מתרחשת ב- IN transfected עם LifeAct, כפי שהיא מוסברת על ידי התנועה של אדום (לבן של תמונות בשחור-לבן) פלורסנט נקודות בתוך מוביל התהליך ואת הצמיחה הקונוסים (חץ לבן), בחלק האחורי של תאי הגוף במהלך nucleokinesis (B-B ' ', לבן חצים). גודל ברים: 7 מיקרומטר (A-A ' ') ו- 10 מיקרומטר (B-B ' '). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, אנו מספקים שיטה אמינה עבור ביצוע לשעבר עם רחם אלקטרופורציה של העכבר MGE-e13.5, הדור של תרבויות organotypic של פרוסות המוח העוברי. למרות שיטות במבחנה , כמו וזמינותו קאמרית בוידן, שקל יחסית לבצע והוא יכול לשמש כדי להעריך תפקידים ספציפיים של גנים שונים, חלבונים ללא ההפרעה של גורמים אחרים, הם למנוע החקירה של דינמיקה ההעברה ביחס נתיב כיוון והעברה25. MGE explants לספק אמצעי שימושי כדי ללמוד את השינויים cytoskeletal הדינמיים המתרחשים במהלך ההעברה, כפי שנראה כאן, אבל הם ללא רמזים אנדוגני ביותר ולעיתים קרובות דורשים התוספת של הדרכה רמזים כדי לקדם הגירה העצבית (למרות שזה לשפר באופן משמעותי כאשר MGE explants מתורבתים בשכבות מזין קורטיקליים)25,54. בכל זאת, מבחני בהתבסס על MGE explants עלול להיכשל לזהות במשמעויות של מעורב מנגנונים עדינים יותר כמו אלה המנחה נתיב כיוון או העברה של תוספות29מולקולרית רמזים. בעיה זו היה מצויין בסופו של דבר בתוך הרחם אלקטרופורציה25, מה שמאפשר עבור תיוג ספציפית של MGE, נגזר In העברת שלהם לסביבתם הטבעית13,29,41. עם זאת, בטכניקה זו היא מיומנות-מאתגר, עקב הניתוחים מעורב, התשואה שלה מוגבל על ידי שיעור הישרדות נמוכה של העוברים ואת העובדה כי MGE קשה המטרה בתוך הרחם, לעתים קרובות הדורשות שימוש המלטות מרובות כדי להגיע משמעות55. לפיכך, לשעבר עם רחם אלקטרופורציה של MGE ואחריו organotypic תרבות של עכברים מוח עוברי מספק שיטה בעלות נמוכה, היעילה ואמין עבור חוקרים את הדינמיקה ההעברה, המורפולוגיה של תוספות נגזר MGE הטבעי איכות הסביבה, תוך עקיפת הניתוחים בתוך הרחם אלקטרופורציה והצורך הדרכה רמזים ב- MGE explants. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת גישה קלה יותר MGE, אשר ניתן לפלח מאת ישירות apposing את האלקטרודה החיובית תחת בצוואר ואחד שלילי על הראש, תצורה קשה יותר לאמץ בתוך הרחם. לחלופין, יכול להיות מוזרק focally MGE ואת electroporated ישירות לאחר יצירת organotypic פרוסות13,25,29, אך הטכניקה הזאת הוכיחה קשה יותר ויעיל פחות בידיים שלנו מאשר הפרוטוקול המתואר כאן. על-ידי ביצוע השלבים המתוארים במאמר זה, אחד יהיה להשיג 50-100 electroporated MGE, נגזר תוספות לחתיכה organotypic, 5-20 אשר ניתן לראות מעבר tangentially החוצה MGE לאחר 72 ה' Transfected הארצי להיות visualized חי עם הדמיה בצילום מואץ או הדמיה, שוחזר לאחר קיבוע, תיוג immunohistochemical.
הפרוטוקול המתואר כאן היה מותאם ללמוד ההעברה ex-vivo , בהשראת תקנות שפורסמו שונות המתארות אלקטרופורציה בתוך הרחם של תוספות נגזר MGE, שמחוץ MGE הזרקת אלקטרופורציה, או דור של organotypic כרונית במוח פרוסה תרבויות36,38,39,42,43,56,57,58. הגישה שלנו מגביל אפשרות של נזק MGE אבות באמצעות עוצמת הדופק נמוך יותר (40 V) ועל זריקות פלסמיד ע ולא אינטרה MGE זריקות עם פולסים מתח גבוה (100 וולט), כמתואר39,56 57, ,58. יתר על כן, בעוד אחרים להשתמש בשילוב של פניצילין, סטרפטומיצין gentamycin כדי למנוע זיהום חיידקי39,56,57,58, אנחנו שבחרו להימנע אנטיביוטיקה ב תרבות המדיום שלנו, מאחר שהם יכולים להשפיע באופן תיאורטי בהעברה. בפרט, פניצילין הוא אנטגוניסט של59,קולטן GABAA 60, וכן הפעלת קולטן GABAA מפעילה ומפסיקה מאוחר יותר בהעברה בהתאם כלוריד תאיים מעברי צבע KCC2 ביטוי בשלבים שונים של הגירה61. עם זאת, שימוש באמצעי הזהירות שונים כאמור בפרוטוקול הנוכחי, זיהום יכול ביעילות להימנע גם בהיעדר של אנטיביוטיקה.
למרות היעילות של גישה זו בידיים שלנו, לשעבר עם רחם אלקטרופורציה יש גם החסרונות. בזמן מתן סביבה תלת-ממדי טבעי עבור תאים כדי להעביר, זה יכול להיות קשה לבצע מבחני תרופתי בפרוסות organotypic בהקשר של העברה. אכן, ההעברה של In MGE, נגזר בעיקר תלוי רמזים חוץ-תאית2,13,19 והיישום של מעכבי תרופתי או מפעילים על פרוסות organotypic אינו מאפשר את מדויק דיסוציאציה של תופעות אוטונומיות תא מתופעות גלובלית על הבריאות הכללית פרוסה או פעילות. לניסויים כאלה, explants MGE גדל על תאים קורטיקליים הפומבית מעורבת, עדיף לתרבויות פרוסה organotypic, מאז נודדות החוצה explant יכול להיות בקלות רבה יותר מבודדים והתבניות חשופים באופן סלקטיבי תרכובות ייעודיות62. יתר על כן, למרות לשעבר עם רחם אלקטרופורציה היא קלה יותר לביצוע מאשר אלקטרופורציה בתוך הרחם , הוא עדיין יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית בכל הדורות עובריים מאויר כאן בהתחשב השברירי מתחלקים מוח- וגודל קטן e13.5. החוקרים יהיה עליך מספר נסיונות ביעילות לחלץ את המוח electroporated-e13.5 מבלי להזיק את פני השטח של המוח. בנוסף, בניגוד פרוסות כמחנכת, פרוסות organotypic עובריים לא יכולים להישמר בתרבות במשך פרקי זמן ארוכים. למרות organotypic עובריים פרוסה תרבויות יכול להישמר לפחות 7 ימים במבחנה63, זה לא היה בשילוב עם אלקטרופורציה ויש הניסויים המתוארים כאן בדקו עד 3 ימים במבחנה עם תוצאות אמינות בידיים שלנו. לכן, החוקרים צריך לבצע בדיקות אופטימיזציה מראש אם פעמים דגירה ארוך יותר יש צורך. עוד, החקירה של פיתוח מאוחר שלבי כמחנכת עובריים או מוקדם לא מומלץ עם טכניקה זו בעת שימוש e13.5 עוברי25, אבל ניתן להשיג עם אלקטרופורציה בתוך הרחם , איפה בהצלחה electroporated עוברי מוכנסים חזרה לתוך חלל הרחם, ניתן יהיה להשאיר כדי להיות נולד וניתח -שלבים מאוחר יותר21,64. לבסוף, לשעבר עם רחם אלקטרופורציה ואחריו organotypic פרוסה תרבויות מאפשר הניתוח של שני המורפולוגיה הדינמיקות ההעברה של תוספות המתפתח. אולם, כפי זה היה בעבר ציין בתוך הרחם אלקטרופורציה הטכניקה36, electroporations לשעבר עם רחם תשואות 50-100 electoporated תאי המוח פרוסה, ולכן אינם מתאימים לניתוח האוכלוסייה. בחקירות אלה מתנהלים יותר במודלים של בעלי חיים נושא מלא או מותנה מחיקה (או טוק-in) של הגן עניין. כשהם זמינים, מודלים כאלה ואז ניתן להשתמש ביעילות כדי ליצור תרבויות פרוסה organotypic או MGE explants כדי להמחיש את הדינמיקה בפועל בהעברה, כפי שמתואר כאן (ראה איור 5 , איור 6).
שלבים רבים של פרוטוקול זה צריך להתבצע בזהירות כדי להשיג תוצאות אופטימליות. למשל, זה הקדמונים בכל הצעדים מבוצעים בתנאים סטריליים מחמירים כמו זיהום יכול להתרחש בקלות. כפפות, מכשירים נעשה בו שימוש מחוץ אבטחה הקבינט צריך ריסוס עם 70% אתנול לעתים קרובות במהלך ההליך כולו. בנוסף, פתרונות כמו נוזל מוחי שדרתי מלאכותי ומדיה תרבות צריך להישמר סטרילי קר (4 ° C) ו תוצרת טרייה כל 2-3 שבועות. להוספת תווית הארצי MGE, נגזר באופן ספציפי יותר, פלסמידים שישמש בניסויים כאלה צריך להיות משובטת תחת השליטה של יזם ספציפי IN (לשעבר: Dlx5/649, Lhx665), במקום פשוט להסתמך על אנטומי הפגיעה המכוונת MGE. הדור של פרוסות organotypic דורש את המוח כדי להישאר בחיים. לפיכך, כדי לשמר בריאות והישרדות, הניסוי הזה וצריך להתנהל בתוך פחות מ- 3 שעות מרגע העוברים מאוחזרות עד שמים את פרוסות organotypic תרבות. במשך הזמן-יעילות, תרבות צלחות יכול להיות מראש מלא תוצרת בית תרבות בינוני רק לפני תחילת הניסוי ולשים בחממה תרבות תא 37 ° C עד השימוש. יתר על כן, המוח צריך בזהירות ניסויים מתוך הגולגולת ללא נזק למשטח בקליפת המוח על מנת להשיג הטמעה נכונה פתרון agarose, vibratome-חלוקתה עוקבות. למשל, ופגיעה קורטיקלית, אפילו מינימלית, עלולה לגרום להתנתקות הסעיפים מיקרומטר בעובי 250 מ הג'ל agarose שמסביב או השפלה של הסעיפים במהלך vibratome חלוקתה. להישרדות עצביים, חשוב גם כי הטמפרטורה הפתרון agarose נשאר קרוב 42 ° C, כמו טמפרטורות גבוהות יותר להוביל למוות רקמת נזק ותא, ואילו טמפרטורות נמוכות יימנע את ההטמעה תקין של המוח (או נזק זה במהלך הטמעת תהליך). פעם בתרבות, להימנע מקורות זיהום אחרים, הפרוסות כדאי לא להיות מניפולציות עד שהם מועברים המיקרוסקופ עבור הדמיה. שלבים אלה צריך להתבצע בסביבה מעוקר, בהתחשבות לא כדי לזהם את הצלחות לאחר מטיפולים אלה, במיוחד אם הם חייבים להחזירה בתרבות הדמיה מחדש לאחר מכן. לבסוף, אנו לא ממליצים מחלים aliquot DNA מעורבב עם טעינת צבען של ניסויים קודמים לשימוש עתידי כמו ראינו ירידה ניכרת בתפוקה של נוירונים electroporated עם חומר כזה.
לסיכום, לשעבר עם רחם אלקטרופורציה ו organotypic פרוסה תרבות הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר תיוג ספציפית של MGE, נגזר In ברמת תא בודד והוא יכול לשמש לתמרן גנטית ספציפית מסלולים מולקולריים כדי המחקר שלהם תפקיד בוויסות שינויים מורפולוגיים של ההעברה הדינמיקה של תוספות tangentially נודדים. שיטה זו מאפשרת לחקירה מהירה, בעלות נמוכה מוקדם תפקודית של המועמד הרומן גנים זיהו דרך רצף RNA לתא בודד של תוספות נודדות66,67 או רצף הדור הבא של חולים עם התפתחותיות והפרעות68,69,70. טכניקה זו שימש בהרחבה ללמוד נדידת אוכלוסיות תאים אחרים, כולל תאים כפירמידה ואת קליפת ההיפוקמפוס70,71,72,73. לאחר mastered, זה יכול באופן פוטנציאלי לשמש תמונה מיחזור וסחר של קרום חלבונים, כגון קולטנים וערוצי באמצעות מתויג GFP חלבונים; הפעלת באיתות מסוים מפלי באמצעות ביולוגיים74; . או אפילו את הפיקוח ואת מניפולציה של פעילות תאית באמצעות הדמיית סידן מצמידים optogenetics קורטיקלית הארצי, אלא גם באזורים אחרים במוח, כגון ההיפוקמפוס, האמיגדלה או אפילו את סטריאטום
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף. הדיעות בזאת ואינן מייצגות בהכרח את נופי שר הבריאות או בית הממשלה של קנדה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הפעלה מענקי הקרן סבוי, קרן אפילפסיה התרופה, באמצעות ציוד מענקים מקרן הקנדית לחדשנות כשלקחו (מיקרוסקופ קונפוקלי), G.H (ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי). בחדר המיון מקבל פרס על הקריירה של Fonds דה קוויבק du רשרש-Santé (FRQ-S; פרס Clinician-scientist) כמו גם כמו מן המוסדות הקנדי למחקר בריאות (CIHR; פרס החוקר הצעיר). ג. ה הוא חוקר בכיר FRQ-S. עם זיגוג היא זוכת הפרס הכשרה פוסט-דוקטורט Steriade-סבוי מטעם קרן סבוי, בפרס הכשרה פוסט-דוקטורט צ'ו Sainte-ז'וסטין קרן ופרס הכשרה פוסט-דוקטורט FRQ-S, בשותפות עם קרן של כוכבים. פרויקט זה כבר מתאפשרת על ידי המוח קנדה באמצעות קרן מחקר המוח. קנדה, באמצעות סיוע כספי של הבריאות בקנדה, מוענק זה
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 serum-free supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 50X Serum-free neuron specific supplement |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11415064 | Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Horse serum, heat inactivated | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| Neurocell supplement N-2 100X | Wisent | 305-016 | Botteinstein's N-2 Formulation |
| VWR Square PETG Media Bottles 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| Class II Type A Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-540 | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.1 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.1 | |
| Sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| D+ glucose | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| Potassium Chloride | ThermoFisher Scientific | P217-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | BioShop | SPM400.500 | |
| Calcium chloride dihydrate | ThermoFisher Scientific | C79-500 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | BiosShop | MAG522 | |
| Agarose | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube | Drummond scientific | 1-000-800/12 | |
| Ethanol | VWR | E193 | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson & Co | 309646 | |
| Mineral Oil (heavy) | Rougier Pharma | ||
| WPI Swiss Tweezers #5 | World Precision Instruments | 504511 | 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these. |
| WPI Swiss Tweezers #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips |
| HTC Tweezers | World Precision Instruments | 504617 | 11 cm, Straight, flat |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these. |
| Dressing Forceps | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm, straight, serrated |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 504478 | 10.2 cm, full curve, serrated |
| DeBakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501996 | 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide |
| Fisherbran Microspatula with rounded ends | FisherScientific | 21-401-5 | You will need 2 of these. |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond scientific | 3-000-204 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm dish |
| Tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800 | 35-mm dish |
| Black Wax | FisherScientific | S17432 | |
| Transfer pipettes | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL, small bulb |
| Stereo Microscope | Leica Biosystems | Leica M80 | In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific) |
| Electro Square Porator | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & Co | 305127 | |
| Leica VT1000S Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM, Single edge razor blade | Electron Microscopy Sciences | 71952-10 | Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome |
| µ-Slide 8 well | Ibidi | 80827 | Pack of 15 |
| Millicell cell culture insert | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. |
| Leica DMi6000 microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Spinning disk confocal head Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 acquisition software | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell Stage top incubation system | Pathology devices | LC30030 | Provides Temperature, CO2 and humidity control. |
| SP8 confocal microscope | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Gift from Michael Davidson |
| Fast Green FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission |
References
- Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325 (2011).
- Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562 (Pt 1), 9-26 (2005).
- Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61 (2011).
- Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38 (1), 2019-2029 (2013).
- Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44 (2), 251-261 (2004).
- Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
- Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28 (1), 62-73 (2008).
- Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59 (5), 733-745 (2008).
- Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69 (4), 763-779 (2011).
- Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30 (20), 7072-7077 (2010).
- Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25 (24), 5691-5699 (2005).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H.
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30 (25), 8660-8670 (2010).
- Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. , (2017).
- Chu, J., Anderson, S. A.
- Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23 (4), 894-900 (2006).
- Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2 (2), e00031 (2010).
- Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63 (4), 466-481 (2009).
- Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120 (4), 503-535 (2010).
- McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165 (3), 775-784 (2004).
- Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109 (4), 400-404 (2005).
- Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7 (5), (2017).
- Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25 (15), 1221-1226 (2014).
- Zito, A., et al.
- Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25 (4), 991-1003 (2015).
- van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77 (1), 70-82 (2013).
- Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
- Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22 (3), 680-692 (2012).
- Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34 (14), 4941-4962 (2014).
- Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26 (10), 1131-1148 (2016).
- Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15 (3), S371-372 373-380 (2012).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
- Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97 (2), 287-292 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32 (2), 738-745 (2012).
- Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27 (14), 3875-3883 (2007).
- Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524 (2014).
- Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
- Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
- Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
- Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59 (5), 722-732 (2008).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20 (2), (2000).
- Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. , Plenum Press. (1985).
- Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30 (15), 5334-5345 (2010).
- Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118 (3), 516-526 (2013).
- Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865 (2016).
- Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92 (12), 1785-1791 (2014).
- Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34 (23), 7787-7801 (2014).
- Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28 (7), 1613-1624 (2008).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32 (49), 17690-17705 (2012).
- Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19 (1), 27-37 (1997).
- Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129 (1), 245-252 (2002).
- Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23 (4), 729-744 (2012).
- Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
- Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496 (1-3), 23-32 (2004).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62 (1), 53-71 (2009).
- Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15 (2), 229-237 (2016).
- Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
- Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7 (1), 4897 (2017).
- Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27 (12), 3078-3089 (2007).
- Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93 (5), e1035 1035-1048 (2017).
- Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656 (2017).
- Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23 (18), 4846-4858 (2014).
- Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501 (7466), 217-221 (2013).
- Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33 (21), 9122-9139 (2013).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
- Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
- Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).
