Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Tredimensjonale Organotypic kulturer av Vestibular og auditiv Sanseorganer

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57527

Summary

Tredimensjonale organotypic kulturer murine utricle og sneglehuset i optisk fjerner kollagen jeg gels bevare medfødte vev morfologi, tillater mekanisk stimulering gjennom justering av matrix stivhet, og tillater virus-mediert gen levering.

Abstract

Sensoriske organer i det indre øret er utfordrende for å studere i pattedyr på grunn av utilgjengelighet deres eksperimentelle manipulasjon og optisk observasjon. Videre, selv om eksisterende kultur teknikker tillater biokjemiske forstyrrelser, gir ikke disse metodene å studere virkningene av mekanisk kraft og vev stivhet under utviklingen av indre øret sensoriske organer. Her beskriver vi en metode for tredimensjonale organotypic kultur intakt murine utricle og sneglehuset som overvinner disse begrensningene. Teknikken for justering av en tredimensjonal matrix stivhet beskrevet her tillater manipulering av elastisk force motsatte vevvekst. Denne metoden kan derfor brukes til å studere rollen til mekaniske krefter under utviklingen av indre øret. I tillegg tillater kulturer virus-mediert gen levering, som kan brukes for gevinst og tap-av-funksjon eksperimenter. Denne kultur metoden bevarer medfødte hårcellene og støtte celler og fungerer som et potensielt bedre alternativ til tradisjonelle todimensjonal kultur vestibular og auditiv Sanseorganer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Studiet av de fleste aspekter av pattedyr orgel utvikling har blitt lettere ved in vitro -systemer. To viktigste metoder blir brukt til kultur vestibular Sanseorganer: frittflytende1 og tilhenger2 forberedelser. Begge metodene tillater etterforskningen av hår celle sikkerhetsproblemer3 og regeneration1,4 i vitro. I tillegg har utviklingsmessige rollene hakk5,6, Wnt7,8og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR)9,10 signalering kaskader i det indre øret opprettet en delvis gjennom bruk av i vitro kulturer av sensoriske epithelia. Imidlertid cellevekst og differensiering kontrolleres, ikke bare gjennom signalering av morphogens, men også gjennom fysisk og mekanisk signaler som intercellulære kontakter, stivhet av ekstracellulær matrix, og mekanisk strekkes eller innsnevring. Rollen av slike mekaniske stimuli er utfordrende å undersøke i utvikle indre øret i vivo. Videre er eksisterende frittflytende og tilhenger kultur metoder ikke egnet for slike studier i vitro. Her vi beskriver en metode for tredimensjonale organotypic kultur i kollagen jeg gels av varierende stivhet. Denne metoden hovedsakelig bevarer arkitektur i vivo vestibular og cochlear sensoriske organer og tillater undersøkelse av effekten av mekanisk kraft på vekst og differensiering11.

Fordi mekanisk stimuli er kjent for å aktivere nedstrøms molekylære hendelsene Hippo signalering veien12,13,14,15, er det viktig å kunne kombinere mekanisk stimulering med biokjemiske og genetiske manipulasjoner. Kultur metoden beskrevet her tillater virus-mediert gen levering og kan derfor brukes til å studere både mekanisk og molekylære signalering under indre øret utvikling11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av Animal Care og bruk komiteer av Rockefeller University og ved University of Southern California.

1. (valgfritt) utarbeidelse av kollagen jeg løsningen fra Mouse-tail sener

Merk: Kollagen jeg løsninger er tilgjengelige kommersielt. Følg produsentens instruksjoner for gel forberedelse.

  1. Euthanize 5-10 unge voksne (3-5 uker gamle) mus i vill type belastning med karbondioksid i samsvar med protokollen godkjent av de relevante institusjonelle Animal Care og bruk komiteen16. Samle haler og desinfisere dem av submerging i 70% etanol i minst 4 timer ved romtemperatur.
    Merk: Inkubasjonstiden for over 48 timer bør unngås, som det fører til overdreven vev dehydrering og hindrer sene utpakkingen.
  2. Fjern skinnet fra hver hale ved å innføre en langsgående kutt med skalpell blad og trekke hele huden med tang. Overføre flådd haler til et 100 mm Petriskål fylt med ren 70% etanol og skjær dem i 10 mm segmenter.
    Merk: Kast de tynneste delene av haler, som er vanskelig å manipulere.
  3. Ved hjelp av pinsett, sikre hvert segment av halen til bunnen av Petriskål og bruke et par fine tang trekke ut sener fra halen en om gangen. Individuelle sene fibrene bør komme med minimal motstand.
    Merk: Gamle, matte #5 tang fungerer bra for dette trinnet.
  4. Forberede 100 mL en 0,1% løsning (etter volum) av eddiksyre i sterile molekylær-grade vann og legge 10 mL løsningen til et sterilt 100 mm Petriskål. Overføre sener til Petriskål og la 1t ved romtemperatur å denature kollagen jeg.
  5. Bruk en steril skalpell eller iridectomy saks med Butt, buede tips for å hakke senen i 1-2 mm fragmenter. Overføre hakket sener til et sterilt 50 mL tube og legge 0,1% eddiksyre å bringe volumet til 50 mL.
    Merk: Bruke fire eller fem haler for hver 50 mL av syre å oppnå en kollagen jeg konsentrasjon av 2.0-2.5 mg/mL.
  6. Kjøle kollagen jeg løsning på 4 ° C i minst 48 timer å lette komplett protein rødsprit. Vortex med en tabletop spiral satt til maksimal hastighet for 1 min to ganger om dagen.
  7. Måle protein konsentrasjonen av løsningen ved å benytte bicinchoninic syre analysen, justere kollagen jeg konsentrasjon å 2.0-2.5 mg/mL ved å legge til 0,1% løsning av eddiksyre, og butikken på 4 ° C.
    Merk: Kollagen jeg løsning kan lagres i ett til to år.
  8. (Valgfritt) Sentrifuge kollagen jeg løsningen på 2000 x g 1t på 4 ° C og bruk gjennomsiktig topp brøken (omtrent halvparten av volumet), å oppnå optisk klart kollagen gels i punkt 4.

2. Disseksjon av Vestibular og auditiv organer

  1. Euthanize gravid mus i belastning med karbondioksid i samsvar med protokollen godkjent av de relevante institusjonelle Animal Care og bruk komiteen16. Ekstra og halshugge embryoene.
    Merk: Lfng-CreERT2/tdTomato mus kan brukes å tillate permanent merking støtter celler ved eksponering til 4-hydroxytamoxifen17.
  2. Sterilisere alle arbeider overflater og disseksjon instrumenter, inkludert to par #5 tang og en hår kniv18, ved å rense dem med 70% etanol.
  3. Dele hver leder i to halvdeler ved å innføre en langsgående kutt med sterilt skalpell blad eller to par #5 tang. Ekstra temporal bein, som inneholder de indre ører19, og plassere dem i 15 mL iskald Hanks balansert salt løsning (HBSS) i en Petriskål 60 mm. Holde rett på isen.
    Merk: Embryo på en rekke stadier fra E13.5 til E18.5 har blitt brukt med hell.
  4. (Valgfritt) Vaske de indre ører av forsiktig risting dem i et 50 mL konisk rør inneholder 30 mL iskalde HBSS og erstatte HBSS tre eller fire ganger. Holde røret på is.
    Merk: Dette trinnet begrenser mulig smitte av vev kultur og bringer raskt temperaturen til 4 ° C, noe som hindrer vev fornedrelse og celle død.
  5. Bruker to par fine #5 tang, separate indre ører fra temporal benet og overføre ørene, tre eller fire om gangen, i en 60 mm Petriskål fylt med iskald HBSS.
  6. Dissekere vestibular sensoriske organer.
    1. Orientere ører medial side opp og Finn utricle. Med to par #5 pinsett, fjerne brusken rundt vestibular organer. Forsiktig sever vestibular nerve, forbindelsen mellom utricle og saccule, og den halvsirkelformede kanalene, som vist i figur 1. Trekk forsiktig i utricle og de tilknyttede ampullae for overlegen og vannrette halvsirkelformede kanaler fra øret.
      Merk: Denne metoden kan brukes på indre ører stadier E16.5 - E18.5. Bevar brusk fragmenter avsnitt 3 nedenfor.
  7. Dissekere sneglehuset.
    1. Fjerne cartilaginous vevet rundt hørselsorganet med to par #5 tang. Forsiktig kutte forbindelsen mellom cochlea basen og saccule som vist i figur 1.
      Merk: For stadier E13.5 - E14.5, myke brusken før disseksjon ved å behandle indre ører med 0,25% collagenase jeg i fosfat-bufret (PBS) saltløsning i 5 minutter ved romtemperatur. Bevar brusk fragmenter avsnitt 3 nedenfor.
  8. Bruke en 200-µL Pipetter utstyrt med et bredt nonstick tips, overføre utricles og cochleae til en 30 mm Petriskål fylt med vekstmediet bestående av DMEM/F12 supplert med 33 mM Dglucose, 19 mM natriumbikarbonat, 15 mM 4(2hydroxyethyl)- 1piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 1 mM glutamin, 1 mM nikotinamid, 20 mg/L epidermal vekstfaktor, 20 mg/L fibroblast vekstfaktor, 10 mg/L insulin, 5,5 mg/L transferrin og 5 µg/L natrium selenitt.
  9. Opprettholde utricle forberedelsene til opptil 3 h på 37 ° C i en vev-kultur inkubator gasset med 5% karbondioksid tillate helbredelse av kutt i epitel introdusert under dissection. Sneglehuset forberedelser skal overføres til kollagen gel 10 min etter dissection.
    Merk: Fordi dissection utføres i iskalde HBSS, er det ikke nødvendig å forvarme vekstmediet til 37 ° C.

3. (valgfritt) justere kollagen jeg Gel stivhet ved å legge til ulike konsentrasjoner av Chondrocytes

Merk: Metoden chondrocyte isolering ble endret fra Gosset et al. 20

  1. Forberede en 1% løsning av collagenase I sterilt 1 x PBS og lagre 100-200 µL dele på-80 ° C. Tine på isen ved behov, unngå flere fryse-Tin sykluser.
  2. Bruk tang fin å samle biter av brusk fra Disseksjon av vestibular og auditiv organer fra 10-12 ører. Separat forbinde og indre øret vev fra brusk. Overføre brusken til en 30 mm Petriskål og legger 300 µL av sterile vekst medium.
  3. Bruk en steril skalpell bladet eller iridectomy saks sløv buet tips for å hakke vev for å oppnå brusk stykker ca 0,5 mm i lengde.
  4. Legge til collagenase jeg til medium med brusk å oppnå en siste enzym konsentrasjon av 0,25%. Overføre retten til et vev-kultur inkubator på 37 ° C gasset med 5% karbondioksid. Pipetter kraftig med en 1000 µL Pipetter hvert 20 min til deler av brusken dissociate og er ikke skilles i løsningen, deretter ruge for en ekstra 20 minutter.
    Merk: Ved utricle forberedelsene, kan chondrocyte isolasjon utføres under trinn 2.9; Det tar ca 2 timer (3-4 pipettering runder).
  5. Samle celle suspensjon i et 15 mL konisk rør og juster volumet til 10 mL med sterilt 1 x PBS. Sentrifuger 800 x g i 5 min på 4 ° C. Fjern nedbryting og resuspend cellene i 10 mL steril 1 x PBS. Sentrifuge 800 x g i 5 min på 4 ° C og fjerne nedbryting.
    Merk: Det er viktig å vaske cellene to ganger; eventuelle gjenværende collagenase vil jeg fordøye kollagen jeg gel.
  6. Bruker en 200-µL Pipetter, legge 100 µL av kultur medium til celle pellets og Pipetter forsiktig å resuspend. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og opprettholde dem på isen før bruk.
  7. For å øke gel stivhet, legge chondrocytes til men kollagen jeg gel løsning (del 1) og bland raskt distribuere cellene gjennom gel før størkning.
    Merk: Elastisk modulus av kollagen jeg gel (en viss stivhet), øker lineært med antall chondrocytes lagt11. Forholdet er beskrevet av eksperimentelt bestemt lineær funksjonen E = 206· NC + 15, der E er elastisk modulus i Pascal og Nc er antall chondrocytes i millioner. For en detaljert protokoll for gel henvises stivhet målinger til den opprinnelige artikkel11.

4. plass Vestibular eller auditiv sensoriske orgelet i en kollagen jeg Gel

  1. I en bakteriefri 1.5-mL tube, forberede kollagen jeg polymerisasjon løsning ved å blande 160 µL av 10 x PBS med fenol red pH indikator, 133 µL av 0.34 M natriumhydroksid, 70 µL av 0.9 M natriumbikarbonat og 40 µL av 1 M HEPES. Holde røret på is.
    Merk: Denne oppskriften gir polymerisasjon løsningen måtte forberede 2 mL av kollagen jeg gel, men kan skaleres etter behov.
  2. Mix 100 µL av polymerisasjon løsning og 400 µL av kollagen jeg løsningen på isen av pipettering forsiktig opp og ned i en kjølt 1.5-mL tube. For å øke gel stivhet, Legg 50 µL av vekstmediet som inneholder chondrocytes og bland forsiktig som beskrevet i kapittel 3.
  3. Overføre 500 µL av kollagen som men jeg løsning til en kjølt 30 mm Petriskål med en 10 mm glass bunn inn eller til et godt av en fire-plate.
    Merk: Det er avgjørende å holde alle reagenser på is å hindre rask og ujevn polymerisering av kollagen jeg.
  4. Raskt overføre cochleae eller utricles til men kollagen jeg løsning og justere organer til ønsket plassering med sterilt hår kniv18 eller par fine tang.
    Merk: Kollagen jeg polymerisasjon blir synlig etter 1-2 min som løsningen blir grumset.
  5. Når løsningen rundt vevet har polymerized, plass Petriskål eller fire plater for 20 min på 37 ° C i en vev-kultur inkubator gasset med 5% karbondioksid å sikre fullstendig polymerisasjon.
  6. Legg til 3 mL oppblomstringen medium med 0,5% fosterets bovin serum (FBS) per Petriskål eller 500 µL av samme medium per brønn av en fire-plate. Opprettholde kulturen på 37 ° C i en vev-kultur inkubator gasset med 5% karbondioksid. Eventuelt supplement vekstmediet med 10 µM 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) merke voksende celler.
    Merk: Høyere FBS konsentrasjoner kan brukes hvis ønskelig.

5. viral injeksjoner i tredimensjonale kulturer av Vestibular og auditiv Sanseorganer

  1. Defrost ønsket viruset på is og bland med trypan blå løsningen i en 0,5 mL konisk tube å oppnå en siste fargestoff konsentrasjon på 0,05%. Bruke 10-20 x fargestoff for å unngå betydelig fortynning av viruset. Hold på is.
    Merk: Adenovirus serotype 5 fungerer best for infisere støtte celler i utricle19, mens adeno-assosiert virus Anc80 kan infisere både hårcellene og støtte celler i utricle og sneglehuset21.
  2. Bryte spissen av en glass nål forberedt på en brønnene avtrekker med rene fine tang mens observere det i det høyeste forstørrelsesnivået av en kikkert dissekere mikroskop.
    Merk: Det er viktig å optimalisere innstillingene på nål puller. Sprøyter med 9 - 12 mm shanks og 20 - 30 µm åpninger fungerer best.
  3. Fjerne en sensorisk-orgel kultur fra inkubator. Knytte nålen til microinjector og fyll den med 2-3 µL av fargestoff og virus blanding. Forhånd nålen inn i sensoriske orgelet mens observere det under kikkerter dissekere mikroskop.
  4. Forsiktig kjøre pinne-spissen gjennom mesenchymal og epiteliale lag av taket av en tredimensjonal utricular kultur. Injisere viral blandingen til hulrom utricle og ampullae fylle med blått fargestoff.
    Merk: Fordi det gir enkel tilgang til Sanseorganer, er en 10 mm glass bunn Petriskål optimal for injeksjoner.
  5. Ruge på 37 ° C i en vev-kultur inkubator gasset med 5% karbondioksid.
    Merk: Når grønn eller rød fluorescerende protein brukes i viral Konstruer, er fluorescensen tilsynelatende 24 timer etter viral signaltransduksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vestibular og auditiv Sanseorganer fra embryonale ører, kultivert i 40-Pa kollagen jeg gels mimicking lav stivhet embryonale forhold11, beholde relativt normalt tredimensjonale strukturer (figur 1) og vedlikeholde hårcellene og støtter celler (figur 2 og Figur 3). Selv om støtte celle tettheten reduseres med over 30% (Student t -test: n = 4, p < 0.004) og hår celle tettheten reduseres med 60% (Student t -test: n = 5, p < 0,0001) etter 3 dager i utricular kulturer (figur 2 ), området makula mer enn fordobles i samme periode av tid11 (n = 3, p = 0.0002). Dette viser at metoden for tredimensjonale kultur beskrevet her gir mulighet for en betydelig økning i antall støtte celler11, mens 80% av eksisterende hår cellene i utricle over en 3 dagers periode. I tredimensjonale kulturer opprettet fra E14.5 cochlea, skille Sox2-positive progenitor celler som morphologically skjelnes rader av indre og ytre hårcellene etter 3 dager i kultur (Figur 3).

Genuttrykk kan manipuleres i tredimensjonale kulturer vestibular og auditiv sensoriske organfunksjon ved virusinfeksjon. 4hydroxytamoxifen legges til kultur medium å etikett støtte celler i cochlea explants etablert fra E15.5 embryo Lfng-CreER-T2/tdTomato mus17. Injeksjon av adenovirus skrive inn 5 i lumen av kultur resulterer i infeksjon støtter celler på orgelets base (Figur 4A). Injeksjon av samme viruset i lumen utricular kultur opprettet fra E17.5 embryo, resultatene i infeksjon støtter celler gjennom sensoriske epitel (Figur 4B).

Figure 1
Figur 1Skjemadiagrammer disseksjoner og lys-mikroskopiske bilder av representant kulturer av utricle og sneglehuset i tredimensjonale kollagen jeg gels. (A) A skjematisk tegning skildrer de sensoriske epithelia (grønn) av seks reseptor organer av murine indre øret. De røde linjene avgrense kutt introdusert under Disseksjon av en utricle og sneglehuset. (B) * lys bilder skildre E17.5 utricle (øvre panel) og E14.5 cochlea (nedre panel) innebygd i kollagen jeg gel og kultivert for 48 timer. Skala stolpene angir 100 µm. Dette tallet er endret fra Gnedeva et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2Hår cellene og støtte i tredimensjonale utricular kulturer. (A) Confocal-mikroskopiske bilder portrettere en E18.5 utricle før explantation (topp panel) og etter 3 dager i en tredimensjonal kultur i 40-Pa kollagen jeg gel (bunnen panel). Hårcellene er merket for Myo7A (grønn) og støtter celler for Sox2 (rød). Baren skala representerer 50 µm. (B) Quantifications støtter cellen tettheter (røde barer), hair celle tettheter (grønne barer) og macula områder (grå barer) i E18.5 utricles før explantation, og etter 3 dager i tredimensjonale orgel kultur representert som betyr ± søkemotormarkedsførere (p < 0,001 representeres ** og p < 0.0001 som ***). Dette tallet har blitt endret fra Gnedeva et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3Hår cellene og støtte i tredimensjonale cochlea kulturer. AC confocal-mikroskopiske bilder portrettere et E14.5 cochlea før explantation (topp panel) og etter 3 dager i en tredimensjonal kultur i 40-Pa kollagen jeg gel (bunnen panel). Myo7A - og Sox2-positiv indre hårcellene (IHC) og ytre hårcellene (OHC) vises i 4-5 rader etter 3 dager i kultur. Støtte celler er også merket for Sox2 (rød). Baren skala representerer 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4Representant resultatene av viral infeksjoner i tredimensjonale orgel kulturer i cochlea og utricle. (A) injeksjon av adenovirus serotype 5 i tredimensjonale cochlea kulturer opprettet fra Lfng-CreER-T2/tdTomato26 E15.5 embryo resultater i infeksjon (GFP, grønn) støtter celler (tomat, rød) ved foten av orgelet. Sensorisk epitel er avgrenset i grått. Baren skala representerer 100 µm. (B) en identisk injeksjon i en tredimensjonal utricular kultur opprettet fra et E17.5 embryo resulterer i infeksjon (GFP, grønn) støtter celler (Sox2, rød) hele orgel. Sensorisk epitel er avgrenset i grått. Baren skala representerer 100 µm. Dette tallet har blitt endret fra Gnedeva et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Molekylær signaler som megle vekst og differensiering i det indre øret under utvikling har vært studert5,,6,,7,,8,,9,,10. Bevis fra utricular modell systemet antyder imidlertid at mekanisk signaler, følt gjennom cellen veikryss og aktivering av Hippo signalnettverk, også spille en viktig rolle i disse prosessene2,11, 22. videre både utelukkelse av døende hårcellene fra sensoriske epitel og påfølgende dannelsen av nye sensoriske reseptorene gjennom transdifferentiation kan påvirke mekanisk kraft kjente av den gjenværende støtte celler, forårsaker dem skriver inn i cellen syklus under regenerasjon. Tredimensjonale kultur-systemet som er beskrevet her er en eksperimentell gransker både rollen mekanisk kraft vekst kontroll under indre øret utvikling11 og mulig rolle samme kraft under hair celle regenerering. Videre tilnærming muliggjør virusinfeksjon som gir en metode for å endre genuttrykk i Sensorisk epitel, og tillater en kombinasjon av mekanisk og molekylære manipulasjoner undersøkelse for vekst og fornyelse i de øret Sanseorganer11.

Begrensningene for metoden gjelder minimal tilgjengelig informasjon på endogene styrker og mekanisk stimuli under indre øret embryogenesis. Målinger av vev stivhet i utvikle indre øret eksisterer ikke vet; Derfor er det vanskelig å anslå hva stivhet av kollagen jeg gel tilsvarer i vivo forhold. Våre observasjoner og modellen foreslår at force motsatte veksten av utricle er lav først og øker som orgelet nærmer seg sin endelige størrelse11. Vi har derfor hypothesize at en kollagen jeg gel uten chondrocytes er en fysiologisk relevante substrat å kultur embryonale vestibular og auditiv Sanseorganer.

Tredimensjonale kultur metoden beskrevet her induserer dannelsen av nye støtte celler i utricular macula11, samtidig opprettholde over 80% av hårcellene etter 3 dager i kultur (figur 2). Metoden, derfor representerer et godt alternativ til todimensjonal kulturer av utricle, i som bare 40-50% av hårcellene overleve etter første 24 h i kultur5,8, og kan brukes til å studere hår celle sikkerhetsproblemer og gjenfødelse i vitro.

Selv om vi viser dannelsen av anatomisk skjelnes organisert rader av indre og ytre hårcellene i kulturperler organ av Corti, er mer arbeid nødvendig for å avgjøre om den tredimensjonale kultur metoden beskrevet her støtter normal cochlea duct forlengelse under prosessen konvergent forlengelsen (CE)23,24,25. CE er en svært dynamisk prosess som involverer celle migrasjon, omorganisering og celle-celle endres26 som sannsynligvis vil påvirkes av eksterne kraft produsert av vev rundt utvikle cochlea røret. Denne metoden tar vare på relativt normalt tredimensjonale vev arkitektur, og kan potensielt være fordelaktig for studiet av CE i vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi og A. Petelski for deres bidrag til den opprinnelige forskningen som er basert på denne protokollen. Vi takker også J. lamaer og W. Makmura for kundestøtte og husdyrhold. Vi erkjenner NIDCD trening grant T32 DC009975, NIDCD gi R01DC015530 Robertson terapeutiske Development Fund og Caruso familien grunnlaget for finansiering. Til slutt, vi erkjenner støtte fra Howard Hughes Medical Institute, som Dr. Hudspeth er en etterforsker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#10 Surgical Blades Miltex 4-110
#5 Forceps Dumont 11252-20
100 mm Petri dish Sigma P5856-500EA
250 uL large orifice pipette tips USA Scientific 1011-8406
30 mm glass-bottom Petri dish Matsunami Glass USA Corporation D35-14-1.5-U
4 well plate Thermo Fisher Scientific 176740
4-Hydroxytamoxifen  Sigma H7904
60 mm Petri dish Thermo Fisher Scientific 123TS1
Acetic acid  Sigma 537020
Ad-GFP Vector Biolabs 1060
Anti-GFP, chicken IgY fraction Invitrogen A10262 
Anti-Myo7A Proteus Biosciences 25-6790
Anti-Sox2 Antibody (Y-17) Santa Cruz sc-17320
Bicinchoninic acid assay Thermo Fisher Scientific 23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10340
Collagenase I Gibco 17100017
D-glucose Sigma G8270
DMEM/F12  Gibco 11320033
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 16140063
Fibroblast growth factor Sigma F5392
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
Glutamine Sigma G8540
HBSS Gibco 14025092
Hemocytometer  Daigger EF16034F
HEPES Sigma H4034
Insulin Sigma I3536
Iridectomy scissors  Zepf Medical Instruments 08-1201-10  
Microinjector Narishige IM-6
Nicotinamide Sigma N0636
PBS (10X), pH 7.4 Gibco 70011044
PBS (1X), pH 7.4 Gibco 10010023
Phenol Red pH indicator  Sigma P4633 
Pure Ethanol, 200 Proof Decon Labs  2716
RFP antibody ChromoTek  5F8
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium hydroxide Sigma S8045
Sodium selenite Sigma S5261
Tabletop vortex  VWR 97043-562
Transferrin Sigma T8158
Trypan blue  Sigma T6146

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70, (1), 85-108 (1993).
  2. Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27, (16), 4313-4325 (2007).
  3. Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091, (1), 277-281 (2006).
  4. Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259, (5101), 1619-1622 (1993).
  5. Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31, (43), 15329-15339 (2011).
  6. Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
  7. Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (21), 8167-8172 (2012).
  8. Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
  9. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272, (2), 432-447 (2004).
  10. White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363, (1), 191-200 (2012).
  11. Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
  12. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154, (5), 1047-1059 (2013).
  13. Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130, (6), 1120-1133 (2007).
  14. Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588, (16), 2663-2670 (2014).
  15. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21, (21), 2747-2761 (2007).
  16. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. (2013).
  17. Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
  18. Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. Humana Press. Totowa, N.J. 137 (2000).
  19. Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
  20. Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3, (8), 1253-1260 (2008).
  21. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35, (3), 280-284 (2017).
  22. Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511, (3), 396-414 (2008).
  23. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37, (9), 980-985 (2005).
  24. Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139, (5), 968-978 (2012).
  25. Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136, (12), 1977-1986 (2009).
  26. Tada, M., Heisenberg, C. -P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139, (21), 3897-3904 (2012).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gnedeva, K., Hudspeth, A. J., Segil, N. Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs. J. Vis. Exp. (136), e57527, doi:10.3791/57527 (2018).More

Gnedeva, K., Hudspeth, A. J., Segil, N. Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs. J. Vis. Exp. (136), e57527, doi:10.3791/57527 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter