Summary
Colture organotipiche tridimensionale dell'utricolo murino e coclea in otticamente deselezionare collagene gel morfologia del tessuto innata di riserva, consentono per stimolazione meccanica attraverso la regolazione della rigidità di matrice e consentono il recapito della virus-mediata del gene.
Abstract
Gli organi sensoriali dell'orecchio interno sono difficili da studiare nei mammiferi a causa della loro inaccessibilità di manipolazione sperimentale e osservazione ottica. Inoltre, anche se le tecniche di cultura esistenti consentano perturbazioni biochimiche, questi metodi non forniscono un mezzo per studiare gli effetti della forza meccanica e rigidità dei tessuti durante lo sviluppo degli organi sensoriali dell'orecchio interno. Qui descriviamo un metodo per coltura organotypic tridimensionale dell'utricolo murino intatto e coclea che supera queste limitazioni. La tecnica per la regolazione di una rigidità di matrice tridimensionale qui descritto consente la manipolazione della forza elastica opposte la crescita del tessuto. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per studiare il ruolo delle forze meccaniche durante lo sviluppo dell'orecchio interno. Inoltre, le culture consentono il recapito della virus-mediata del gene, che può essere utilizzato per esperimenti di guadagno e perdita di funzione. Questo metodo di cultura conserva le cellule ciliate innate e sostenere le cellule e serve come alternativa potenzialmente superiore alla tradizionale cultura bidimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari.
Introduction
Lo studio della maggior parte degli aspetti dello sviluppo dei mammiferi dell'organo è stato facilitato dai sistemi in vitro . Due metodi principali sono ora utilizzati per la coltura di organi sensoriali vestibolari: digalleggiante1 e aderente2 preparazioni. Entrambi i metodi consentono l'indagine della cellula ciliata vulnerabilità3 e rigenerazione1,4 in vitro. Inoltre, hanno i ruoli inerenti allo sviluppo della tacca5,6, Wnt7,8e fattore di crescita epidermico del recettore (EGFR)9,10 segnalazione cascades nell'orecchio interno stata stabilita, in parte, attraverso l'uso di colture in vitro di epiteli sensoriali. Tuttavia, la differenziazione e la crescita delle cellule sono controllati, non solo attraverso la segnalazione di morfogeni, ma anche attraverso segnali fisici e meccanici, ad esempio Contatti intercellulari, la rigidità della matrice extracellulare e stretching meccanico o costrizione. Il ruolo di tali stimoli meccanici è difficile da indagare nel orecchio interno in via di sviluppo in vivo. Inoltre, metodi esistenti di cultura digalleggiante ed aderente non sono adatti per questo tipo di studi in vitro. Qui descriviamo un metodo per coltura organotypic tridimensionale in collagene gel di rigidità variabile. Questo metodo in gran parte conserva l'architettura in vivo degli organi sensoriali cocleari e vestibolari e consente l'indagine sugli effetti della forza meccanica su crescita e differenziazione11.
Perché stimoli meccanici sono conosciuti per attivare eventi molecolari a valle, come l'ippopotamo signaling pathway12,13,14,15, è importante essere in grado di coniugare lo stimolo meccanico con manipolazioni genetiche e biochimiche. Il metodo di cultura qui descritto consente la consegna virus-mediata del gene e pertanto può essere utilizzato per studiare sia meccaniche che molecolare segnalazione durante lo sviluppo di orecchio interno11.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso comitati della Rockefeller University e della University of Southern California.
1. (opzionale) preparazione di collagene soluzione da tendini di vista
Nota: Collagene sono soluzioni sono disponibili in commercio. Seguire le istruzioni del produttore per la preparazione del gel.
- Eutanasia: 5-10 topi di giovane adulto (3-5 settimane) di qualsiasi ceppo di tipo selvaggio con anidride carbonica in conformità del protocollo approvato dai pertinenti istituzionale Animal Care e uso Comitato16. Raccogliere le code e disinfettarle immergendo in etanolo al 70% per un minimo di 4 ore a temperatura ambiente.
Nota: Incubazione per oltre 48 h dovrebbe essere evitato, in quanto provoca disidratazione del tessuto in eccesso e ostacola il processo di estrazione del tendine. - Togliere la pelle da ogni coda introducendo un taglio longitudinale con un bisturi e ritraendo tutta la pelle con il forcipe. Trasferire le code dalla pelle in una capsula Petri 100 mm riempito con etanolo al 70% pulito e tagliarli in segmenti di 10 mm.
Nota: Gettare le parti più sottili delle code, che sono difficili da manipolare. - Usando il forcipe, fissare ogni segmento della coda fino in fondo la capsula di Petri e utilizzare un secondo paio di una pinzetta per estrarre i tendini dalla coda uno alla volta. Fibre tendinee individuali dovrebbero emergere con una resistenza minima.
Nota: Vecchio, noioso forcipe #5 funzionano bene per questo passaggio. - Preparare 100 mL di soluzione di acido acetico in acqua sterile di grado molecolare 0,1% (in volume) e aggiungere 10 mL della soluzione a una capsula di Petri sterile 100 mm. Trasferire i tendini per la capsula di Petri e lasciare per 1 h a temperatura ambiente per denaturare il collagene I.
- Utilizzare un paio di forbici bisturi o iridectomy sterile con punte smussate, curve per tritare il tendine in frammenti di 1-2 mm. Trasferire i tendini macinati in una provetta sterile da 50 mL e aggiungere acido acetico 0,1% per portare il volume a 50 mL.
Nota: Utilizzare quattro o cinque con code per ogni 50 mL di acido di raggiungere un collagene concentrazione di 2.0-2.5 mg/mL. - Refrigerare il collagene soluzione a 4 ° C per un minimo di 48 h per facilitare la denaturazione di proteine complete. Vortice Vortex da tavolo impostato alla massima velocità per 1 minuto due volte al giorno.
- Misurare la concentrazione di proteina della soluzione usando il dosaggio di acido bicinconinico, regolare il collagene ho concentrazione a 2.0-2.5 mg/mL aggiungendo 0,1% soluzione di acido acetico e archivio a 4 ° C.
Nota: Collagene soluzione può essere conservata per uno o due anni. - (Opzionale) Centrifugare il collagene soluzione a 2.000 x g per 1 h a 4 ° C e uso la frazione superiore traslucida (circa la metà del volume), per raggiungere otticamente chiaro collagene gel nella sezione 4.
2. dissezione degli organi vestibolari e uditivi
- Eutanasia topi incinti di qualsiasi ceppo con anidride carbonica in conformità del protocollo approvato dai pertinenti istituzionale Animal Care e uso Comitato16. Estrarre e decapitare gli embrioni.
Nota: LFNG-CreERT2/tdTomato topi possono essere utilizzati per consentire l'etichettatura permanente di sostegno le cellule su esposizione a 4-hydroxytamoxifen17. - Sterilizzare tutte le superfici di lavoro e strumenti per la dissezione, tra cui due paia di pinze #5 e un coltello di capelli18, di pulirli con etanolo al 70%.
- Dividere ogni testa in due metà con l'introduzione di un taglio longitudinale con un bisturi sterile o utilizzando due paia di pinze #5. Estrarre le ossa temporali, che contengono le orecchie interne19e inserirli in 15 mL di soluzione salina bilanciata di Hank ghiacciata (HBSS) in una capsula di Petri 60mm. Tenere il piatto sul ghiaccio.
Nota: Embrioni in una gamma di livelli da E13.5 a E18.5 sono stati utilizzati con successo. - (Opzionale) Lavare le orecchie interne agitando delicatamente in una provetta conica da 50 mL contenente 30 mL HBSS ghiacciata e sostituendo l'HBSS tre o quattro volte. Tenere il tubo sul ghiaccio.
Nota: Questo passaggio limita la possibile contaminazione della coltura del tessuto e porta rapidamente la temperatura a 4 ° C, che impedisce la morte delle cellule e di degradazione del tessuto. - Utilizzando due coppie di una pinzetta #5, separare le orecchie interne dall'osso temporale e trasferire le orecchie, tre o quattro alla volta, in una capsula di Petri 60 mm riempito con HBSS ghiacciata.
- Sezionare gli organi sensoriali vestibolari.
- Orientare il lato mediale di orecchie fino e individuare il utricle. Con due paia di pinze #5, rimuovere la cartilagine che circonda gli organi vestibolari. Delicatamente recidere il nervo vestibolare, la connessione tra l'utricolo e sacculo, canali semicircolari, come mostrato nella Figura 1. Tirare delicatamente il utricle e l'annesso Ampolle dei canali semicircolari superiori e orizzontali dall'orecchio.
Nota: Questo metodo può essere utilizzato su orecchie interne delle fasi E16.5 - E18.5. Conservare i frammenti di cartilagine per sezione 3 riportata di seguito.
- Orientare il lato mediale di orecchie fino e individuare il utricle. Con due paia di pinze #5, rimuovere la cartilagine che circonda gli organi vestibolari. Delicatamente recidere il nervo vestibolare, la connessione tra l'utricolo e sacculo, canali semicircolari, come mostrato nella Figura 1. Tirare delicatamente il utricle e l'annesso Ampolle dei canali semicircolari superiori e orizzontali dall'orecchio.
- Sezionare la coclea.
- Rimuovere il tessuto cartilaginoso che circonda l'organo dell'udito con due paia di pinze #5. Come mostrato nella Figura 1, delicatamente di interrompere la connessione tra la base coclea e il saccule.
Nota: Per fasi E13.5 - e 14.5, ammorbidiscono la cartilagine prima della dissezione trattando l'interno orecchie con 0,25% collagenosi in soluzione tampone fosfato salino (PBS) per 5 min a temperatura ambiente. Conservare i frammenti di cartilagine per sezione 3 riportata di seguito.
- Rimuovere il tessuto cartilaginoso che circonda l'organo dell'udito con due paia di pinze #5. Come mostrato nella Figura 1, delicatamente di interrompere la connessione tra la base coclea e il saccule.
- Utilizzando una pipetta da 200-µ l munito di una punta larga antiaderente, trasferire la utricles e coclee ad una capsula di Petri 30 mm riempito con terreno di coltura costituito da DMEM/F12 completati con 33 mM DGlucosio, bicarbonato di sodio di 19 mM, 15 mM 4(2hydroxyethyl)- 1piperazineethanesulfonic acido (HEPES), glutamina di 1 mM, 1mm nicotinammide, 20 mg/L fattore di crescita epidermico, fattore di crescita dei fibroblasti di 20 mg/L, 10 mg/L insulina, transferrina 5,5 mg/L e selenito di sodio 5 µ g/L.
- Mantenere i preparativi utricolo per fino a 3 h a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica per permettere la guarigione dei tagli nell'epitelio introdotto durante la dissezione. Preparazioni di coclea devono essere trasferiti direttamente sul gel di collagene 10 min dopo la dissezione.
Nota: Poiché la dissezione viene eseguita in HBSS ghiacciata, non c'è nessuna necessità di pre-riscaldare il mezzo di crescita a 37 ° C.
3. (facoltativo) regolare collagene mi Gel rigidità con l'aggiunta di concentrazioni variabili di condrociti
Nota: Il metodo per l'isolamento dei condrociti è stato modificato da Gosset et al. 20
- Preparare una soluzione di 1% di collagenasi I a sterile 1X PBS e archivio aliquote di 100-200 µ l a-80 ° C. Scongelare il ghiaccio quando necessario, evitando più cicli di gelo-disgelo.
- Utilizzare una pinzetta per raccogliere i pezzi di cartilagine lasciati dalla dissezione dell'apparato uditivo e vestibolare dalle orecchie di 10-12. Tessuti connettivi e orecchio interno separati dalla cartilagine. Trasferire la cartilagine a una capsula di Petri 30mm e aggiungere 300 µ l di terreno di coltura sterile.
- Usare le forbici di lama o iridectomy un bisturi sterile con punte curve smussate per tritare il tessuto per realizzare pezzi di cartilagine circa 0,5 mm di lunghezza.
- Aggiungere collagenosi io al medium con cartilagine per ottenere una concentrazione di enzima finale dello 0,25%. Trasferire il piatto in un'incubatrice di tessuto-coltura a 37 ° C, gasati con 5% di anidride carbonica. Pipettare vigorosamente utilizzando una pipetta da 1.000 µ l ogni 20 min fino a pezzi di cartilagine dissociano e non sono più distinguibili nella soluzione, quindi incubare per altri 20 minuti.
Nota: In caso di preparazioni il utricle, condrociti isolamento può essere eseguita durante passaggio 2,9; si impiegano circa 2 ore (3-4 giri di pipettaggio). - Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e regolare il volume a 10 mL con PBS 1X sterile. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 10 mL di PBS 1X sterile. Centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
Nota: È fondamentale per lavare le cellule due volte; qualsiasi collagenosi rimanente saranno a digerire il collagene che mi gel. - Utilizzando una pipetta da 200-µ l, aggiungere 100 µ l di terreno di coltura per il pellet cellulare e pipettare delicatamente per risospendere. Contare le celle utilizzando un emocitometro e mantenerli il priore di ghiaccio da utilizzare.
- Per aumentare la rigidità del gel, aggiungere condrociti al collagene neutralizzato I gel soluzione (sezione 1) e mescolare velocemente per distribuire le cellule in tutto il gel prima della solidificazione.
Nota: Il modulo elastico del collagene mi gel (una misura della rigidità), aumenta linearmente con il numero dei chondrocytes aggiunto11. La relazione è descritta dalla funzione lineare determinata sperimentalmente E = 206· NC + 15, in cui E è il modulo elastico in Pascal e Nc è il numero di condrociti in milioni. Per un protocollo dettagliato per gel misure di rigidezza consultare l'originale articolo11.
4. Posizionare l'organo sensoriale uditiva o vestibolare in un collagene che mi Gel
- In una provetta sterile di 1,5 mL, preparare collagene sono soluzione di polimerizzazione mescolando 160 µ l di PBS 1x 10 con indicatore di pH rosso fenolo, 133 µ l di idrossido di sodio M 0,34, 70 µ l di bicarbonato di sodio 0,9 M e 40 µ l di 1 M HEPES. Tenere il tubo sul ghiaccio.
Nota: Questa ricetta fornisce la soluzione di polimerizzazione dovuta preparare 2 mL di collagene gel, ma possono essere scalato in base alle esigenze. - Mix 100 µ l di soluzione di polimerizzazione e 400 µ l di collagene soluzione su ghiaccio pipettando delicatamente su e giù in una provetta da 1,5 mL refrigerata. Per aumentare la rigidità del gel, aggiungere 50 µ l di terreno di coltura contenente condrociti e mescolare delicatamente, come descritto nella sezione 3.
- Trasferire 500 µ l del collagene neutralizzato ho soluzione in una capsula di Petri 30mm refrigerati con un inserto di 10 mm con fondo di vetro o in un pozzetto di una piastra a 4 pozzetti.
Nota: È fondamentale per conservare tutti i reagenti sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione rapida e irregolare del collagene I. - Trasferire rapidamente le coclee o utricles al collagene neutralizzato ho soluzione e regolare gli organi alle loro posizioni desiderati con una coppia di una pinzetta o sterile capelli coltello18 .
Nota: Collagene polimerizzazione diventa evidente dopo 1-2 min come la soluzione diventa torbida. - Dopo la soluzione intorno al tessuto ha polimerizzato, inserire la capsula di Petri o quattro pozzetti per 20 min a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica per garantire la completa polimerizzazione.
- Aggiungere 3 mL di medium di crescita supplementato con 0.5% siero bovino fetale (FBS) per ogni scatola di Petri o 500 µ l dello stesso mezzo per pozzetto di una piastra a 4 pozzetti. Mantenere la coltura a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica. Se lo si desidera, è possibile integrare il medium di crescita con 10 µM 5-Etinil-2-deoxyuridine (EdU) per marcare le cellule proliferanti.
Nota: Più alte concentrazioni di FBS possono essere utilizzate se lo si desidera.
5. virale iniezioni nelle culture tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari
- Sbrinare il virus desiderato sul ghiaccio e mescolare con soluzione di trypan blu in una provetta conica da 0,5 mL per ottenere una concentrazione di tintura finale dello 0,05%. Utilizzare tintura x 10-20 per evitare sostanziale diluizione del virus. Tenere il ghiaccio.
Nota: L'adenovirus sierotipo 5 opere migliori per infettare cellule di supporto nell'utricolo19, considerando che virus adeno-associato Anc80 può infettare sia cellule ciliate e cellule di supporto il utricle e la coclea21. - Rompere la punta di un ago di vetro preparato su un estrattore micropipetta con forcipe fine pulito mentre osservando al massimo ingrandimento di un microscopio per dissezione di binocolo.
Nota: È importante ottimizzare le impostazioni sulla levetta di regolazione dell'ago. Aghi con 9 - 12mm ancore e 20 - 30 µm aperture funzionano meglio. - Rimuovere una cultura di organo sensoriale dall'incubatrice. Inserire l'ago per il microinjector e riempirlo con 2-3 µ l di miscela colorante e virus. Fare avanzare l'ago nell'organo sensoriale, mentre l'osservazione sotto il microscopio per dissezione di binocolo.
- Guidare delicatamente la punta dell'ago attraverso gli strati epiteliali e mesenchimali del tetto di una cultura utricular tridimensionale. Iniettare la miscela virale fino a riempire la cavità del utricle e ampolle con il colorante blu.
Nota: Perché permette un facile accesso agli organi sensoriali, una capsula di Petri con fondo di vetro 10 mm è ottimale per le iniezioni. - Incubare a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica.
Nota: Quando la proteina fluorescente verde o rossa viene utilizzata il costrutto virale, la fluorescenza è apparente 24 h dopo la trasduzione virale.
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Representative Results
Organi sensoriali uditivi e vestibolari dalle orecchie embrionale, coltivate in 40-Pa collagene I gel che imita bassa rigidità condizioni embrionali11, mantenere relativamente normali strutture tridimensionali (Figura 1) e mantenere le cellule ciliate e sostenere le cellule (Figura 2 e Figura 3). Anche se sostenere la densità delle cellule diminuisce di oltre il 30% (test tdi Student: n = 4, p < 0,004) e densità delle cellule dei capelli diminuisce del 60% (test tdi Student: n = 5, p < 0,0001) dopo 3 giorni a utricular culture (Figura 2 ), l'area della macula più che doppio rispetto allo stesso periodo di tempo11 (n = 3, p = 0,0002). Questo dimostra che il metodo per cultura tridimensionale qui descritto consente un significativo aumento del numero di sostegno cellule11, pur mantenendo l'80% delle cellule ciliate esistente nel utricle su un periodo di 3 giorni. Nelle culture tridimensionale stabilite dalla coclea e 14.5, cellule progenitrici Sox2-positive differenziano come morfologicamente distinguibili righe delle cellule ciliate interne ed esterne dopo 3 giorni nella cultura (Figura 3).
Espressione genica possa essere manipolato in culture tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari per mezzo di infezione virale. 4hydroxytamoxifen è aggiunto al terreno di coltura per etichetta cellule di supporto nei cocleare espianti stabiliti dagli embrioni E15.5 di Lfng-CreERT2/tdTomato topi17. Iniezione di tipo dell'adenovirus 5 nel lumen dei risultati della cultura nell'infezione di supportare le cellule alla base dell'organo (Figura 4A). Iniezione del virus stesso nel lumen della cultura utricular stabilito da E17.5 embrione, risultati principalmente nell'infezione di supportare le cellule in tutto l'epitelio sensoriale (Figura 4B).
Figura 1. Diagrammi schematici di dissezioni e fotomicroscopico immagini delle culture rappresentative dell'utricolo e coclea in collagene tridimensionale gel. Disegno schematico (A) A ritrae gli epiteli sensoriali (verdi) di sei organi recettori dell'orecchio interno murino. Le linee rosse delineano i tagli apportati durante la dissezione di un utricle e coclea. (B) microscopia immagini che ritraggono il utricle E17.5 (pannello superiore) e la coclea e 14.5 (pannello inferiore) incorporato nel collagene I gel e coltivate per 48 h. Le barre di scala rappresentano 100 µm. Questa figura è stata modificata da Gnedeva et al. 11 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Cellule ciliate e cellule di supporto in tridimensionale culture utricular. (A) al microscopio confocale immagini che ritraggono un utricle E18.5 prima dell'espianto (pannello superiore) e dopo 3 giorni in una cultura tridimensionale in collagene 40-Pa mi gel (pannello inferiore). Le cellule ciliate sono etichettate per Myo7A (verde) e supporto di cellule per Sox2 (rosso). La barra della scala rappresenta 50 µm. (B) quantificazioni di sostenere la densità delle cellule (barre rosse), densità della cellula ciliata (barre verdi) e zone maculare (barre grigie) in E18.5 utricles prima dell'espianto e dopo 3 giorni nella coltura di organo tridimensionale sono rappresentato come mezzi ± SEMs (p < 0,001 è rappresentato come * * e p < 0,0001 come * * *). Questa figura è stata modificata da Gnedeva et al. 11 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Cellule ciliate e cellule di supporto nelle culture cocleare tridimensionale. Immagini al microscopio confocale raffigurano una coclea e 14.5 prima dell'espianto (pannello superiore) e dopo 3 giorni in una cultura tridimensionale in collagene 40-Pa mi gel (pannello inferiore). Sox2-positive e Myo7A - cellule ciliate interne (IHC) e le cellule ciliate esterne (OHC) appaiono in 4-5 righe dopo 3 giorni nella cultura. Cellule di supporto sono inoltre classificate per Sox2 (rosse). La barra della scala rappresenta 25 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. Risultati rappresentativi delle infezioni virali in colture d'organo tridimensionale della coclea e del utricle. (A) iniezione di sierotipo adenovirus 5 in culture cocleare tridimensionale stabilita dai risultati di Lfng-CreERT2/tdTomato26 E15.5 embrioni nell'infezione (GFP, verde) di cellule (pomodoro, rosso) alla base dell'organo di supporto. L'epitelio sensoriale è delineato in grigio. La barra della scala rappresenta 100 µm. (B) un'iniezione identica in una cultura utricular tridimensionale stabilito da un embrione E17.5 provoca infezione (GFP, verde) di supportare celle (Sox2, rosso) in tutto l'organo. L'epitelio sensoriale è delineato in grigio. La barra della scala rappresenta 100 µm. Questa figura è stata modificata da Gnedeva et al. 11 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I segnali molecolari che mediano crescita e differenziazione dell'orecchio interno durante lo sviluppo sono stati studiati estesamente5,6,7,8,9,10. Tuttavia, le prove ottenute dal sistema utricular modello suggeriscono che meccanici spunti, percepiti attraverso giunzioni delle cellule e l'attivazione di segnalazione Hippo, anche giocare un ruolo importante in questi processi2,11, 22. Inoltre, sia l'estrusione delle cellule ciliate morente dall'epitelio sensoriale e la successiva formazione di nuovi recettori sensoriali attraverso transdifferenziazione possono influenzare la forza meccanica percepita dal residuo cellule, causando loro di supporto per immettere nuovamente il ciclo cellulare durante la rigenerazione. Il sistema tridimensionale cultura descritto qui fornisce un mezzo sperimentale di investigare il ruolo della forza meccanica nel controllo della crescita durante lo sviluppo di orecchio interno11 e, potenzialmente, il ruolo della stessa forza durante la cellula ciliata rigenerazione. Inoltre, l'approccio facilita l'infezione virale che fornisce un metodo di alterare l'espressione genica nell'epitelio sensoriale, permettendo così una combinazione di manipolazioni meccaniche e molecolari per l'indagine di crescita e di rigenerazione nella di organi sensoriali dell'orecchio11.
Le limitazioni del metodo riguardano le informazioni minime disponibili sulle forze endogene e stimoli meccanici durante l'embriogenesi dell'orecchio interno. Non esistono misure di rigidità dei tessuti dell'orecchio interno in via di sviluppo a nostra conoscenza; quindi è difficile stimare quali rigidità del collagene mi gel corrisponde a condizioni in vivo . Le nostre osservazioni e il modello suggeriscono che la forza avversaria crescita del utricle inizialmente è bassa e aumenta man mano che l'organo si avvicina la sua dimensione finale11. Quindi, supponiamo che un collagene che mi gel senza condrociti è un substrato fisiologicamente rilevante in cui alla cultura embrionali organi sensoriali uditivi e vestibolari.
Il metodo di coltura tridimensionale qui descritto induce la formazione di nuove cellule di supporto nel macula utricular11, mantenendo anche oltre l'80% delle cellule ciliate dopo 3 giorni nella cultura (Figura 2). Il metodo, pertanto, rappresenta un'alternativa superiore alle culture bidimensionale del utricle, in cui solo 40-50% delle cellule ciliate sopravvivere dopo le prime 24 ore cultura5,8e può essere usato per studiare le vulnerabilità delle cellule cigliate e rigenerazione in vitro.
Anche se dimostriamo la formazione di righe anatomicamente distinguibili organizzate delle cellule ciliate interne ed esterne nell'organo del Corti coltivata, è necessario determinare se il metodo di coltura tridimensionale qui descritto supporta normale più lavoro allungamento del condotto cocleare durante il processo di convergenza ed estensione (CE)23,24,25. CE è un processo altamente dinamico che coinvolge cella migrazione, riorganizzazione e cellulare contatto modifiche26 che rischia di essere influenzato dalla forza esterna prodotta dai tessuti che circondano il dotto cocleare in via di sviluppo. Questo metodo conservare tessuto tridimensionale relativamente normale architettura e potenzialmente potrebbe essere utile per lo studio della CE in vitro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il dottor A. Jacobo, Dr. J. Salvi e r. Petelski per i loro contributi alla ricerca originale su cui si basa questo protocollo. Ringraziamo anche i lama J. e W. Makmura per assistenza tecnica e la zootecnia. Riconosciamo la sovvenzione NIDCD formazione DC009975 T32, NIDCD concedere R01DC015530, fondo di sviluppo terapeutico Robertson e il fondamento della famiglia Caruso per il finanziamento. Infine, riconosciamo supporto da Howard Hughes Medical Institute, di cui il Dr. Hudspeth è un investigatore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
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- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
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