Summary
Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.
Abstract
Interneuronas GABAérgicas (INs) son componentes esenciales de las redes neuronales que cognición y comportamiento. INs destinada a rellenar la corteza migrar tangencialmente de su lugar de origen en el telencéfalo ventral (incluyendo de las eminencias ganglionares mediales y caudales (MGE, CGE)) a la placa cortical dorsal en respuesta a una variedad de intrínseco y extrínseco señales. Diferentes metodologías se han desarrollado en los años genético manipular vías específicas e investigar cómo regulan los cambios citoesqueléticos dinámicos necesarios para la correcta migración. En el útero de la electroporación se ha utilizado ampliamente para estudiar el efecto de la represión del gen o sobreexpresión en IN específico subtipos al evaluar el impacto en la morfología y posición final. Sin embargo, mientras que este enfoque se utiliza fácilmente modificar radialmente migración de las células piramidal, es técnicamente más difícil cuando dirigidos a electroporación pulg en el útero genera un bajo rendimiento dado las tasas de disminución de la supervivencia de los cachorros cuando la electroporación se lleva a cabo antes de e14.5, como es habitual al estudiar INs derivados de MGE. En un enfoque alternativo, MGE explantes proporcionan un fácil acceso al MGE y facilitan la proyección de imagen de INs modificados genéticamente. Sin embargo, en estos explantes, INs emigran en una matriz artificial, carente de orientación endógena claves y entradas talámicas. Esto nos incitó a optimizar un método donde el INs puede migrar en un ambiente más naturalista, al eludir los desafíos técnicos de los enfoques en el útero . En este papel, describimos la combinación de la electroporación ex útero de ratón embrionario cerebro seguido organotypic rebanada culturas fácilmente, imagen y reconstruir genéticamente modificados INs migrando a lo largo de sus senderos naturales en respuesta a señales endógenas. Este enfoque permite tanto la cuantificación de los aspectos dinámicos de migración con la proyección de imagen confocal Time-lapse, así como el análisis detallado de diversos parámetros morfológicos usando reconstrucciones neuronales tejido immunolabeled fijo.
Introduction
Interneuronas GABAérgicas corticales (INs) son diversos en cuanto a sus propiedades bioquímicas, propiedades fisiológicas y conectividad, y median diversas funciones en redes maduro1,2,3 ,4,5. La especificación de subtipos diferentes de INs cortical es estrictamente regulada a través de cascadas genéticas que han sido extensivamente estudiados1,2. La mayoría (70%) de los INs GABAérgicas corticales origina de progenitores en la eminencia ganglionar medial (MGE), una estructura embrionaria ubicada ventralmente y debe migrar a través de distancias relativamente largas para llegar a la placa cortical1, 2 , 6. mientras que las células piramidales corticales migran radialmente desde la zona ventricular (VZ) a la placa cortical a lo largo del andamio de la glia radial, la migración tangencial del INs, que no están vinculados a estos andamios, requiere una variedad de intrínseca y señales extrínsecas para atraer las neuronas migrantes hacia la placa cortical, al mismo tiempo guiándolos lejos de estructuras no corticales2,7,8. Después de salir del ciclo celular, INs son repelidos de la MGE por quimio-repulsivo señales expresadas en VZ de MGE, que desencadena la migración tangencial a la placa cortical9,10. Migración de INs evitar el estriado con la ayuda de diferentes señales repulsivas11 y, después de llegar a la placa cortical, cambia de una tangencial a una migración radial y llegar a su posición final laminar, en parte en respuesta a señales del piramidal las células de12 y otras poblaciones celulares13. La migración de los INs, en cuanto a otras poblaciones neuronales, implica varios cambios morfológicos dinámicos para permitir el movimiento real de la neurona. Este supuesto locomoción neuronal se caracteriza por ciclos repetitivos de tres pasos sucesivos: el alargamiento de un proceso principal, un movimiento activo anterograde del núcleo (nucleokinesis) y la retracción del proceso final14. EN migración está regulada por numerosas señales intrínsecas y extrínsecas que la ramificación y la remodelación activa del proceso principal para guiar el INs en la dirección correcta, determinar la orientación y la velocidad de migración14,15 ,16.
Los determinantes de regulación cortical en la migración se han estudiado ampliamente en los últimos años1,2,7,17,18,19,20 y alteración en algunos de estos agentes moleculares se ha postulado para dar lugar a trastornos del neurodesarrollo, como el pediátrico refractaria epilepsia o Autismo espectro trastornos1,2,21, 22 , 23 , 24. por lo tanto, el desarrollo de diversos enfoques in vitro e in vivo se ha seguido para impulsar significativamente nuestra capacidad para el estudio de este proceso dinámico, como previamente ha25. Los métodos in vitro , incluyendo el análisis de la cámara de Boyden y el análisis de la elección de raya, proporcionan el medio más rápido y más reproducible de evaluación del requisito e impacto célula Autónoma de proteínas o genes específicos durante la migración neuronal, sin la influencia de otros factores25. Estos ensayos son particularmente útiles cuando se combinan con imágenes en vivo8,26,27. Con estas técnicas, son fácilmente Obtenido de e13.5 MGE y aislado por la disociación enzimática y mecánica, después de que se pueden investigar diferentes vías de señalización y señales de orientación, como se ilustra anteriormente8,28 . Sin embargo, estos ensayos tienen lugar en una matriz extracelular artificial en la ausencia de la arquitectura tridimensional del tejido, que puede modificar propiedades de comportamiento y de la célula neuronales, afectando potencialmente a migración y supervivencia de la célula25. Para evitar estas limitaciones, los explantes MGE ex vivo se han desarrollado como una herramienta alternativa para cuantificar los dinámicos cambios morfológicos que ocurren durante la migración junto con parámetros como la velocidad y orientación14, 29. Generación de MGE explantes es relativamente sencilla y ha sido ampliamente descrito en otra parte30. Implica la chapa de un pequeño extracto de la MGE en una monocapa de células corticales mixtas o en una mezcla de matrigel y colágeno en presencia de señales atractivo o repulsivo25, siendo este último opcional31. MGE explantes permiten alta resolución imágenes de células escasamente marcadas, simplificar el estudio de los procesos intracelulares, como remodelación citoesqueleto durante proceso principales de ramificación, como se mostró anteriormente32,33 ,34 y en el presente estudio. Explantes MGE se han utilizado con éxito para evaluar cambios dinámicos del citoesqueleto durante la migración en un entorno 2D, por ejemplo después de manipulaciones farmacológicas o quimiotácticas específicas (véase, por ejemplo, Tielens et al 201633) . Sin embargo, con este enfoque, INs migran dentro de una matriz artificial, y esto podría alterar en comportamiento y la reproducibilidad y el significado de los resultados experimentales.
Por el contrario, en el útero la electroporación permite la manipulación genética de los INs en su ambiente nativo y es un método ampliamente usado para evaluar rápida y eficientemente el impacto de la ganancia y pérdida de función del gen mientras que eludir las limitaciones de golpe de gracia costosa y desperdiciadora de tiempo y knock-in estrategias25,35. Electroporación en el útero puede ser inclinada hacia en progenitores mediante el uso de promotores específicos de tipo celular y colocando los electrodos hacia las estructuras ventromedial, incluyendo el MGE36. Además, en el útero la electroporación permite la oportuna expresión de construcciones experimentales en 1-2 días, en comparación con el 7-10 días necesarios para la construcción de expresión utilizando viral vectores25. Sin embargo, en el útero la electroporación de en progenitores tiende a ser bajo rendimiento. De hecho, si bien progenitores de células piramidales en la zona ventricular dorsal pueden ser transfectadas eficientemente usando en el útero electroporación, dirigidas a las estructuras más ventral situadas, como el MGE, es más técnicamente difícil, especialmente en pequeños e13.5 embriones y la alta tasa de letalidad embrionaria más reduce el rendimiento experimental25.
Para eludir algunas de las limitaciones técnicas asociadas con in vitro MGE presentaron experimentos y electroporación en vivo en el útero , ex vivo organotypic rebanada culturas se han desarrollado8,37, 38,39. Cerebro organotypic rebanada culturas ofrecen la ventaja de la mímica en vivo de las condiciones, mientras que siendo menos costosos y desperdiciadores de tiempo de modelos de animales genera25. De hecho, estas preparaciones permiten un acceso fácil a la MGE, junto con la visualización específica del INs y pueden combinarse con electroporación focal para investigar vías moleculares específicas en INs migración en medio ambiente más fisiológico8 , 39 , 40 , 41. por lo tanto, hemos optimizado una aproximación por organotypic culturas38, que combinamos con electroporación ex utero y la proyección de imagen confocal Time-lapse, para evaluar el proceso morfológico y dinámico que ocurre durante la migración tangencial de MGE-INs. El presente Protocolo fue adaptado y optimizado de otros que han usado ex útero o en el útero cerebro electroporación organotypic rebanada culturas y estudiar la migración de las células piramidales42,43 y cortical INs36,39,44. Específicamente, embriones de ratón son decapitados y el MGE es electroporated ex vivo después de la inyección intraventricular de la plásmidos experimental, lo que permite más eficiente y precisa selección de progenitores MGE que lo que puede lograrse con electroporación en el útero . Luego se extraen los cerebros y seccionado en rebanadas coronales todo el cerebro que pueden ser cultivados por unos pocos días, lo que permite la continua seguimiento y proyección de imagen de transfected INs. Este enfoque etiquetas típicamente 5-20 INs migración tangencial por rebanada del cerebro, minimizando el número de iteraciones experimentales necesaria para alcanzar significación estadística, mientras etiquetado una población neuronal lo suficientemente escasa para asegurar la fácil separación de neuronas individuales para la reconstrucción y evaluación morfológica fina. Además, en comparación con explantes MGE, culturas organotypic aseguran que migrar INs están expuestos a un ambiente más natural, incluyendo entradas de aferentes talámicos y quimiocinas secretadas localmente. Este enfoque es apropiado para cuantificar la direccionalidad y la ruta migratoria adoptada por INs transfected, ofreciendo información anatómica suficiente para permitir la caracterización de procesos dinámicos más finos como principal proceso de ramificación, nucleokinesis y al final proceso de retracción.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) en el centro de investigación de CHU Sainte-Justine y fueron conducidos de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre guía de cuidado de animales el cuidado y uso de animales de experimentación (Ed. 2).
El protocolo descrito aquí fue optimizado para la electroporación de embriones en el día embrionario (e) 13.5, a la vez cuando INs derivados de MGE activamente generados, antes de la deriva máxima de CGE INs producción45,46. Además, para sesgar la electroporación hacia INs GABAérgico, utilizamos un promotor expresado selectivamente en el INs (por ejemplo, el promotor de Dlx5/6 con su potenciador mínimo)47.
1. preparación de soluciones para electroporación y culturas Organotypic rebanada
- Preparar 125 mL de medio de cultivo estéril.
- Medir 125 mL regular neurona-específica del medio de cultivo (véase Tabla de materiales para la formulación) en una botella esterilizada en un gabinete de bioseguridad UV-esterilizado previamente rociado con etanol al 70%. Añadir 2.25 mL de 50 x suplemento libre de suero enolase, 1,75 mL de glutamina 200mM (concentración final de 0,5 mM) y 6,25 mL de suero de caballo inactivado con calor previamente alícuotas bajo condiciones estériles. Mezclar bien, alícuota de 15 mL tubos cónicos estériles y almacenar a 4 ° C.
Nota: Medio de cultivo preparado puede almacenarse hasta por 3 semanas a 4 ° C. - Dividir 100 X solución de N-2 formulación48 de Botteinstein 150 alícuotas μl bajo condiciones estériles y congelar a-20 ° C hasta su uso.
- Medir 125 mL regular neurona-específica del medio de cultivo (véase Tabla de materiales para la formulación) en una botella esterilizada en un gabinete de bioseguridad UV-esterilizado previamente rociado con etanol al 70%. Añadir 2.25 mL de 50 x suplemento libre de suero enolase, 1,75 mL de glutamina 200mM (concentración final de 0,5 mM) y 6,25 mL de suero de caballo inactivado con calor previamente alícuotas bajo condiciones estériles. Mezclar bien, alícuota de 15 mL tubos cónicos estériles y almacenar a 4 ° C.
- Preparar 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial estéril (ACSF).
- Medir 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1 L. Añadir 25,67 g de sacarosa, 5,08 g de cloruro de sodio (NaCl), 2,18 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3), 1,80 g de glucosa, 0,19 g de cloruro de potasio (KCl), 0.15 g de fosfato monobásico de sodio anhidro (NaH2PO4), 1 mL de 1 M stock CaCl2 .2 h2O y 2 mL de 1 M stock MgSO4.7H2O. remover para disolver a temperatura ambiente. Añadir agua destilada hasta alcanzar un volumen total de 1 L.
- Usa un filtro de 0,22 μm, filtrar la solución en un frasco estéril en un gabinete de bioseguridad esterilizar y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
- Preparar una solución fresca de agarosa al 4% en ACSF antes de cada experimento.
- Medir 25 mL de la ACSF previamente preparado en un tubo cónico estéril de 50 mL y añadir 1 g de agarosa de punto de bajo punto de fusión.
- Calor de 45 s en un horno de microondas. Para evitar derrames, interrumpir la calefacción cada 3-4 s cuando la ebullición comienza, abrir el tubo para que la presión hacia fuera, vuelva a cerrar y agitar manualmente para mezclar la agarosa. Repita hasta que la solución de agarosa es homogénea. Mantener la solución de agarosa a 42 ° C durante el resto del experimento para evitar la solidificación.
Nota: Las temperaturas más elevadas dañará los tejidos del cerebro.
2. preparación de plásmidos para la inyección
- Tire una pipeta de microinyección de vidrio
- Establezca el tirador de la micropipeta con los parámetros apropiados, garantizar el capilar de vidrio en el espacio proporcionado y asegúrese de que esté centrado con el filamento.
- Presione el botón de extracción.
- Retire cuidadosamente las pipetas de microinyección recién hecha desde el extractor de calor y el lugar en un cuadro o caja de Petri limpia hasta su uso posterior para evitar dañar la punta.
- Configuración la seguridad de la biotecnología con todos los instrumentos necesarios para esto experimentar (ver figura 1A), rocíe generosamente todos los instrumentos en el gabinete de seguridad de la biotecnología con etanol al 70% y esterilizar los instrumentos y el medio ambiente con la luz UV durante 15-20 min.
- Durante la etapa de esterilización, descongelar plásmidos en hielo (4 ° C).
- Medir 10 μl del plásmido de una solución stock (4 μg/μl) en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir el 0.01% de verde rápido FCF. Mezclar suavemente, hacer girar brevemente y no en hielo hasta su uso.
Nota: Maxi-prep DNA debe estar preparado según protocolo del fabricante usando un kit libre de endotoxina maxi-prep. ADN puede ser solubilizado en buffer TE, o libre de nucleasa H2O y la preparación del plásmido con tinte solución puede, pero no no tiene que ser realizada bajo condiciones estériles. Plásmidos de Maxi-prep deben ser alícuotas para evitar múltiples ciclos de hielo-deshielo. Plásmidos alícuotas no se deben mezclar con el tinte más 2 h antes de su uso y no se deben congelar para su uso posterior. - Después de la esterilización, preparar el inyector de nano como sigue.
- Elija uno de la pipeta de microinyección de vidrio preparadas previamente almacenada en una caja limpia o placa de Petri y uso pinzas pequeñas para cortar la punta de la pipeta en forma biselada para alcanzar un diámetro exterior de aproximadamente 15 μm.
Nota: El diámetro externo dado aquí es una medida aproximada para dar al usuario una idea de lo que usamos en nuestros experimentos y se ha optimizado para facilitar la perforación del cráneo para la inyección de plásmidos sin dañar el cerebro, permitiendo al fluido carga y liberación de la DNA. El diámetro exterior puede medirse observando el corte punta de la pipeta de microinyección de vidrio apposed a una barra de escala micrométrica bajo un microscopio de campo brillante. - Utilice una jeringa para llenar la micropipeta con aceite mineral de su unpulled extremo (para expulsar todo el aire).
- Inserte la micropipeta de vidrio lleno en el nano-inyector siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Vacío 2/3rds de la micropipeta de vidrio (manteniendo suficiente aceite para evitar la entrada de aire).
- Elija uno de la pipeta de microinyección de vidrio preparadas previamente almacenada en una caja limpia o placa de Petri y uso pinzas pequeñas para cortar la punta de la pipeta en forma biselada para alcanzar un diámetro exterior de aproximadamente 15 μm.
- Cuidadosamente insertar la micropipeta dispuesta en el tubo que contiene la solución de plásmido/tinte y llene la micropipeta de vidrio con la solución de plásmido/tinte.
3. recolección de embriones de ratón de hembras preñadas
- Supervisar diariamente las hembras de cría a evaluar para el taponamiento vaginal, preferiblemente al mismo tiempo todos los días (mediodía). Día e0.5 corresponde al primer día, cuando se observa un tapón vaginal.
Nota: Los experimentos descritos aquí se pueden realizar en ratones de tipo salvaje. Sin embargo, para facilitar la identificación de la MGE y etiquetar todos INs GABAérgico (o subconjuntos específicos como INs MGE-derivado), animales transgénicos se pueden utilizar (por ejemplo: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre con un alelo de Cre-reportero, etc.47,49). En esta situación, el plásmido experimental inyectado debe expresar otro fluoróforo (por ejemplo mCherry o TdTomato) para permitir la visualización de los INs transfected (amarillo) que puede ser comparado con no transfectadas in (verde). - La mujer en el día embrionario e13.5, de sacrificio por dislocación del cuello.
Nota: Los agentes anestésicos en el momento del sacrificio pueden afectar en la migración y la supervivencia50,51 y deben evitarse. - Recoger embriones por cesárea como sigue.
- Rocíe generosamente el abdomen femenino con etanol al 70%. Levante la piel del abdomen con un par de pinzas esterilizadas y con la otra mano, utilice tijeras quirúrgicas esterilizadas para cortar la piel del abdomen.
- Con un segundo par de pinzas esterilizadas y tijeras, tire de la fascia abdominal y cortarlo evitando cuidadosamente el útero.
- Con un tercer par de pinzas esterilizadas y tijeras, tire de los cuernos uterinos y cortar fuera de la cavidad pélvica. Colocar los cuernos uterinos disecados en un plato de petri 60 mm estéril llenado de nervios basado en el medio de cultivo suplementado con aminoácidos, vitaminas y sales inorgánicas (véase Tabla de materiales para productos comercialmente disponibles).
- En un gabinete de bioseguridad estéril, usar dos pares de Pinzas finas (una en cada mano) para diseccionar los embriones de la placenta y aislar las cabezas por decapitación.
- Corte de bisel la punta de una pipeta de transferencia plástica estéril 3 mL, aspirar las cabezas y transferencia en una nueva placa de petri estéril 60 mm capas con cera negra solidificada y llena con la misma base de nervios suplido medio de cultivo como el anterior.
Nota: Este paso minimiza a la transferencia de contaminantes (pelo de ratón, sangre). La cera negra se utiliza para estabilizar la cabeza durante la disección. Medios de cultivo no necesita ser oxigenada durante estos procedimientos.
4. intraventricular plásmido inyecciones y electroporación Ex Vivo de la MGE
Nota: Los pasos siguientes deben realizarse en condiciones estériles en el gabinete de bioseguridad previamente preparado.
- Capas de lugar el plato de petri de 60 mm con cera negra y que contiene las cabezas decapitadas en neural basado suplido medio de cultivo con los prismáticos en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
- Estabilizar la cabeza, la parte rostral hacia la derecha, con las pinzas finas con la mano izquierda y use el inyector de nano en la mano derecha para inyectar 1-2 μl de la solución de plásmido/tinte de ventrículo lateral derecho.
Nota: Pueden ser experiencias de coexpresión realizado por co-electroporating un plásmido de rescate y un plásmido del shRNA-expresión mezclando ambos plásmidos en concentraciones equimolares. - Electroporate el cerebro inyectado.
- Coloque la cabeza entre los electrodos con el electrodo negativo situado dorsalmente y paralelo a la cabeza y el electrodo positivo hacia el lado ventral de la cabeza para apuntar el MGE.
- Una vez que los electrodos están bien posicionados, entregar 4 pulsos cuadrados de 40 V de 50 ms a ms 500 pulsos entre intervalos.
- Quitar cualquier tejido residual de los electrodos mediante pinzas ya colocadas en la bioseguridad gabinete.
Nota: Estos parámetros se han optimizado específicamente para la electroporator utilizado en nuestros experimentos. Recomendamos que los usuarios realizan pruebas optimizando previamente si se utiliza un tipo diferente de electroporator. - Repita los pasos 4.1 a 4.3 para todos los cerebros restantes.
Nota: Aunque este protocolo describe las manipulaciones necesarias para un cerebro, es posible inyectar hasta 4 cerebros secuencialmente antes de electroporating cada cerebro, aumentando así el rendimiento. Esta estrategia es especialmente ventajosa cuando 2 o más diferentes plásmidos se inyectan secuencialmente (control o experimental plásmido) durante el mismo experimento (permitiendo comparación entre hermanos de camada). Además, es posible inyectar y electroporate simultáneamente ambos lados del cerebro para aumentar el rendimiento, colocando los electrodos completamente paralelo a la superficie del cerebro.
5. disección y culturas Organotypic rebanada del cerebro
- Mientras manipula aún en el ambiente estéril de la gabinete de bioseguridad, diseccionar el cerebro fuera del cráneo.
- Estabilizar la cabeza en la capa de cera negra insertando una aguja en cada ojo evitando cuidadosamente el cerebro.
- Use un par de Pinzas finas para sostener el lado izquierdo del cuello y un segundo par de Pinzas finas para rasgar la piel del cráneo, de atrás hacia delante.
- Manteniendo la cabeza lateralmente con las pinzas en una mano, utilice otro par de pinzas en la otra mano para cortar con cuidado el cráneo a nivel del tronco encefálico y tire suavemente el cráneo hacia arriba. Con cada pinza, corte del cráneo en el plano sagital (línea media) hacia el frente y luego incidir lateralmente para liberar a los fragmentos de cráneo.
- Levante el tronco del encéfalo y corte cuidadosamente las meninges y nervios craneales hasta el cerebro está completamente fuera del cráneo.
Nota: Todos los pasos descritos en 5.1 deben realizarse bajo estrictas condiciones de esterilidad en un gabinete de bioseguridad.
- Incrustar el cerebro en 4% agarosa de punto de bajo punto de fusión para seccionamiento.
- Llenar un plato de petri de 35 mm con la solución de agarosa preparada anteriormente (mantenerse líquido a 42 ° C).
- Transferir rápidamente un cerebro de electroporated al plato lleno de agarosa utilizando la pipeta de transferencia anteriormente cortado. Mantener el plato a temperatura ambiente.
- Revuelva la agarosa con un palo de metal para mantener el cerebro en el medio del pozo (para evitar el hundimiento) y colocar el cerebro en un rostro caudal plano paralelo al plato. Dejar de revolver cuando la agarosa se solidifique, para evitar cualquier daño de cerebro.
- Utilice una cuchilla de afeitar para cortar la agarosa que rodean el cerebro para formar un bloque rectangular, dejando un margen de 1-2 milímetros alrededor del cerebro. Asegúrese de que la parte rostral del cerebro es perpendicular al límite anterior del bloque para facilitar la orientación para los pasos posteriores de seccionamiento.
- Repita para cada cerebro.
Nota: Es posible cortar más de un cerebro a la vez (máximo 3) formando bloques de agarosa separado mientras cada cerebro en distintas alturas.
- Secciones coronales de vibratome y sector cultura.
- Descongelar una alícuota de 100 X N-2 suplemento (150 μL) en el hielo y añadir al medio de cultivo alícuotas de 15 mL en condiciones estériles.
- Transferencia de 750 μl del medio de cultivo (con suplemento de X N2 1) en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pozos.
- Con una pinza curva, coloque una célula cultura (diámetro de 30 mm, 0,4 μm de tamaño de poro, PTFE) en cada bien llenas de medio.
- Llene el baño vibratome con ACSF continuamente oxigenada. Enfriar a 4 ° C con hielo alrededor de la bañera, o utilizar un vibratome refrigerado.
- Ajustar la velocidad de vibratome a 0.150 mm/s y la frecuencia de 80 hertzios.
- Pegar el bloque de agarosa en la plataforma de vibratome, borde rostral hacia abajo y ventral borde frente al usuario.
- Cortar el cerebro en secciones coronales para obtener 250 μm de espesor secciones (a 4 ° C).
- Con espátulas estériles, recoger secciones de 2-3 que contiene el MGE y lugar insertar todas las secciones del cerebro de un animal en una sola membrana de 30 mm, evitando cuidadosamente la superposición entre las secciones. Coloque el inserto en un pozo de una placa de cultivo de 6 pozos (contiene 750 μl de medio de cultivo suplementado, como se describe anteriormente). Por otra parte, cada sección puede colocarse en una membrana independiente de 13 mm de diámetro en una placa de cultivo de 12-bien llenada con medio de cultivo de 500 μl suplido. La cantidad de medio de cultivo recomendado para cada pozo permite que las secciones del cerebro ser alimentado por los medios de comunicación sin ser sumergido.
Nota: Los pasos descritos en 5.3.6 y 5.3.7 no llevan a cabo bajo condiciones de esterilidad completadas, a menos que el vibratome puede ser esterilizado y usado en un gabinete de bioseguridad. Por lo tanto, es crucial para llevar a cabo estos pasos con cuidado para evitar cualquier contaminación. Equipo de protección adecuado (mascarilla limpia, guantes quirúrgicos y bata de laboratorio) se debe usar en todo momento y partes del cuerpo, incluso cubiertas, tales como pelo, cara y manos, nunca debe pasar por placas (con o sin medio de cultivo). También se recomienda rociar etanol al 70% con frecuencia en los guantes y espátulas que se utiliza para recoger las secciones de la cerebral. - Coloque la placa de cultivo en una ventilado incubadora estéril a 37 ° C con 60% humedad y 5% CO2 para 48 o 72 h.
Nota: Estos tiempos de incubación fueron optimizados para la proyección de imagen de Time-lapse de INs derivados de MGE y proyección de imagen confocal de rodajas fijas, respectivamente. Tiempos de incubación óptimo deben analizarse previamente para cada diseño experimental. Además, si la incubación elegida es de 72 h y bajo, es necesario cambiar el medio de cultivo. Tiempos más largos de incubación, el medio de cultivo debe cambiarse cada 2-3 días. - Después de la hora deseada de la incubación, transferir las secciones de interés a un cubreobjetos de 8 cámaras y añadir 3-5 μl de medio de cultivo. Lugar el cubreobjetos en una cámara ambiental (37 ° C, 60% de humedad, 5% CO2) conectado a un invertido de giro confocal de disco equipado con un software de adquisición informática para instalar la sesión Time-lapse de imágenes.
Nota: Como alternativa, las secciones se pueden fijar con paraformaldehído al 4% (durante la noche a 4 ° C o 2 h a temperatura ambiente) y posteriormente immunostained con anticuerpos diferentes para la visualización de las características morfológicas del electroporated INs bajo un confocal microscopio. Aunque eGFP y mCherry pueden visualizarse por microscopía confocal sin ningún procedimiento contra manchas, se recomienda realizar inmunohistoquímica contra GFP y mCherry para mejorar la señal ya que el proceso de fijación puede reducir la fluorescencia, reduciendo la detección de los componentes más finos de neuronas embrionarias, como pequeñas ramas en los procesos principales o finales.
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Representative Results
En esta sección, ofrecemos resultados representativos obtenidos tras la electroporación ex utero de un plásmido de control, o de un plásmido experimental dirigido a un gen de interés, en el MGE de embriones de ratón e13.5 seguido organotypic rebanada culturas se incubó a 37 ° C durante 48 h (para la proyección de imagen de Time-lapse) o 72 h (para fijación y etiquetado immunohistochemical) (ver figura 1B para protocolo esquemático). Ejemplos representativos de INs migrando de un explante MGE también son ilustrada (ver figura 1 esquema protocolo) como una comparación con el método descrito aquí. La electroporación de un plásmido en progenitores MGE parece retrasar la salida de INs de la MGE y tiempo de la cultura debe modificarse en consecuencia.
En un experimento exitoso, organotypic rodajas aparecen saludables bajo el microscopio confocal, capas corticales es decir, son fácilmente distinguibles con el modo de campo brillante y no hay visible contaminación en la superficie de la rebanada (reconocibles por el intenso Autofluorescencia y la presencia de filamentos fluorescentes visibles con epifluorescencia). En rodajas saludables organotypic crónica, aproximadamente el 20% de las células experimentan apoptosis después de 72 h en cultivo (figura 2), según se describió anteriormente en crónica organotypic culturas (culturas por ejemplo postnatales)52. Sin embargo, estructura de cerebro bruto citoarquitectónica permanece bien definido, como se ilustra aquí usando DAPI que se manchaba (figura 2A). Nuestro protocolo para la electroporación ex vivo de la MGE rinde un promedio de 50-100 células transfected por segmento (Figura 3AB), de que las células de 5-20 se verá migración dorsal después de 72 h en la cultura. Después de la fijación y tinción inmunohistoquímica, INs emigran tangencialmente hacia la placa cortical puede ser fácilmente identificado con microscopía confocal ya que presentan un cuerpo ovalada alargada de la célula, el proceso que se arrastra ocasional y un proceso principal orientado tangencialmente. El proceso principal generalmente da lugar a una o dos ramas y es reconocible por la presencia de una hinchazón ocasional frente al núcleo (cubierta el centrosoma antes nucleokinesis) y conos de crecimiento en el extremo de cada rama. (Figura 3-G).
Este protocolo fue diseñado para la observación de migración derivados de MGE INs a nivel unicelular con la proyección de imagen de Time-lapse. Para este experimento particular (figura 4), rebanadas de cerebro organotypic coronal se generaron de Dlx5/6Cre; RCEEGFP electroporated embriones en e13.5 con un plásmido que expresa un shRNA experimental (dirigido a un gen de interés) y el cassette de TdTomato . Las rebanadas se incubaron durante 48 h, transfirieron a un plato bien 8 cámaras cubreobjetos (1 rodaja por cámara flotante en una capa delgada de medio de cultivo suplementado) y reflejadas cada 3 minutos para 6-8 h con un objetivo de 20 x aire (NA 0.70) en un microscopio invertido equipado con una cabeza confocal de disco giratorio, un software de adquisición asistida por ordenador y una cámara ambiental de etapa superior. Durante la proyección de imagen, las rodajas se mantuvieron a 37 ° C y fueron continuamente oxigenadas y humidificadas en la cámara ambiental (5% CO2 y 60% H2O). Derivados de MGE Electroporated INs fueron identificados como tal por su expresión de eGFP, confirmando su identidad de GABAérgico en y su expresión de TdTomato, confirmando que expresan el plásmido experimental (Figura 4AB). INs Electroporated son fácilmente identificables y bien aislados, como se ve en la figura 4, lo que permite el análisis más fino de los parámetros dinámicos de la migración, tales como velocidad y distancia recorrida. Además, marcada INs ven emigran tangencialmente hacia la placa cortical, mientras que en su ambiente natural, lo que nos permite identificar los cambios morfológicos dinámicos como ramificación del proceso principal y la nucleokinesis (figura 4 -F).
La electroporación ex vivo de derivados de MGE INs puede combinarse también con MGE explantes para permitir la proyección de imagen de alta resolución de procesos citoesqueleto dinámicos que ocurre durante la migración, como complemento al estudio de la dinámica migratoria y direccionalidad en las culturas organotypic. Por ejemplo, se pueden observar diferentes fases de la locomoción neuronal evocador de ésos que ocurren durante la migración tangencial de INs en organotypic rebanada culturas en electroporated INs migrar desde un MGE explante 48 h después de la electroporación, como líder la extensión del neurite y nucleokinesis (figura 5B-E). Entonces se pueden estudiar diversos procesos citoesqueleto en alta resolución en células aisladas, migrando de un explante MGE, por ejemplo por la coloración de las estructuras de la F-actina con phalloidin (figura 6A), que no puede lograrse óptimamente en rebanadas organotypic Dada la alta densidad celular (y por lo tanto de elementos citoesqueléticos) en un entorno nativo. Estos procesos citoesqueleto, y en particular F-actina remodelación, puede además estudiarse dinámicamente combinando Lifeact expresión con proyección de imagen de Time-lapse. Por ejemplo, mostramos un ejemplo de la imagen alta resolución Time-lapse de un derivado de un explante MGE obtenida de un Nkx2.1Cre; RCEEGFP cerebro de ratón con una eliminación específica de un gen de interés en INs. Este IN fue transfectado con el plásmido mCherry-Lifeact-7 bajo el control del promotor CMV (regalo de Michael Davidson), utilizando el método esquematizado en la figura 1, lo que permite el seguimiento de la F-actina remodelación que ocurre en tiempo real (figura 6B). así, mientras que las culturas organotypic están obligadas a evaluar correctamente la ruta direccionalidad o migración de INs modificados genéticamente, MGE explantes pueden complementar dichos estudios al proporcionar mejor acceso a células aisladas para la proyección de imagen de alta resolución de procesos dinámicos del citoesqueleto.
Dificultades técnicas pueden resultar en el fracaso de los experimentos descritos anteriormente. Por ejemplo, incrustar los cerebros en una solución de agarosa caliente a 42 ° C puede resultar en la destrucción del tejido y muerte neuronal, revelado por una pérdida de la translucidez del cerebro o rebanadas, que se convierten en opacos. Sin embargo, la temperatura debe no tener demasiado baja, como una solución de agarosa solidificación puede destruir el frágil cerebro embrionario durante el proceso de inclusión. En segundo lugar, la contaminación puede reducir significativamente el rendimiento de los enfoques experimentales descritos aquí. Así, todos los pasos deben llevarse a cabo con cuidado, bajo estrictas condiciones de esterilidad tanto como sea posibles. Todas las soluciones y equipos deben ser esterilizados antes del uso y equipos se deben rociar frecuentemente con etanol al 70% para evitar la contaminación de bacterias o moho. La contaminación puede ser visible directamente en los pozos de la cultura, el medio de cultivo se convierte en amarillo u opaco. Contaminación puede pasar inadvertida cuando el medio de cultivo sigue siendo clara y fluida. Sin embargo, generalmente se observa una capa de moho en la superficie de corte o las láminas se convierten en excesivamente frágiles durante la fijación y tinción de pasos. Cuando estas rebanadas se visualizan al microscopio, contaminación puede manifestarse como una capa de Autofluorescencia sobre neuronas marcadas o revelarse por la presencia de filamentos largos fluorescentes. Organotypic rebanadas en pozos contaminados deben ser arrojados, pero los sectores cultivados en los otros pozos de la placa de la misma pueden conservarse más pasos. La contaminación bacteriana es bastante rara pero debe ser tomada en serio, lo que significa que todos los equipos, incluyendo incubadoras compartidos y cuarto de cultivo deben manualmente limpiarse y esterilizarse.
Figura 1: Representaciones esquemáticas de los protocolos para la electroporación ex útero seguido organotypic de la rebanada cultura o MGE explantes. A. ejemplo de una configuración gabinete de bioseguridad con todos los instrumentos esterilizados para el protocolo descrito aquí. B. representación esquemática del protocolo usado por las culturas de rebanada de electroporación y organotypic de ex útero . Brevemente, los embriones son decapitados, se inyecta el plásmido experimental en el ventrículo lateral (1) y electroporated en el MGE (2). El cerebro trata de microdissected de cráneo (3) y en agarosa (4). Organotypic secciones se generan en un vibratome (5) y colocadas en la cultura en °C(6) 37 para 48 h para Time-lapse microscopía (7.1) o 72 h para las reconstrucciones de la célula (7.2). C. representación esquemática del protocolo adaptado de Myers et al. 201353 y utilizado para la generación de MGE de explantes. Brevemente, cortezas dorsolateral primero se diseca de e12.5 a embriones de ratón de tipo salvaje e14.5 (1) y disociar mecánicamente en medio de cultivo suplementado (2). Células corticales son plateadas con una densidad de 5,25 x 105 células corticales/cm2 y cultivadas por 2 h a 37 ° C en un colágeno/poly-L-lisina-cubrió 8 cámaras cubreobjetos (3). Entonces, e13.5 Dlx5/6Cre; RCEEGFP embriones son procesados para la ex útero electroporación de MGE (4, 5), y el MGE manualmente es aislado del cerebro y cortó en 100 μm2 fragmentos (6). Estos explantes luego se colocan encima de la capa previamente preparado alimentador cortical, cubiertos con medio de cultivo y co cultivados durante 48 h antes de la proyección de imagen de Time-lapse (7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: conserva Citoarquitectura en rodajas saludables organotypic. La generación de organotypic de la rebanada culturas después ex vivo electroporación de Nkx2.1Cre; RCEEGFP embriones de ratón (A) no resulta en daño tisular significativo, según lo revelado por conservado cytoarchitecture (DAPI (azul) y Cre-reportero (GFP)), comparado con un 18 criosección μm de grosor de un Nkx2.1Cre; RCEEGFP transcardially embrión perfundido con 4% PFA en e15.5. D y M indican ejes dorsoventral y latero medial, respectivamente. (B). imágenes de alta magnificación tomadas con un microscopio confocal invertido equipado con 63 x / 1.4 objetivo del aceite después de la tinción con un anticuerpo anti-hendido-caspasa 3 (Cl-cas3) revelan que aproximadamente el 20% de las células en la placa cortical se someten a apoptosis (flecha blanca) después de 72 h en la cultura, mientras GFP-positivas INs mantenerse saludable (flecha blanca), como en las microfotografías en C-C'' '. En comparación, la apoptosis celular es casi totalmente ausente de la fina criosección de un animal perfundido (D-D'' '). Barras de escala: 250 μm (A-B) y 15 (C-D'' '). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Organotypic rebanadas de ratones del cerebro embriones y Microfotografías de alta magnificación de interneuronas electroporated (INs). A. una cultura organotypic rebanada un Dlx5/6Cre; RCEEGFP cerebro de ratón (en el cual todos INs son verdes) electroporated con un Dlx5/6::shRNArevueltos-IRES-TdTomato plásmido. El segmento fue fijado con 4% PFA después de 72 h en cultura y immunostained para la GFP y mCherry. Electroporated INs fueron imágenes en 3D (50-60 μm de espesor z-pilas con secciones ópticas tomadas cada 0,5 μm) usando un microscopio confocal equipado con 63 x / 1.3 objetivo de aceite de NA. In migración tangencial en la zona sub-ventricular del Palio dorsal es fácilmente identificable (flecha roja, abierta). D y M indican ejes dorsoventral y latero medial, respectivamente. B. una organotypic representante sector cultura un electoporated de embrión de tipo salvaje (WT) con un control Dlx5/6::shRNArevueltos-IRES-TdTomato plásmido, fijada en 72 h y immunostained para mCherry solamente. Electroporated INs (rojo) se consideran migración dorsalmente hacia la placa cortical. INs Electroporated se identifican por su expresión conjunta de TdTomato y EGFP en Dlx5/6Cre; RCEEGFP ratones (C-D), o por su expresión de TdTomato sólo en ratones WT (E H) y por su morfología típica, es decir, un óvalo célula de cuerpo, un proceso principal ramificado (flecha blanca, D-H), un ocasionales que proceso (flecha blanca, C, D) y una hinchazón ocasional líder del proceso de la vivienda el centrosoma antes nucleokinesis (estrella blanca en C-C' y G). Barras de escala: 250 μm (A-B) y 25 (C-H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: imágenes en vivo Time-lapse de electroporated INs en rebanadas organotypic cultivadas para 48 h. INs electroporated en e13.5 con un plásmido experimental expresa el TdTomato del cassette y un shRNA dirigido a un gen de interés se ven en la migración tangencial en una rebanada del cerebro de organotypic obtenida de un de Dlx5/6Cre; RCEEGFP embrión de ratón después de 48 h de la cultura (PlazaA, blanco). En B, el mismo electroporated en (Plaza blanca) se ve en el proceso de nucleokinesis, al migrar tangencialmente en la corteza, es decir, paralela a la superficie pial y es seguido en time-lapse de imágenes cada 3 minutos durante 8 h con un 20 x / 0.85 aire NA objetivo (agrandamiento cajas, C-F). La neurona muestra inicialmente un cuerpo celular alargado (flecha abierta) en el proceso de nucleokinesis (C), así como un proceso que se arrastra (flecha blanca) y un proceso principal ramificado (flecha blanca). Después de 3 horas de imágenes en vivo, la nucleokinesis es completado, el proceso que se arrastra se ha retraído y el proceso principal la ampliación de dos ramas largas (D, puntas de flecha blancas). Después de 5 h 30 min, uno de la rama principal del proceso ha retraído (flecha blanca) y el cuerpo celular de la neurona (flecha abierta) se ha movido hacia adelante cerca de 10 μm (E). Finalmente, después de 8 h de la proyección de imagen, migración ha detenido, la neurona ha ampliado su proceso principal otra vez y un proceso que se arrastra ha aparecido (flecha blanca), pero el núcleo (flecha abierta) no ha evolucionado todavía hacia adelante (F). Barras de escala: 250 μm (A), 70 μm μm (B) y 30 (C-F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: proyección de imagen de Time-lapse de INs derivadas de un explante MGE cultivada para 48 h. INs se ven migrando de un explante MGE obtenida de un Nkx2.1Cre; RCEEGFP ratón (en la que todo deriva de MGE INs eGFP expres) electroporated con el plásmido CMV::mCherry-LifeAct-7 en e13.5, utilizando el método adaptado de Myers et al. 201353 y esquematizados en la figura 1, y cultivadas durante 48 h (A). INs fueron visualizados usando Time-lapse de imágenes en vivo de 5 horas (B-E). En este ejemplo, una en conjunto expresan eGFP y LifeAct es vista inicialmente en el proceso de nucleokinesis (flecha abierta) y extiende dos ramas principales del proceso (flecha blanca; B). en esta completa nucleokinesis después de 1 h (ver flecha abierta), como el cuerpo de la célula ha avanzado y un proceso que se arrastra ha aparecido en la parte posterior del cuerpo celular (flecha blanca) y todavía muestra un proceso líder con dos ramas (flecha blanca; C). una segunda nucleokinesis es en marcha después de 2 h 30 min (flechas abiertas) y el ahora está dotado de dos procesos principales de cuerpo celular y un proceso largo que se arrastra (flecha blanca; D). Finalmente, después de 5 h, la retrae una neurita y translocación del centrosoma en la rama de proceso principales restantes (flecha blanca) en preparación para una tercer nucleokinesis, con un proceso que se arrastra (flecha blanca) sigue presente en la parte trasera el cuerpo de la célula (E). Barras de escala: (A) de 70 μm y 20 μm (B-E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: alta resolución Time-lapse de imágenes de la remodelación de la actina en el INs de un explante MGE cultivados durante 48 h. A. Una rebanada de organotypic de un Nkx2.1Cre; RCEEGFP cerebro de ratón se fija en e15.5, teñidas con Alexa-594 Phalloidin, permitiendo la visualización de la actina filamentosa. INs está reflejada con un x 63 / 1.3 objetivo de aceite de NA en un microscopio confocal. En INs salud, actina filamentosa es visto ahuecando la parte posterior del cuerpo de la célula después de la retracción del proceso final después de la terminación de la nucleokinesis (flecha blanca, A'-A'' '). B. explante un MGE se obtiene como el anterior de un Nkx2.1Cre; RCEEGFP cerebro de ratón con una eliminación específica de un gen de interés y electroporated con un plásmido de expresión mCherry-Lifeact-7 bajo el control del promotor CMV . La proyección de imagen en time-lapse se realiza después de 48 h de la cultura, y electroporated INs son seguidos cada 3 minutos durante 3 horas con un 40 x / 0.85 objetivo de aire. Activa remodelación del citoesqueleto de actina se produce in transfectadas con LifeAct, ejemplificado por el movimiento del rojo (blanco en las imágenes en blanco y negro) fluorescentes puntos dentro de los conos de crecimiento y proceso principales (flecha blanca) y en la parte posterior de la cuerpo de la célula durante la nucleokinesis (B-B'' ', blanco de las flechas). Barras de escala: 7 μm (A-A'' ') y 10 μm (B-B'' '). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo, nos proporcionan un método confiable para realizar ex útero electroporación del ratón MGE en e13.5 y para la generación de culturas organotypic de rebanadas del cerebro embrionario. Aunque en vitro métodos, tales como el análisis de la cámara de Boyden, son relativamente fáciles de realizar y pueden utilizarse para evaluar los roles específicos de diferentes genes y proteínas sin la interferencia de otros factores, impide la investigación de IN dinámica de migración con respecto a la direccionalidad y la migración de la ruta25. Explantes MGE proporcionan un medio útil para estudiar los cambios citoesqueleto dinámicos que ocurre durante en la migración, como se muestra aquí, pero están desprovistas de señales más endógenas y a menudo requieren la adición de señales de orientación para promover la migración neuronal (aunque esto es mejoró significativamente cuando los explantes MGE se cultivan en las capas corticales alimentador)25,54. Sin embargo, ensayos basados en explantes MGE pueden no detectar la implicación de señales moleculares implicadas en mecanismos más sutiles como los que guían la direccionalidad o migración de ruta de acceso específica de INs29. Este problema fue eventualmente eludido en el útero electroporación25, que permite el etiquetado específico de INs derivados de MGE migrando en su entorno nativo de29,13,41. Sin embargo, esa técnica es un reto de habilidad, debido a los procedimientos quirúrgicos involucrados, y su rendimiento está limitado por la baja tasa de supervivencia de los embriones y el hecho de que el MGE es difícil tratar en el útero, a menudo requiere el uso de múltiples camadas al alcanzar significación55. Por lo tanto, ex útero electroporación de la MGE seguido por cultura organotypic de embriones de ratones cerebro proporciona un método de bajo costo, eficiente y confiable para investigar la dinámica de la migración y la morfología de INs derivados de MGE en natural medio ambiente, mientras que la elusión de los procedimientos quirúrgicos de electroporación en el útero y la necesidad de orientación de señales en explantes MGE. Además, esta técnica permite un acceso más fácil a la MGE, que puede ser objetivo de apposing directamente el electrodo positivo en el cuello y el negativo encima de la cabeza, una configuración más difícil de adoptar en el útero. Alternativamente, se puede inyectar focal el MGE y electroporated directamente después de generar organotypic rebanadas13,25,29, pero esta técnica ha demostrado ser más difícil y menos efectiva en nuestras manos que el protocolo descrito aquí. Siguiendo los pasos descritos en este artículo, uno obtendrá 50-100 electroporated INs derivados de MGE por organotypic rebanada, 5-20 de los cuales se verá migrar tangencialmente de la MGE después de 72 h. Transfected INs pueden visualizarse vivo con proyección de imagen de Time-lapse o imagen y reconstruida después de la fijación y etiquetado immunohistochemical.
El protocolo descrito aquí fue optimizado para el estudio de la migración ex vivo y se inspiró en varios protocolos publicados que describen en el útero la electroporación de INs derivados de MGE, vivo ex MGE inyección y electroporación, o la generación de organotypic crónica cerebro rebanada culturas36,38,39,42,43,56,57,58. Nuestro enfoque limita el daño potencial a trasplante de precursores MGE mediante el uso de menor intensidad de pulso (40 V) y las inyecciones de plásmido intraventricular en lugar de inyecciones de MGE intra con pulsos de alto voltaje (100 V), como se describe en otra parte39,56 ,57,58. Además, mientras que otros utilizan una combinación de penicilina, estreptomicina y gentamicina para prevenir la contaminación bacteriana39,56,57,58, hemos apostado para evitar antibióticos en nuestro medio de cultivo ya que pueden afectar teóricamente en la migración. En particular, la penicilina es un antagonista de los receptores de GABAA 59,60, y la activación del receptor GABAA activa y más tarde se detiene en la migración según gradientes de cloruro intracelulares y KCC2 expresión en distintas fases de migración61. Sin embargo, usando las varias precauciones establecidas en el protocolo actual, puede efectivamente evitar la contaminación incluso en ausencia de antibióticos.
A pesar de la eficacia de este enfoque en nuestras manos, ex útero electroporación también tiene sus desventajas. Mientras que proporciona un entorno tridimensional natural para las células para migrar, puede ser difícil realizar Ensayos farmacológicos en organotypic rebanadas en el contexto de migración. De hecho, la migración de los derivados de MGE INs depende sobre todo de señales extracelulares2,13,19 y la aplicación de inhibidores farmacológicos o activadores en rebanadas organotypic no permite la precisa disociación de efectos autónomos en células de los efectos globales en la salud general del sector o actividad. Para tales experimentos, explantes MGE cultivados sobre células corticales disociadas mixtas sería preferibles a culturas organotypic slice desde migrar fuera del explante puede ser más fácilmente aislado y expuesto selectivamente a componentes específicos62. Además, aunque ex útero electroporación es más fácil de realizar que la electroporación en el útero , todavía puede ser un desafío técnico en la edad embrionaria ilustrada aquí dado el pequeño tamaño y frágil estado del cerebro embrionario en E13.5. investigadores necesitarán unos pocos ensayos para extraer eficientemente el cerebro electroporated en e13.5 sin dañar la superficie del cerebro. Además, en lugar de rebanadas postnatales, rebanadas organotypic embrionario no se puede mantener en cultura durante largos períodos de tiempo. Aunque organotypic embrionario sector culturas pueden conservarse por lo menos 7 días en vitro63, esto no fue combinado con electroporación y los experimentos aquí descritos han sido probados para hasta 3 días en vitro con resultados confiables en nuestras manos. Por lo tanto, los investigadores deben realizar pruebas de optimización previamente si se requieren tiempos de incubación más largos. Además, la investigación del desarrollo en las últimas etapas embrionarias o tempranas postnatales no se recomienda con esta técnica al utilizar embriones de e13.525, pero se puede lograr con electroporación en el útero , donde con éxito electroporated embriones se vuelvan a colocar en la cavidad uterina y pueden dejarse para ser llevado y analizados en posteriores etapas21,64. Por último, ex útero electroporación seguida organotypic rebanada culturas permite el análisis de la morfología y la dinámica de migración del INs en desarrollo. Sin embargo, como ha sido previamente señalado por el en el útero electroporación técnica36, ex utero electroporations rendimiento electoporated de 50-100 células por rebanada del cerebro y por lo tanto no son adecuados para el análisis de la población. Dichas investigaciones se llevan a cabo mejor en modelos animales con condicional o completa eliminación (o knock-in) del gen de interés. Cuando sea posible, tales modelos entonces pueden usarse eficientemente para generar organotypic rebanada culturas o MGE explantes para visualizar la dinámica real de la migración, como se muestra aquí (véase la figura 5 y figura 6).
Muchos pasos en este protocolo deben llevarse a cabo cuidadosamente para obtener resultados óptimos. Por ejemplo, es primordial que todos los pasos se realizan bajo estrictas condiciones de esterilidad, como la contaminación puede ocurrir muy fácilmente. Guantes y los instrumentos utilizados fuera del gabinete de bioseguridad se deben rociar con etanol al 70% con frecuencia durante todo el procedimiento. Además, las soluciones como medio de cultivo líquido cefalorraquídeo artificial deben mantenerse estériles y frío (4 ° C) y hecho fresco cada 2-3 semanas. Para etiqueta INs MGE derivados concretamente, plásmidos que se utilizan en tales experimentos deben ser clonados bajo el control de un promotor específico de IN (ex: Dlx5/649, Lhx665), en lugar de simplemente la anatómica orientación de la MGE. La generación de rebanadas organotypic requiere el cerebro para mantenerse con vida. Por lo tanto, para preservar la salud de la célula y la supervivencia, este experimento debe realizarse en menos de 3 horas desde el momento en que los embriones se recuperan hasta que se ponen las rebanadas organotypic en cultura. Eficiencia de tiempo, placas pueden precargadas con medio de cultivo casero justo antes de comenzar el experimento y poner en la incubadora de cultivo celular de 37 ° C hasta su uso. Además, el cerebro debe ser cuidadosamente disecado fuera del cráneo sin ningún daño a la superficie cortical con el fin de lograr la integración adecuada en la solución de agarosa y posterior vibratome-seccionamiento. Por ejemplo, daños en la superficie cortical, incluso mínima, pueden resultar en el desprendimiento de las 250 μm de espesor secciones del gel de agarosa circundante o en la degradación de las secciones durante el seccionamiento de vibratome. Para la supervivencia neuronal, pero también es importante que la temperatura de la solución de agarosa sigue siendo cerca de 42 ° C, como temperaturas más altas conducen a tejido daño y muerte celular, mientras que temperaturas más bajas impiden la correcta fijación del cerebro (o dañarlo durante el incrustación de proceso). Una vez en la cultura, para evitar otras fuentes de contaminación, las rebanadas deben no manipularse hasta que se transfieren al microscopio para obtener imágenes. Estos pasos deben llevarse a cabo en un ambiente esterilizado y prestar atención no a contaminar las placas después de estas manipulaciones, especialmente si tienen que colocarse en la cultura posterior a la proyección de imagen. Por último, no recomendamos recuperando una alícuota de ADN mezclado con la carga de tinte de experimentos anteriores para su uso futuro como observamos una reducción considerable en el rendimiento de las neuronas electroporated con dicho material.
En conclusión, el ex útero electroporación y organotypic rebanada cultura protocolo descrito anteriormente permite el etiquetado específico de INs MGE derivado a nivel unicelular y puede utilizarse para manipular genéticamente vías moleculares específicas a estudiar su papel en la regulación de los cambios morfológicos y la dinámica de migración de migración tangencial INs. Este método permite la investigación funcional temprana rápida y de bajo costo de los genes del nuevo candidato identificado a través de la secuencia de RNA unicelular de migratorias INs66,67 o a través de la siguiente generación de la secuencia de los pacientes con los trastornos de Neurodesarrollo68,69,70. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para estudiar la migración en otras poblaciones de células, incluyendo células piramidales en la corteza y el hipocampo70,71,72,73. Una vez dominado, se pueden utilizar a la imagen el reciclaje y el tráfico de proteínas de membrana, tales como receptores y canales utilizando proteínas GFP-etiquetadas; la activación de cascadas de señalización celulares específicas utilizando biosensores74; o incluso la vigilancia y la manipulación de la actividad celular usando proyección de imagen de calcio juntada a optogenetics en INs cortical, sino también en otras áreas del cerebro, como el hipocampo, la amígdala o incluso el cuerpo estriado.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar. Las opiniones aquí expresadas no necesariamente representan las opiniones de la Ministra de salud o el gobierno de Canadá.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Saboya y la Fundación de epilepsia de la curación de funcionamiento y por el equipo de becas de la Fundación Canadiense para la innovación E.R (microscopio confocal) y G.H (microscopio confocal de disco de spinning). E.R. recibe un premio de carrera de la Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Premio clinician-Scientist) así como de los institutos canadienses de investigación en salud (CIHR; Premio al investigador joven). G.H. es un erudito principal del FRQ-S. L.E es el destinatario del Premio Steriade Saboya posdoctoral de la Fundación de Saboya, la formación postdoctoral CHU Sainte-Justine Fundación y el Premio de formación postdoctoral FRQ-S, en colaboración con la Fundación de las estrellas. Este proyecto ha sido posible por el Canadá de cerebro a través del fondo de investigación cerebral de Canadá, con el apoyo financiero de Canadá de la salud, otorgado a L.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 serum-free supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 50X Serum-free neuron specific supplement |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11415064 | Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Horse serum, heat inactivated | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| Neurocell supplement N-2 100X | Wisent | 305-016 | Botteinstein's N-2 Formulation |
| VWR Square PETG Media Bottles 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| Class II Type A Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-540 | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.1 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.1 | |
| Sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| D+ glucose | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| Potassium Chloride | ThermoFisher Scientific | P217-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | BioShop | SPM400.500 | |
| Calcium chloride dihydrate | ThermoFisher Scientific | C79-500 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | BiosShop | MAG522 | |
| Agarose | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube | Drummond scientific | 1-000-800/12 | |
| Ethanol | VWR | E193 | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson & Co | 309646 | |
| Mineral Oil (heavy) | Rougier Pharma | ||
| WPI Swiss Tweezers #5 | World Precision Instruments | 504511 | 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these. |
| WPI Swiss Tweezers #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips |
| HTC Tweezers | World Precision Instruments | 504617 | 11 cm, Straight, flat |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these. |
| Dressing Forceps | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm, straight, serrated |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 504478 | 10.2 cm, full curve, serrated |
| DeBakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501996 | 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide |
| Fisherbran Microspatula with rounded ends | FisherScientific | 21-401-5 | You will need 2 of these. |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond scientific | 3-000-204 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm dish |
| Tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800 | 35-mm dish |
| Black Wax | FisherScientific | S17432 | |
| Transfer pipettes | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL, small bulb |
| Stereo Microscope | Leica Biosystems | Leica M80 | In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific) |
| Electro Square Porator | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & Co | 305127 | |
| Leica VT1000S Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM, Single edge razor blade | Electron Microscopy Sciences | 71952-10 | Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome |
| µ-Slide 8 well | Ibidi | 80827 | Pack of 15 |
| Millicell cell culture insert | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. |
| Leica DMi6000 microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Spinning disk confocal head Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 acquisition software | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell Stage top incubation system | Pathology devices | LC30030 | Provides Temperature, CO2 and humidity control. |
| SP8 confocal microscope | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Gift from Michael Davidson |
| Fast Green FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission |
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