Summary
الثقافات أورجانوتيبيك ثلاثي الأبعاد مورين utricle والقوقعة في مسح الكولاجين أنا الهلام مورفولوجيا الأنسجة الفطرية حكرا على بصريا والسماح للتحفيز الميكانيكي من خلال تكيف صلابة مصفوفة، والسماح بإيصال جينات الفيروس بوساطة.
Abstract
الأعضاء الحسية للإذن الداخلية تشكل تحديا للدراسة في الثدييات بسبب عدم إمكانية الوصول إلى التلاعب التجريبية والمراقبة البصرية. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن تقنيات الثقافة القائمة تسمح الاضطرابات البيوكيميائية، هذه الأساليب لا توفر وسيلة لدراسة آثار القوة الميكانيكية وتصلب الأنسجة أثناء تطوير الحواس الإذن الداخلية. هنا يصف لنا طريقة للثقافة أورجانوتيبيك ثلاثي الأبعاد utricle مورين سليمة والقوقعة أن يتغلب على هذه القيود. تقنية لتكيف صلابة مصفوفة ثلاثية الأبعاد وصفها هنا يسمح بالتلاعب بقوة مطاطا معارضة لنمو الأنسجة. ولذلك يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة دور قوي ميكانيكية أثناء تطوير الإذن الداخلية. بالإضافة إلى ذلك، تسمح الثقافات إيصال الجينات بوساطة الفيروسات، التي يمكن استخدامها لإجراء التجارب على الربح والخسارة-من-وظيفة. يحتفظ هذا الأسلوب الثقافة الفطرية خلايا الشعر ودعم الخلايا، ويخدم كبديل يحتمل أن تكون متفوقة على الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد للحواس السمعية والدهليزيه.
Introduction
وقد تيسر دراسة معظم جوانب التنمية الجهاز الثدييات بنظم في المختبر . الآن تستخدم طريقتين الرئيسي لثقافة الدهليزية الحواس: التعويم الحر1 و ملتصقة2 الأعمال التحضيرية. كلا الأسلوبين يسمح بالتحري عن خلية الشعر الضعف3 والتجديد1،4 في المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، لها أدوار التنموية من الدرجة5،6،7،Wnt8، وعامل نمو البشرة مستقبلات (EGFR)9،10 إشارات الشلالات في الإذن الداخلية تم إنشاء، في جزء منه، عن طريق استخدام الثقافات في المختبر من ابيثيليا الحسية. ومع ذلك، نمو الخلايا وتمايزها تخضع للرقابة، ليس فقط من خلال الإشارات التي مورفوجينس، ولكن أيضا من خلال الرموز المادية والميكانيكية مثل جهات الاتصال بين الخلايا وصلابة المصفوفة خارج الخلية، وتمتد الميكانيكية أو انقباض. دور مثل هذه المنبهات الميكانيكية صعبة التحقيق في الإذن الداخلية النامي في فيفو. وعلاوة على ذلك، أساليب التعويم الحر وملتصقة الثقافة القائمة ليست مناسبة لمثل هذه الدراسات في المختبر. هنا يصف لنا طريقة للثقافة أورجانوتيبيك ثلاثي الأبعاد في الكولاجين وأنا الهلام من صلابة متفاوتة. هذا الأسلوب إلى حد كبير يحافظ على البنية في فيفو الدهليزية و cochlear الحواس، ويسمح للتحقيق في آثار القوة الميكانيكية على النمو والتمايز11.
لأن المنبهات الميكانيكية معروفة لتنشيط الأحداث الجزيئية المتلقين للمعلومات، مثل فرس النهر مما يشير إلى مسار12،13،،من1415، من المهم أن تكون قادرة على الجمع بين التحفيز الميكانيكي مع التلاعبات البيوكيميائية والوراثية. يسمح بتسليم جينات الفيروس بوساطة الثقافة الطريقة الموضحة هنا وذلك يمكن استخدامها لدراسة الإشارات الميكانيكية والجزيئية على حد سواء خلال الإذن الداخلية التنمية11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا بالعناية بالحيوان واستخدام اللجان في جامعة روكفلر، ومن جامعة كاليفورنيا الجنوبية.
1-(اختياري) إعداد الكولاجين أنا الحل من الأوتار موسيتايل
ملاحظة: الكولاجين أنا الحلول متاحة تجارياً. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لإعداد جيل.
- Euthanize الفئران البالغين الصغار (3-5 أسابيع من العمر) 5-10 من أي سلالة نوع البرية مع ثاني أكسيد الكربون وفقا لبروتوكول أقرته لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية ذات الصلة16. جمع الذيول وتطهير لهم بغمر في الإيثانول 70% على الأقل من 4 ح في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: وينبغي تجنب الحضانة لأكثر من 48 ساعة، كما أنه يؤدي إلى جفاف الأنسجة المفرط ويعوق عملية الاستخراج وتر. - إزالة الجلد من كل ذيل بإدخال قطع طولية مع شفرة المبضع وتراجعه الجلد كله بالملقط. نقل ذيول البشرة إلى طبق بتري 100 ملم مليئة نظيفة 70% إيثانول وقطع منها إلى شرائح 10 ملم.
ملاحظة: تجاهل أجزاء أنحف من الذيول، التي يصعب التعامل معها. - استخدام الملقط، تأمين كل جزء من الذيل إلى أسفل طبق بيتري واستخدام زوج ثاني من الملقط غرامة لاستخراج الأوتار من ذيل واحد في وقت واحد. ينبغي أن تظهر ألياف وتر الفردية مع الحد الأدنى من المقاومة.
ملاحظة: قديمة ومملة الملقط #5 تعمل جيدا لهذه الخطوة. - إعداد 100 مل الحل 0.1% (من حيث الحجم) من حمض الخليك في المياه المعقمة، والجزيئية الصف وإضافة 10 مل من ذلك الحل إلى طبق بتري معقمة 100 ملم. نقل الأوتار إلى طبق بتري ويغادر ح 1 في درجة حرارة الغرفة تجريدها الكولاجين أنا.
- استخدام مقصات مشرط أو iridectomy عقيمة مع نصائح كليلة، منحنى فرم الوتر في الأجزاء 1-2 مم. نقل الأوتار مفروم إلى أنبوب 50 مل عقيمة وإضافة 0.1% حمض الخليك إحضار وحدة التخزين إلى 50 مل.
ملاحظة: استخدام أربعة أو خمسة ذيول لكل 50 مل من حمض لتحقيق الكولاجين أنا تركيز 2.0-2.5 ملغ/مل. - بردت الكولاجين أنا الحل عند 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لتسهيل تمسخ البروتين الكامل. تعيين دوامة مع دوامة سطح المنضدة بالسرعة القصوى لمدة 1 دقيقة مرتين في يوم.
- قياس تركيز البروتين الحل باستخدام مقايسة حمض بيسينتشونينيك، وضبط الكولاجين أنا تركيز إلى 2.0-2.5 ملغم/مل بإضافة الحل 0.1% من حمض الخليك، ومخزن في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: الكولاجين أنا الحل يمكن تخزينها لعام أو عامين. - (اختياري) الطرد المركزي الكولاجين أنا الحل في 2,000 س ز ح 1 في 4 درجات مئوية واستخدام الهلام الكسر شفاف أعلى (ما يقرب من نصف الحجم)، لتحقيق الكولاجين بصريا واضحة في القسم 4.
2-تشريح الأجهزة السمعية والدهليزيه
- Euthanize الفئران الحوامل من أي سلالة مع ثاني أكسيد الكربون وفقا لبروتوكول أقرته لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية ذات الصلة16. استخراج وقطع رأس الأجنة.
ملاحظة: يمكن استخدام لفنج-كريرT2/tdTomato الفئران للسماح بوضع العلامات الدائمة لدعم الخلايا عند التعرض إلى هيدروكسيتاموكسيفين 417. - تعقيم كل عمل السطوح وتشريح الصكوك، بما في ذلك اثنين من أزواج من الملقط #5 وشعر سكين18، عن طريق تنظيف لهم مع الإيثانول 70%.
- تقسيم كل رئيس في نصفي بإدخال قطع طولية مع شفرة مشرط معقم أو باستخدام اثنين من أزواج من الملقط #5. استخراج العظام المؤقت، والتي تحتوي على الأذنين الداخلية19، ووضعها في 15 مل من المثلج هانك محلول ملح متوازن (حبس) في طبق بتري 60 ملم. يبقى الطبق على الجليد.
ملاحظة: وقد استخدمت الأجنة في مجموعة من المراحل من E13.5 إلى E18.5 بنجاح. - (اختياري) غسل الأذنين الداخلية التي تهز بلطف لهم في أنبوب 50 مل مخروطية تحتوي على 30 مل حبس المثلج واستبدالها حبس ثلاث أو أربع مرات. الاحتفاظ بالانبوب على الجليد.
ملاحظة: هذه الخطوة تحد من التلوث المحتمل لزراعة الأنسجة ويجلب درجة الحرارة بسرعة إلى 4 درجات مئوية، مما يمنع موت الخلية وتدهور الأنسجة. - باستخدام اثنين من أزواج من غرامة #5 الملقط، فصل في آذان الداخلية من العظم الصدغي ونقل الأذنين، وثلاثة أو أربعة في كل مرة، إلى طبق بتري 60 ملم مليئة بحبس المثلج.
- تشريح الدهليزية الحواس.
- توجيه الجانب الآنسي آذان تصل والعثور أوتريكلي. مع اثنين من أزواج من الملقط #5، إزالة غضروف المحيطة بأجهزة الدهليزية. بلطف قطع العصب دهليزي، الاتصال بين أوتريكلي وساككولي، والقنوات نصف دائري، كما هو مبين في الشكل 1. اجذب أوتريكلي وأمبولي المرفقة للقنوات نصف دائري متفوقة وأفقي من الإذن.
ملاحظة: يمكن استخدام هذا الأسلوب في آذان الداخلية من مراحل E16.5-E18.5. المحافظة على الغضروف الشظايا للقسم 3 أدناه.
- توجيه الجانب الآنسي آذان تصل والعثور أوتريكلي. مع اثنين من أزواج من الملقط #5، إزالة غضروف المحيطة بأجهزة الدهليزية. بلطف قطع العصب دهليزي، الاتصال بين أوتريكلي وساككولي، والقنوات نصف دائري، كما هو مبين في الشكل 1. اجذب أوتريكلي وأمبولي المرفقة للقنوات نصف دائري متفوقة وأفقي من الإذن.
- تشريح القوقعة.
- إزالة الأنسجة عنقية المحيطة بجهاز السمع مع اثنين من أزواج من الملقط #5. قطع الاتصال بين قاعدة cochlear وساككولي بلطف كما هو مبين في الشكل 1.
ملاحظة: لمراحل E13.5-E14.5، تليين الغضروف قبل التشريح بمعاملة الداخلية آذان مع كولاجيناز 0.25% أنا في حل مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. المحافظة على الغضروف الشظايا للقسم 3 أدناه.
- إزالة الأنسجة عنقية المحيطة بجهاز السمع مع اثنين من أزواج من الملقط #5. قطع الاتصال بين قاعدة cochlear وساككولي بلطف كما هو مبين في الشكل 1.
- استخدام بيبيت 200 ميليلتر مزودة بتلميح نونستيك على نطاق واسع، ونقل أوتريكليس وكوتشلياي إلى طبق بتري عيار 30 ملم مليئة بنمو متوسطة تتألف من DMEM/F12 تستكمل مع 33 مم دجلوكوسي، بيكربونات الصوديوم 19 مم، 15 ملم 4(2hydroxyethyl)- حمض 1piperazineethanesulfonic (هيبيس)، الجلوتامين 1 مم ونيكوتيناميد 1 مم، وعامل نمو البشرة 20 مغ/لتر، وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية 20 مغ/لتر، الأنسولين 10 مغ/لتر، ترانسفيرين 5.5 مغ/لتر وسيلينيت الصوديوم ميكروغرام/لتر 5.
- الحفاظ على utricle الأعمال التحضيرية لما يصل إلى 3 س في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة الغاز بنسبة 5% ثاني أكسيد الكربون للسماح بشفاء التخفيضات في ظهارة قدم خلال التشريح. ينبغي أن تنقل القوقعة الاستعدادات لجل الكولاجين 10 دقيقة بعد التشريح.
ملاحظة: لأنه يتم إجراء التشريح في حبس المثلج، ليست هناك حاجة قبل الحارة المتوسطة النمو إلى 37 درجة مئوية.
3-(اختياري) ضبط الكولاجين أنا جل صلابة عن طريق إضافة تركيزات مختلفة من تشوندروسيتيس
ملاحظة: تعديل الأسلوب لعزل تشوندروسيتي من Gosset et al. 20
- تعد حلاً 1% من كولاجيناز في عقيم 1 × 100-200 ميليلتر مختبرين برنامج تلفزيوني ومخزن في-80 درجة مئوية. إذابة الثلج على الجليد عند الحاجة، وتجنب دورات تجميد أذاب متعددة.
- استخدام الملقط غرامة لجمع قطع الغضاريف التي خلفتها تشريح الأجهزة السمعية والدهليزيه من آذان 10-12. الأنسجة الضامة والإذن الداخلية منفصلة من الغضروف. نقل الغضروف إلى طبق بتري عيار 30 ملم وإضافة 300 ميليلتر من متوسط النمو العقيمة.
- استخدام مقص بليد أو إيريديكتومي مشرط معقم مع نصائح منحنى كليلة فرم الأنسجة لتحقيق قطع الغضروف حوالي 0.5 ملم في الطول.
- إضافة كولاجيناز أنا للمتوسط مع الغضروف لتحقيق تركيز إنزيم نهائي من 0.25%. نقل الطبق حاضنة استنبات أنسجة في 37 درجة مئوية بالغاز بنسبة 5% ثاني أكسيد الكربون. ثم احتضان بيبيت بشدة استخدام بيبيت ميليلتر 1,000 كل 20 دقيقة حتى ننأى بقطعة من غضروف ويمكن تمييزها في الحل، ولكنها لم تعد 20 دقيقة إضافية.
ملاحظة: في حالة الأعمال التحضيرية utricle، يمكن إجراء العزل chondrocyte خلال الخطوة 2.9؛ يستغرق حوالي 2 ح (3-4 جولات بيبيتينج). - جمع تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل، وضبط مستوى الصوت إلى 10 مل مع PBS العقيمة x 1. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني x 1 العقيمة. الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية.
ملاحظة: من الأهمية بمكان لغسل الخلايا مرتين؛ أي كولاجيناز المتبقية وأنا سوف هضم الكولاجين أنا هلام. - استخدام بيبيت 200 ميليلتر، إضافة 100 ميليلتر من مستنبت الخلية بيليه وبيبيت بلطف ريسوسبيند. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير والمحافظة عليها على الجليد قبل الاستخدام.
- لزيادة صلابة هلام، إضافة تشوندروسيتيس إلى الكولاجين معادلتها جل الحل (الجزء 1)، ومزيج سريعاً لتوزيع الخلايا في جميع أنحاء الجل قبل التجميد.
ملاحظة: معامل مرونة الكولاجين أنا هلام (مقياس لصلابة) وأضاف زيادات خطيا مع عدد تشوندروسيتيس11. يتم وصف العلاقة بواسطة الدالة الخطية تصميماً تجريبيا ه = 206· Nc + 15، التي ه هو معامل مرونة في بسكالس و نورث كارولاينا هو عدد تشوندروسيتيس بالملايين. لبروتوكول مفصل لجل قياسات صلابة يرجى الرجوع إلى المادة الأصلية11.
4-وضع الجهاز الحسي الدهليزية أو سمعية في الكولاجين أنا هلام
- في أنبوب 1.5 مل عقيمة، إعداد الكولاجين أنا الحل البلمرة بخلط 160 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 10 مع مؤشر الرقم الهيدروجيني الفينول الحمراء وميليلتر 133 من هيدروكسيد الصوديوم 0.34 م 70 ميليلتر من بيكربونات الصوديوم 0.9 م 40 ميليلتر من 1 "م حبيس". الاحتفاظ بالانبوب على الجليد.
ملاحظة: ويوفر هذه الوصفة البلمرة الحل اللازم لإعداد 2 مل الكولاجين أنا هلام، ولكن يمكن توسيع نطاقها حسب الحاجة. - مزيج 100 ميليلتر من 400 ميليلتر من الكولاجين والحل البلمرة أنا الحل على الجليد بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً في أنبوب 1.5 مل مبردة. لزيادة صلابة هلام، إضافة 50 ميليلتر من متوسط النمو الذي يحتوي على تشوندروسيتيس وتخلط بلطف كما هو موضح في القسم 3.
- نقل 500 ميليلتر من الكولاجين معادلتها أنا الحل مثلجة طبق بيتري عيار 30 ملم مع إدراج أسفل زجاج 10 مم أو بئر صفيحة أربعة آبار.
ملاحظة: من الأهمية بمكان للحفاظ على جميع الكواشف على الجليد لمنع البلمرة السريع وغير متكافئ من الكولاجين أنا. - بسرعة نقل كوكليا أو أوتريكليس إلى الكولاجين معادلتها أنا الحل وضبط الأجهزة إلى مواقعها المطلوبة مع الشعر العقيمة سكين18 أو زوج من الملقط غرامة.
ملاحظة: الكولاجين أنا بلمرة يصبح ملحوظا بعد دقيقة 1-2 كما يصبح الحل عكر. - بعد قد بلمرة الحل حول الأنسجة، وضع طبق بتري أو لوحة أربعة جيدا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة الغاز بنسبة 5% ثاني أكسيد الكربون لضمان اكتمال البلمرة.
- أضف 3 مل من النمو المتوسطة وتستكمل مع 0.5% مصل بقرى الجنين (FBS) كل طبق بتري أو 500 ميليلتر المتوسطة نفس كل من صفيحة أربعة آبار جيدا. الحفاظ على الثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة الغاز بنسبة 5% ثاني أكسيد الكربون. إذا رغبت في ذلك، تكمل المتوسطة النمو مع 10 ميكرون 5-اثينيل-2´-ديوكسيوريديني (إيدو) تسمية الخلايا المتكاثرة.
ملاحظة: ويمكن استخدام تركيزات FBS أعلى إذا رغبت في ذلك.
5-الفيروسية الحقن في الثقافات ثلاثي الأبعاد للأجهزة الحسية السمعية والدهليزيه
- تذويب الفيروس المطلوب على الجليد وخلط مع الحل تريبان الأزرق في أنبوب مخروطي 0.5 مل لتحقيق تركيز 0.05% صبغة نهائية. استخدم صبغ x 10-20 لتجنب إضعاف كبير للفيروس. الحفاظ على الجليد.
ملاحظة: إتش النمط المصلي المسيطر يعمل 5 أفضل لإصابة الخلايا الداعمة في أوتريكلي19، بينما يمكن أن تصيب الفيروسات المرتبطة بالغدة Anc80 كلا خلايا الشعر ودعم الخلايا في utricle و القوقعة21. - كسر غيض من إبرة زجاجية أعدت على ساحبة ميكروبيبيتي مع ملقط نظيف جيد مع ملاحظة أنه في أعلى تكبير مجهر تشريح مجهر.
ملاحظة: من المهم تحسين الإعدادات على ساحبة الإبرة. الإبر مع 9-12 ملم شانكس و 20-30 ميكرون فتحات تعمل بشكل أفضل. - إزالة ثقافة حسية الجهاز من الحاضنة. إرفاق الإبرة ميكروينجيكتور وملء مع 2-3 ميليلتر من خليط الصبغة والفيروسات. النهوض الإبرة في الجهاز الحسي مع ملاحظة أنه تحت مجهر تشريح مجهر.
- محرك بلطف طرف إبرة عن طريق الطبقات الوسيطة وطلائي سقف ثقافة أوتريكولار ثلاثي الأبعاد. حقن الخليط الفيروسية حتى تملأ تجاويف utricle وأمبولي بالصبغة الزرقاء.
ملاحظة: لأنه يسمح بالوصول بسهولة إلى الحواس، طبق بتري أسفل زجاج 10 مم الأمثل للحقن. - احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة الغاز بنسبة 5% ثاني أكسيد الكربون.
ملاحظة: عندما يتم استخدام البروتينات الفلورية الخضراء أو الحمراء في بناء الفيروسية، الأسفار الظاهر ح 24 بعد توصيل الفيروسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الحواس السمعية والدهليزيه من آذان الجنينية، مثقف في 40-Pa الكولاجين أنا الجل محاكاة ظروف الجنينية صلابة منخفضة11والاحتفاظ بهياكل ثلاثية الأبعاد طبيعية نسبيا (الشكل 1) والحفاظ على خلايا الشعر و دعم الخلايا (الشكل 2 و الشكل 3). على الرغم من أن دعم كثافة الخلية ينخفض بأكثر من 30% (اختبار ستيودنت t-: n = 4، ف < 0.004) ويقلل كثافة الخلية الشعر بنسبة 60% (اختبار ستيودنت t-: n = 5، ف < 0.0001) بعد 3 أيام في الثقافات أوتريكولار (رقم 2 )، منطقة البقعة أكثر من الضعف خلال نفس الفترة من الوقت11 (n = 3، ع = 0.0002). وهذا يدل على أن الأسلوب للثقافة ثلاثي الأبعاد الموضحة هنا يسمح لزيادة كبيرة في العدد من دعم خلايا11، مع الإبقاء على 80% خلايا الشعر موجودة في أوتريكلي على مدى فترة 3 أيام. في ثقافات ثلاثي الأبعاد المنشأة من القوقعة E14.5، تفرق Sox2-إيجابية الخلايا السلف كصفوف يمكن تمييزها شكلياً لخلايا الشعر الداخلي والخارجي بعد 3 أيام في الثقافة (الشكل 3).
يمكن التلاعب بها التعبير الجيني في الثقافات ثلاثي الأبعاد للأجهزة الحسية السمعية والدهليزيه عن طريق العدوى الفيروسية. يتم إضافة 4hydroxytamoxifen إلى المتوسط الثقافة إلى تسمية دعم خلايا في explants cochlear المنشأ من الأجنة E15.5 لفنج-كريرT2/tdTomato الفئران17. اكتب حقن إتش 5 في تجويف نتائج الثقافة في الإصابة بدعم الخلايا الموجودة في الجهاز (الشكل 4أ). حقن الفيروس نفسه في التجويف أوتريكولار ثقافة المنشأة من الأجنة E17.5، النتائج أساسا في العدوى لدعم خلايا في جميع أنحاء ظهارة الحسية (الشكل 4ب).
الشكل 1. التخطيطية من تشريح والصور الضوء مجهرية من الثقافات الممثلة utricle والقوقعة في الكولاجين ثلاثي الأبعاد وأنا الهلام. يصور الرسم التخطيطي (A) A epithelia الحسية (الأخضر) من ستة أجهزة مستقبلات الإذن الداخلية موريني. تحدد الخطوط الحمراء التخفيضات التي أدخلت أثناء تشريح utricle والقوقعة. تصوير صور مجهرية الخفيفة (ب) E17.5 أوتريكلي (اللوحة العلوية) و E14.5 القوقعة (أسفل اللوحة) جزءا لا يتجزأ من الكولاجين هلام، ومثقف ح 48. تمثل أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من جنيديفا وآخرون. 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. خلايا الشعر والخلايا الداعمة في الثقافات أوتريكولار ثلاثي الأبعاد- (أ) تصوير الصور المجهرية كونفوكال أوتريكلي E18.5 قبل اكسبلانتيشن (لوحات أعلى) وبعد 3 أيام في ثقافة ثلاثية الأبعاد في 40-Pa الكولاجين أنا هلام (الألواح السفلي). تتم تسمية خلايا الشعر ل Myo7A (الأخضر) ودعم الخلايا ل Sox2 (أحمر). شريط مقياس يمثل 50 ميكرومتر. (ب) كوانتيفيكيشنز دعم خلية الكثافة (أشرطة حمراء)، وكثافة الشعر خلية (أشرطة خضراء)، والمناطق القرنية (القضبان الرمادية) في أوتريكليس E18.5 قبل اكسبلانتيشن وبعد 3 أيام في ثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد تمثل وسيلة ± SEMs (ف < 0.001 يمثل وصفه * * وف < 0.0001 كما * * *). وقد تم تعديل هذا الرقم من جنيديفا et al. 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. خلايا الشعر والخلايا الداعمة في الثقافات cochlear ثلاثي الأبعاد- تصوير الصور [كنفوكل] مجهرية القوقعة E14.5 قبل اكسبلانتيشن (لوحات أعلى) وبعد 3 أيام في ثقافة ثلاثية الأبعاد في 40-Pa الكولاجين أنا هلام (الألواح السفلي). خلايا الشعر الداخلية الإيجابية Myo7A و Sox2 (المدينة) وخلايا الشعر الخارجي (والنشرمحفوظه) تظهر في صفوف 4-5 بعد 3 أيام في الثقافة. تتم تسمية الخلايا الداعمة أيضا ل Sox2 (أحمر). شريط مقياس يمثل 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. نتائج تمثيلية من العدوى الفيروسية في الجهاز ثلاثي الأبعاد الثقافات القوقعة وأوتريكلي- (أ) حقن إتش النمط المصلي المسيطر 5 في الثقافات cochlear ثلاثي الأبعاد المنشأة من لفنج-كريرT2/tdTomato26 E15.5 الأجنة النتائج في العدوى (بروتينات فلورية خضراء، خضراء) لدعم خلايا (الطماطم، أحمر) في قاعدة الجهاز. تحدد ظهارة الحسية باللون الرمادي. يمثل الشريط مقياس 100 ميكرومتر. (ب) حقن متطابقة في ثقافة أوتريكولار ثلاثي الأبعاد المنشأة من جنين E17.5 ينتج عن العدوى (التجارة، والنقل الأخضر) لدعم خلايا (Sox2، الأحمر) في جميع أنحاء الجهاز. تحدد ظهارة الحسية باللون الرمادي. يمثل الشريط مقياس 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من جنيديفا et al. 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإشارات الجزيئية التي تم التوسط النمو والتمايز في الإذن الداخلية أثناء تطوير دراسة مستفيضة5،،من67،،من89،10. بيد أن الأدلة التي تم الحصول عليها من النظام النموذجي أوتريكولار تشير إلى أن الرموز الميكانيكية، لمست من خلال الوصلات الخلية وتفعيل الإشارات فرس النهر، تلعب أيضا دوراً هاما في هذه العمليات2،11، 22-وعلاوة على ذلك، كلا من النتوء يموت خلايا الشعر من ظهارة الحسية وتشكيل اللاحقة من مستقبلات حسية جديدة عن طريق ترانسديفيرينتييشن يمكن أن تؤثر على القوة الميكانيكية لمست ببقايا دعم الخلايا، مما يسبب لهم لإعادة إدخال دورة الخلية أثناء التجديد. ويوفر نظام الثقافة ثلاثي الأبعاد الموضحة هنا وسيلة تجريبية للتحقيق في دور القوة الميكانيكية في مراقبة النمو خلال الإذن الداخلية التنمية11 ، ويحتمل أن تكون، دور القوة نفسها خلال خلية الشعر التجديد. وعلاوة على ذلك، يسهل هذا النهج العدوى الفيروسية التي توفر طريقة لتغيير التعبير الجيني في ظهارة الحسية، مما يسمح بمزيج من المعالجات الميكانيكية والجزيئية للتحقيق من النمو والتجدد في الإذن للحواس11.
أوجه قصور الطريقة التي تتصل بالحد الأدنى المعلومات المتاحة بشأن القوات الذاتية والمؤثرات الميكانيكية أثناء embryogenesis الإذن الداخلية. قياسات لتصلّب الأنسجة في الإذن الداخلية النامية لا توجد لدينا المعرفة؛ ومن ثم من الصعب تقدير ما تيبس الكولاجين أنا جل يتوافق مع الظروف في فيفو . ملاحظاتنا والنموذج تشير إلى أن قوة معارضة للنمو أوتريكلي منخفضة في البداية ويزيد مع اقتراب الجهاز الحجم النهائي11. ولذلك نحن افترض أن الكولاجين أنا جل دون chondrocytes ركيزة فسيولوجيا ذات صلة لثقافة الحواس السمعية والدهليزيه الجنينية.
الثقافة ثلاثي الأبعاد الأسلوب الموصوفة هنا الحث على تشكيل الخلايا الداعمة الجديدة في البقعة أوتريكولار11، مع الحفاظ على أيضا ما يزيد على 80% خلايا الشعر بعد 3 أيام في الثقافة (الشكل 2). الأسلوب، لذلك، يمثل بديلاً متفوقة للثقافات ثنائي الأبعاد أوتريكلي والتي 40-50% فقط من خلايا الشعر في البقاء على قيد الحياة بعد 24 ساعة الأولى في الثقافة5،8، ويمكن استخدامها لدراسة مواطن الضعف خلية الشعر و التجديد في المختبر.
على الرغم من أن ندلل على تشكيل صفوف المنظمة تشريحيا مميزة من خلايا الشعر الداخلي والخارجي في كورتي من الجهاز مثقف، المزيد من العمل مطلوب لتحديد ما إذا كانت الثقافة ثلاثي الأبعاد الأسلوب الموصوفة هنا يدعم العادي استطالة cochlear مجرى الهواء أثناء العملية التمديد المتقاربة (CE)23،،من2425. م هو عملية ديناميكية للغاية تضم الخلية الهجرة، وإعادة ترتيب، وخلية خلية الاتصال التغييرات26 التي يحتمل أن تتأثر بالقوة الخارجية التي تنتجها الأنسجة المحيطة بالقناة cochlear النامية. هذا الأسلوب الحفاظ على بنية أنسجة ثلاثية الأبعاد طبيعية نسبيا، ويمكن أن يكون مفيداً لدراسة CE في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر الدكتور ألف جاكوبو وسالفي ج. د. بيتيلسكي أ لمساهماتها للبحث الأصلي الذي يستند إليه هذا البروتوكول. ونشكر أيضا ياء اللاما ووكر ماكمورا للمساعدة التقنية، وتربية الحيوانات. نعترف بمنحه التدريب NIDCD T32 DC009975، منح نيدكد R01DC015530، صندوق التنمية العلاجية روبرتسون، ومؤسسة عائلة كاروسو للتمويل. وأخيراً، نعترف بدعم من معهد هاوارد هيوز الطبي، الذي هو الدكتور هدزبيث محقق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , Humana Press. Totowa, N.J. 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
