Summary
三维脊髓培养的小鼠囊和耳蜗在光学透明胶原 i 凝胶保存固有的组织形态学, 允许机械刺激通过调整基质刚度, 并允许病毒介导的基因传递。
Abstract
内耳的感官器官由于无法进行实验操作和光学观察, 对哺乳动物的研究具有挑战性。此外, 虽然现有的文化技术允许生物化学的扰动, 这些方法并没有提供一个方法来研究机械力和组织刚度的影响, 在发展的内耳感官器官。在这里, 我们描述了一个三维脊髓文化的完整的小鼠囊和耳蜗克服这些限制的方法。在这里描述的三维矩阵刚度的调整技术允许操纵的弹性力反对组织生长。因此, 该方法可以用来研究机械力在内耳发育过程中的作用。此外, 这些文化还允许病毒介导的基因传递, 可用于增益和功能损失的实验。这种培养方法保留了固有的毛发细胞和支持细胞, 作为传统的前庭和听觉知觉器官的二维文化的潜在优越替代品。
Introduction
体外系统促进了哺乳动物器官发育的大多数方面的研究。现在有两种主要的方法用于前庭感觉器官的培养: 自由浮动的1和黏附的2准备。这两种方法都允许调查毛细胞漏洞3和再生1,4 在体外。此外, 凹槽5、6、Wnt7、8和表皮生长因子受体 (EGFR)9、10信号级联在内耳中的发展角色有在某种程度上是通过使用体外的感官上皮培养而建立的。然而, 细胞生长和分化的控制, 不仅通过格局来说信号, 而且还通过物理和机械的线索, 如细胞间接触, 僵硬的细胞外基质, 和机械伸展或收缩。这种机械刺激的作用在开发内耳体内的研究中具有挑战性。此外, 现有的游离漂浮和贴附培养方法不适用于这种研究在体外。在这里, 我们描述了一个三维脊髓培养的方法, 胶原蛋白 i 凝胶的变化刚度。此方法主要保留前庭和耳蜗感官器官的体内结构, 并允许对机械力对生长和分化的影响进行调查11。
因为已知的机械刺激可以激活下游分子事件, 如河马信号通路12,13,14,15, 这是很重要的, 能够结合机械刺激生化和基因操控。这里描述的文化方法允许病毒介导的基因交付, 因此可以用来研究在内耳发育过程中的机械和分子信号学11。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了洛克菲勒大学和南加州大学动物保育和使用委员会的批准。
1. (可选) 用小鼠尾肌腱制备胶原 i 型溶液
注意:胶原蛋白 I 解决方案可在商业上使用。按照制造商的说明进行凝胶制剂。
- 弄死 5-10 个年轻成人 (3-5 周大) 的小鼠, 任何野生型菌株与二氧化碳按照有关机构动物护理和使用委员会批准的议定书16。收集尾巴和消毒他们通过淹没在70% 乙醇至少在室温下4小时。
注意:培养超过48小时应避免, 因为它导致过多的组织脱水和阻碍肌腱提取过程。 - 从每条尾巴的皮肤, 通过引入一个切割刀刀片和缩回整个皮肤的镊子。将剥皮的尾巴转移到一个100毫米的培养皿中, 里面装满干净的70% 乙醇, 切成10毫米的段。
注意:丢弃尾部最薄的部分, 这是难以操作的。 - 使用镊子, 确保尾部的每一段到培养皿的底部, 并使用第二对精钳从尾部一次提取肌腱。个别肌腱纤维应出现的阻力最小。
注意:陈旧的, 沉闷的 #5 钳为这一步的工作很好。 - 在不育的分子级水中, 准备100毫升的醋酸0.1% 溶液 (按体积), 并在不育的100毫米培养皿中加入10毫升的溶液。将肌腱转移到培养皿中, 在室温下留1小时变性胶原蛋白 i。
- 使用无菌手术刀或虹膜剪刀钝, 弯曲的提示, 以切碎肌腱成 1-2 毫米碎片。将切碎的肌腱转移到不育的50毫升管中, 加入0.1% 醋酸, 使体积增加到50毫升。
注意:使用四或五尾为每50毫升的酸, 以实现胶原 i 浓度的 2.0-2.5 毫克/毫升。 - 将胶原蛋白 i 溶液冷藏4摄氏度, 最小为48小时, 以促进蛋白质的完全变性。涡旋与桌面涡设置为最大速度为1分钟两次一天。
- 用二辛可宁酸法测定溶液的蛋白质浓度, 通过添加0.1% 醋酸溶液, 将胶原 i 浓度调整为 2.0-2.5 毫克/毫升, 并贮存在4摄氏度。
注意:胶原 i 溶液可以储存一到两年。 - 选离心的胶原 i 溶液在 2000 x g 1 小时在4摄氏度, 并使用半透明的顶部分数 (约一半的体积), 以实现光学明确的胶原凝胶在4节。
2. 前庭和听觉器官的解剖
- 根据有关机构动物保育和使用委员会批准的议定书, 弄死怀孕小鼠任何与二氧化碳有关的菌株16。提取并斩首胚胎。
注意:Lfng-CreERT2/tdTomato 鼠标可用于在暴露于 4-hydroxytamoxifen17时允许永久标记支持单元格。 - 消毒所有的工作表面和解剖器械, 包括两对 #5 钳和一条发刀18, 通过清洁70% 乙醇。
- 通过采用无菌手术刀刀片或使用两对 #5 钳, 将每个头分成两半。提取的颞骨, 其中包含内耳19, 并把它们放入15毫升的冰冷汉克的平衡盐溶液 (HBSS) 在60毫米的培养皿。把盘子放在冰上。
注意:从 E13.5 到 E18.5 的各个阶段的胚胎已经成功使用。 - 选在50毫升的锥形管中轻轻摇动它们, 其中包含30毫升冰冷的 HBSS, 并更换 HBSS 三或四倍。把管子放在冰上。
注意:这一步骤限制了可能的组织培养的污染, 并迅速带来的温度为4摄氏度, 这可以防止组织退化和细胞死亡。 - 使用两对精细 #5 钳, 分开的内耳从颞骨和转移的耳朵, 每次三或四, 成一个60毫米的培养皿充满冰冷的 HBSS。
- 解剖前庭感官器官。
- 将耳朵内侧侧向上定位, 并找到囊。用两对 #5 钳, 除去前庭器官周围的软骨。轻轻地切断前庭神经, 囊和囊之间的连接, 以及半圆形运河, 如图 1所示。轻轻拉囊和 ampullae 的上级和水平半圆运河从耳朵。
注意:该方法可用于 E16.5 E18.5 阶段的内耳。保存下面3节的软骨碎片。
- 将耳朵内侧侧向上定位, 并找到囊。用两对 #5 钳, 除去前庭器官周围的软骨。轻轻地切断前庭神经, 囊和囊之间的连接, 以及半圆形运河, 如图 1所示。轻轻拉囊和 ampullae 的上级和水平半圆运河从耳朵。
- 解剖耳蜗。
- 用两对 #5 钳去除听觉器官周围的软骨组织。轻轻地切断耳蜗底座和囊之间的连接, 如图 1所示。
注意:对于分期 E13.5-E14.5, 软化软骨前解剖通过治疗内耳与0.25% 胶原酶 I 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液5分钟室温。保存下面3节的软骨碎片。
- 用两对 #5 钳去除听觉器官周围的软骨组织。轻轻地切断耳蜗底座和囊之间的连接, 如图 1所示。
- 使用 200-µL 吸管装有宽的不粘锅尖端, 转移胞果和耳蜗到一个30毫米培养皿填充生长培养基, 包括 DMEM/F12 补充33毫米 Dglucose, 19 毫米碳酸氢钠, 15 毫米 4 (2 羟乙基)-1piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES), 1 毫米谷氨酰胺, 1 毫米烟酰胺, 20 毫克/升表皮生长因子, 20 毫克/升成纤维细胞生长因子, 10 毫克/升胰岛素, 5.5 毫克/升转铁蛋白, 5 µg/升亚硒钠。
- 保持囊的准备为3小时, 在37摄氏度的组织培养孵化器与5% 二氧化碳, 以允许愈合的切口在解剖过程中引入的上皮。耳蜗的准备工作应转移到胶原凝胶后10分钟的解剖。
注意:因为解剖是在冰冷的 HBSS 中进行的, 所以没有必要将生长培养基预热到37摄氏度。
3. (可选) 通过增加不同浓度的软骨细胞来调节胶原蛋白 i 凝胶的硬度
注意:软骨细胞隔离的方法从戈塞特et 。20
- 准备1% 溶液的胶原酶 I 在无菌 1x PBS 和存储 100-200 µL 整除数在-80 摄氏度。在冰上解冻时需要, 避免多个冻融循环。
- 用细钳收集从前庭和听觉器官解剖遗留下来的软骨碎片, 从 10-12 耳。从软骨中分离结缔组织和内耳组织。将软骨转移到30毫米培养皿中, 加入300µL 的无菌生长培养基。
- 使用无菌手术刀刀片或虹膜剪刀钝弯曲提示, 以粉碎组织, 以达到大约0.5 毫米的软骨片长度。
- 添加胶原酶 I 到培养基与软骨, 以达到最终的酶浓度为0.25%。把盘子转移到一个组织培养孵化器在37°c 毒气与5% 二氧化碳。吸管积极使用1000µL 吸管每20分钟, 直到软骨部分离解, 并已不再区分在解决方案, 然后孵化额外20分钟。
注意:在囊准备的情况下, 可以在步骤2.9 中执行软骨细胞隔离;它需要大约2小时 (3-4 吹打回合)。 - 收集细胞悬浮在一个15毫升圆锥管和调整体积为10毫升与无菌 1x PBS。离心机在 800 x g 5 分钟在4摄氏度。取出上清液, 并用重悬10毫升无菌 1x PBS 中的细胞。离心机在 800 x g 5 分钟在4°c 和去除上清。
注意:两次冲洗细胞是至关重要的;任何剩余的胶原酶, 我会消化胶原蛋白 i 凝胶。 - 使用 200-µL 吸管, 添加100µL 培养基的细胞颗粒和吸管轻轻地并用重悬。使用 hemocytometer 计算单元格并在冰上维持它们。
- 为了增加凝胶的硬度, 添加软骨细胞到中性胶原 i 凝胶溶液 (1 节), 并迅速混合在整个凝胶之前分配细胞凝固。
注意:胶原 i 型凝胶的弹性模量 (硬度的测量), 随着软骨细胞数量的增加而增大11。该关系由实验确定的线性函数E = 206·描述。Nc + 15, 其中E是帕斯卡中的弹性模数, Nc是数以百万计的软骨细胞数。有关凝胶刚度测量的详细协议, 请参阅原始文章11。
4. 将前庭或听觉感觉器官放置在胶原蛋白 i 凝胶中
- 在不育的1.5 毫升管, 制备胶原 i 聚合溶液的混合160µL 10x PBS 与苯酚红色 pH 值, 133 µL 0.34 米氢氧化钠, 70 µL 的0.9 米碳酸氢钠, 40 µL 1 米 HEPES。把管子放在冰上。
注意:这个食谱提供了聚合解决方案, 以准备2毫升胶原蛋白 i 凝胶, 但可以根据需要缩放。 - 混合100µL 的聚合溶液和400µL 的胶原 i 溶液在冰上轻轻吹打上下在一个冷冻1.5 毫升管。为了增加凝胶的硬度, 添加50µL 的生长培养基中含有软骨细胞, 并轻轻混合, 如第3节所述。
- 将中性胶原 i 溶液的500µL 转移到一个冷冻的30毫米培养皿中, 用10毫米的玻璃底部插入物或一个四井板的井。
注意:保持冰上的所有试剂, 防止胶原蛋白的快速和不均匀聚合是至关重要的。 - 快速将耳蜗或胞果转移到中性胶原 i 溶液中, 用不育的发刀18或一对精钳将器官调整到所需的位置.
注意:胶原 i 聚合在 1-2 分钟以后变得引人注目, 因为溶液变得混浊。 - 在溶液周围的组织已聚合, 放置培养皿或四井板20分钟37°c 在一个组织培养孵化器与5% 二氧化碳毒气, 以确保完全聚合。
- 添加3毫升的生长培养基辅以0.5% 胎牛血清 (血清) 每培养皿或500µL 的同一培养基每井四井板。保持37°c 的文化在一个组织培养孵化器与5% 二氧化碳毒气。如果需要, 补充生长培养基与10µM 5-乙炔-2´脱氧尿苷 (教育局) 标签增殖细胞。
注意:如果需要, 可以使用更高的血清浓度。
5. 三维的前庭和听觉知觉器官的病毒注射
- 在冰上解冻所需的病毒, 并在0.5 毫升锥形管中与台盼蓝溶液混合, 达到最终染料浓度的0.05%。使用 10-20x 染料, 以避免大量稀释的病毒。保持冰块。
注意:腺病毒5型对感染囊19中的支持细胞最有效, 而腺相关病毒 Anc80 可以感染囊和耳蜗21中的毛发细胞和支持细胞。 - 在一双双目解剖显微镜的最高放大倍数下, 用干净的细钳在微拉拔器上折断玻璃针的尖端。
注意:优化拔针器的设置非常重要。针与 9-12 毫米小腿和 20-30-µm 开口工作最好。 - 从孵化器中移除感官器官的培养。将针贴在 microinjector 上, 用 2-3 µL 染料和病毒混合物填充。在双目解剖显微镜下观察, 将针头推进感官器官。
- 通过三维 utricular 培养的屋顶的间质和上皮层轻轻地驱动针尖。注入病毒混合物, 直到囊和 ampullae 的空洞填充蓝色染料。
注意:因为它允许容易接触感官器官, 一个10毫米的玻璃底部培养皿是最佳的注射。 - 在5% 二氧化碳的组织培养孵化器中孵育37摄氏度。
注意:在病毒结构中使用绿色或红色荧光蛋白时, 荧光在病毒传导后明显24小时。
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Representative Results
从胚胎耳中培养的前庭和听觉知觉器官 40-Pa 胶原蛋白 i 型凝胶模拟低刚度胚胎条件11, 保留相对正常的三维结构 (图 1) 并保持毛发细胞和支持单元格 (图 2和图 3)。虽然支持的细胞密度降低了30% 以上 (学生的t测试: n = 4, p < 0.004) 和毛细胞密度下降 60% (学生的t测试: n = 5, p < 0.0001) 在3天以后在 utricular 文化 (图2), 在同一时间段内, 黄斑的面积大于双倍11 (n = 3, p = 0.0002)。这表明, 这里描述的三维区域性的方法允许显著增加支持单元格的数量11, 同时在3天的时间内保持囊中现有毛发细胞的80%。在从 E14.5 耳蜗建立的三维培养中, Sox2-positive 祖细胞在培养3天后, 分化为内、外毛细胞形态学上区分的行 (图 3)。
基因表达可以通过病毒感染的方式在前庭和听觉器官的三维文化中纵。4hydroxytamoxifen 被添加到培养基中, 以标记由 Lfng-CreERT2/tdTomato 小鼠17E15.5 胚胎建立的耳蜗外植体中的支持细胞。将5型腺病毒注射到培养腔内会导致器官基部支持细胞感染 (图 4A)。将同一病毒注射到从 E17.5 胚胎建立的 utricular 培养腔内, 主要是在整个感官上皮中的支持细胞感染 (图 4B)。
图 1。三维胶原凝胶中囊和耳蜗代表性培养的解剖和光镜图.(A) 示意图描绘了小鼠内耳六受体器官的感觉上皮 (绿色)。红线描绘了在解剖囊和耳蜗时引入的切口。(B) 光学显微图像将 E17.5 囊 (上板) 和 E14.5 耳蜗 (下板) 嵌入胶原蛋白 I 凝胶中, 培养48小时。刻度条代表100µm。此数字已从 Gnedeva et al中进行了修改。11请单击此处查看此图的较大版本.
图 2。三维 utricular 文化中的毛发细胞和支撑细胞.(A) 共焦显微图像在 explantation (顶部面板) 之前和3天后在 40-Pa 胶原 i 凝胶 (底部面板) 的三维培养中描绘 E18.5 囊。头发细胞被标记为 Myo7A (绿色) 和支持细胞为 Sox2 (红色)。刻度条代表50µm. (B) Quantifications 在 explantation 之前和三维器官培养3天后, 支持细胞密度 (红条)、毛细胞密度 (绿条) 和黄斑区 (灰色条) 的 E18.5 胞果表示为 "@" 中小企业 (p < 0.001 表示为 ** 和p < 0.0001 作为 **)。此数字已从 Gnedeva et . 中进行了修改。11请单击此处查看此图的较大版本.
图 3。三维耳蜗培养中的毛细胞和支撑细胞.共焦显微图像在 explantation (顶板) 和3天后在 40-Pa 胶原 i 凝胶 (底部板) 的三维培养中描绘出 E14.5 耳蜗。Myo7A-和 Sox2-positive 内毛细胞 (IHC) 和外毛细胞 (OHC) 出现在 4-5 行后3天的文化。支持细胞也被标记为 Sox2 (红色)。刻度条代表25µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4。在耳蜗和囊的三维器官培养中, 有代表性的病毒感染结果.(A) 从 Lfng-CreERT2/tdTomato26 E15.5 的胚胎中注射5型腺病毒为三维耳蜗培养物, 在该器官的基础上导致感染 (GFP, 绿色) 的支持细胞 (西红柿, 红色)。感觉上皮是用灰色划定的。刻度条代表100µm. (B) 从 E17.5 胚建立的三维 utricular 培养中的相同注入导致整个器官中支持细胞 (Sox2、红色) 感染 (GFP、绿色)。感觉上皮是用灰色划定的。刻度条代表100µm。此数字已从 Gnedeva et . 中进行了修改。11请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
研究了在发育过程中调节内耳生长和分化的分子信号5,6,7,8,9,10。然而, 从 utricular 模型系统获得的证据表明, 通过细胞连接感知的机械线索和河马信号的活化, 在这些过程中也扮演着重要的角色2,11,22. 此外, 从感官上皮中挤出死毛细胞, 再通过转分化形成新的感官受体, 会影响残余支撑细胞所感受到的机械力, 导致它们在再生过程中重新输入细胞周期。这里描述的三维培养系统提供了一种实验方法, 可以在内耳发育过程中研究机械力在生长控制中的作用11 , 在毛细胞中可能还有相同力的作用。再生。此外, 这种方法促进了病毒感染, 提供了一种改变感官上皮中基因表达的方法, 从而允许机械和分子操作结合在研究生长和再生的耳朵的感官器官11。
该方法的局限性与内耳胚胎发生过程中内源力和机械刺激的最小信息有关。内耳发育中组织刚度的测量不存在于我们的知识;因此很难估计胶原蛋白 i 凝胶的硬度与体内条件的对应。我们的观察和模型表明, 相对于囊生长的力最初是低的, 随着器官接近其最终大小的11。因此, 我们推测, 无软骨细胞的胶原 i 凝胶是一种生理上相关的基质, 用于培养胚胎前庭和听觉感官器官。
此处描述的三维区域性方法可诱导在 utricular 黄斑11中形成新的支持细胞, 同时在培养3天后还维持超过80% 的毛发细胞 (图 2)。因此, 该方法代表了囊二维文化的优越选择, 其中只有 40-50% 的毛细胞在文化5、8的前24小时后存活, 可用于研究毛细胞的脆弱性和再生体外。
虽然我们演示了在 Corti 的培养器官中, 解剖上有组织的内、外毛细胞的形成, 但需要更多的工作来确定这里描述的三维培养方法是否支持正常在会聚扩展过程中的耳蜗导管伸长率 (CE)23,24,25。CE 是一个高度动态的过程, 涉及细胞迁移、重排和细胞接触的变化26 , 可能会受到外部力量的影响, 由开发的耳蜗导管周围的组织产生。该方法保留相对正常的三维组织结构, 并有可能对 CE体外的研究有所裨益。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢贾格布博士、j. Salvi 博士和 Petelski 为本议定书所依据的原始研究所作的贡献。我们还感谢美洲骆驼和 w Makmura 提供技术援助和畜牧业。我们承认 NIDCD 培训补助金 T32 DC009975, NIDCD 赠款 R01DC015530, 罗伯逊治疗发展基金, 和家庭基金会的资金。最后, 我们承认霍华德休斯医学研究所的支持, Hudspeth 博士是一名调查员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
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