Summary
Tredimensionella organotypic kulturer av murina utricle och snäckan i optiskt klart kollagen jag geler bevara medfödda vävnad morfologi, möjliggöra mekanisk stimulering genom justering av matrix stelhet och tillåta virus-medierad gen leverans.
Abstract
De sensoriska organen i innerörat är utmanande för att studera hos däggdjur deras otillgänglighet till experimentella manipulation och optisk observation. Dessutom även om befintliga kultur tekniker tillåter biokemiska störningar, ger dessa metoder inte ett sätt att studera effekterna av mekanisk kraft och vävnad stelhet under utvecklingen av innerörat sensoriska organ. Här beskriver vi en metod för tredimensionella organotypic kultur intakt murina utricle och snäckan som övervinner dessa begränsningar. Tekniken för justering av en tredimensionell matris stelhet beskrivs här tillåter manipulering av elastisk kraft motsatta vävnadstillväxt. Denna metod kan därför användas för att studera rollen av mekaniska krafter under innerörat utveckling. Dessutom, ger kulturerna virus-medierad gen leverans, som kan användas för vinst - och förlust-av-funktion experiment. Denna kultur metod bevarar medfödda hårcellerna och stöder celler och fungerar som ett potentiellt överlägset alternativ till den traditionella tvådimensionella kulturen av vestibulära och auditiv sinnesorgan.
Introduction
Studien av de flesta aspekter av däggdjur orgel utveckling har underlättats av in vitro- system. Två huvudsakliga metoder används nu för kulturen i vestibulära sensoriska organ: fritt flytande1 och vidhäftande2 preparat. Båda metoderna tillåta utredning av hår cell sårbarheter3 och förnyelse1,4 in vitro. De utvecklingsmässiga rollerna av Notch5,6, Wnt7,8, och epidermal tillväxtfaktor receptor (EGFR)9,10 signalering cascades i innerörat har dessutom fastställts, delvis med hjälp av in vitro- kulturer av sensorisk epitel. Dock är celltillväxt och differentiering kontrollerade, inte bara genom signalering av morphogens, men också genom fysiska och mekaniska signaler såsom intercellulära kontakter, styvheten hos extracellulärmatrix, och mekanisk stretching eller sammandragning. Rollen av sådana mekaniska stimuli är utmanande att undersöka i utvecklingsländer innerörat i vivo. Dessutom passar befintliga friflytande och vidhäftande kultur metoder inte sådana studier in vitro. Här beskriver vi en metod för tredimensionella organotypic kultur i kollagen geler jag varierande styvhet. Denna metod till stor del bevarar i vivo arkitekturen av de vestibulära och cochlear sinnesorgan och tillåter undersökning av effekterna av mekanisk kraft på tillväxt och differentiering11.
Eftersom mekaniska stimuli är känd för att aktivera nedströms molekylära händelser, såsom flodhästen signalering utbildningsavsnitt12,13,14,15, är det viktigt att kunna kombinera mekanisk stimulering med biokemiska och genetiska manipulationer. Metoden kultur beskrivs här tillåter virus-medierad gen leverans och kan därför användas för att studera både mekanisk och molekylär signalering under innerörat utveckling11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av djur vård och användning kommittéer av Rockefeller University och vid University of Southern California.
1. (valfritt) beredning av kollagen jag lösning från Mouse-tail senor
Obs: Kollagen jag lösningar finns kommersiellt. Följ tillverkarens instruktioner för gel beredning.
- Avliva 5-10 ung vuxen (3-5 veckor gamla) möss av någon vildtyp stam med koldioxid i enlighet med det protokoll som godkänts av de relevanta institutionella djur vård och användning kommittén16. Samla svansar och desinficera dem genom att dränka i 70% etanol i minst 4 timmar i rumstemperatur.
Obs: Inkubation i över 48 h bör undvikas, eftersom det resulterar i överdriven vävnad uttorkning och försvårar senimplantat extraheringen. - Ta bort skinnet från varje svans genom att införa ett längsgående snitt med en skalpell blad och infällbara hela huden med pincett. Överföra de flådda svansar till en 100 mm petriskål fylld med ren 70% etanol och skär dem i 10 mm segment.
Obs: Kassera de tunnaste delarna av svansar, som är svåra att manipulera. - Med pincett, säkra varje segment av svansen till botten av petriskål och använda ett par fina pincett för att extrahera senor från svansen en i taget. Enskilda senan fibrer bör dyka upp med minimalt motstånd.
Obs: Gamla, tråkiga #5 tången fungerar bra för detta steg. - Bereda 100 mL av en 0,1% lösning (i volym) ättiksyra i steril, molekylär-grade vatten och tillsätt 10 mL av lösningen till en steril petriskål 100 mm. Överföra senor till petriskål och lämna för 1 h i rumstemperatur att denaturera kollagen jag.
- Använd en steril skalpell eller iridektomi sax med trubbiga, böjda tips för att finhacka senan i 1-2 mm fragment. Överför malet senor till en steril 50 mL tub och tillsätt 0,1% ättiksyra för att få volymen till 50 mL.
Obs: Använd fyra eller fem svansar för varje 50 mL syra för att uppnå en kollagen jag koncentrationen 2,0-2,5 mg/mL. - Kylskåp kollagen jag lösning vid 4 ° C i minst 48 h att underlätta komplett protein denaturering. Vortex med en bordsskiva vortex Ange maximal hastighet för 1 min två gånger om dagen.
- Mätning av protein koncentrationen av lösningen med bicinchoninic syra analys, justera kollagen jag koncentrationen 2,0-2,5 mg/ml genom att lägga till 0,1% lösning av ättiksyra och store vid 4 ° C.
Obs: Kollagen I lösning kan förvaras i ett till två år. - (Valfritt) Centrifugera kollagen jag lösning vid 2000 x g i 1 h vid 4 ° C och Använd den genomskinliga topp fraktionen (cirka hälften av volymen), att uppnå optiskt klart kollagen geler i avsnitt 4.
2. dissektion av vestibulära och auditiv organ
- Euthanize dräktiga möss av någon stam med koldioxid i enlighet med det protokoll som godkänts av de relevanta institutionella djur vård och användning kommittén16. Extrahera och halshugga embryon.
Obs: Lfng-CreERT2/tdTomato möss kan användas för att permanent märkning av stödjande celler vid exponering för 4-hydroxytamoxifen17. - Sterilisera alla arbetsytor och dissektion instrument, inklusive två par #5 pincett och en hår kniv18, genom att rengöra dem med 70% etanol.
- Dela varje huvud i två halvor genom att införa ett längsgående snitt med en steril skalpell blad eller genom att använda två par #5 pincett. Extrahera de temporala ben, som innehåller den inre öra19, och placera dem i 15 mL av iskall Hanks balanserad saltlösning (HBSS) i en 60 mm petriskål. Hålla skålen på is.
Obs: Embryon i olika skeden, från E13.5 till E18.5 har använts framgångsrikt. - (Valfritt) Tvätta inre öronen genom att försiktigt skaka dem i en 50 mL konisk tub som innehåller 30 mL iskallt HBSS och ersätta HBSS tre eller fyra gånger. Håll röret på is.
Obs: Detta steg begränsar eventuell förorening av vävnadsodling och ger snabbt temperaturen 4 ° C, vilket förhindrar nedbrytning och cell vävnadsdöd. - Använda två par fina #5 pincett, skilja inre öronen från tinningbenet och överföra öronen, tre eller fyra i taget, i en 60 mm petriskål fylld med iskall HBSS.
- Dissekera de vestibulära sensoriska organen.
- Orient den öra mediala sidan upp och leta upp utricle. Med två par #5 pincett, ta bort brosk kring de vestibulära organen. Försiktigt sever vestibulära nerven, anslutningen mellan utricle och saccule och de semicircular kanalerna, som visas i figur 1. Dra försiktigt utricle och de bifogade ampullae av den överlägsna och horisontella båggångarna från örat.
Obs: Denna metod kan användas på inre öron av arrangerar E16.5 - E18.5. Bevara brosk fragment för avsnitt 3 nedan.
- Orient den öra mediala sidan upp och leta upp utricle. Med två par #5 pincett, ta bort brosk kring de vestibulära organen. Försiktigt sever vestibulära nerven, anslutningen mellan utricle och saccule och de semicircular kanalerna, som visas i figur 1. Dra försiktigt utricle och de bifogade ampullae av den överlägsna och horisontella båggångarna från örat.
- Dissekera snäckan.
- Ta bort brosk vävnaden som omger förhandlingen organ med två par #5 pincett. Försiktigt bryta anslutningen mellan cochlear bas och saccule som visas i figur 1.
Obs: För steg E13.5 - E14.5, mjuka brosk före dissektion genom behandling inre öron med 0,25% kollagenas jag i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning för 5 min i rumstemperatur. Bevara brosk fragment för avsnitt 3 nedan.
- Ta bort brosk vävnaden som omger förhandlingen organ med två par #5 pincett. Försiktigt bryta anslutningen mellan cochlear bas och saccule som visas i figur 1.
- Med en 200-µL Pipettera försedd med en bred nonstick spets, överföra utricles och cochleae till en 30-mm petriskål fylld med odlingsmedium bestående av DMEM/F12 kompletteras med 33 mM Dglucose, 19 mM natriumbikarbonat, 15 mM 4(2hydroxyethyl)- 1piperazineethanesulfonic syra (HEPES), 1 mM glutamin, 1 mM nikotinamid, 20 mg/L epidermal tillväxtfaktor, 20 mg/L fibroblast tillväxtfaktor, 10 mg/L insulin, 5,5 mg/L transferrin och 5 µg/L natrium selenit.
- Upprätthålla utricle förberedelserna för upp till 3 h vid 37 ° C i en vävnadskultur inkubator gasade med 5% koldioxid för att möjliggöra läkning av nedskärningar i epitelet infördes under dissektion. Snäckan preparat bör överföras till kollagen gel 10 min efter dissektion.
Obs: Eftersom dissektion utförs i iskall HBSS, finns det ingen anledning att pre värma odlingsmedium till 37 ° C.
3. (tillval) justera kollagen jag Gel styvhet genom att lägga till varierande koncentrationer av kondrocyter
Obs: Metoden för chondrocyte isolering ändrades från Gosset o.a. 20
- Förbereda en 1% lösning av kollagenas I sterila 1 x PBS och store 100-200 µL portioner vid-80 ° C. Frosta på is när det behövs, för att undvika flera frysning-tining cykler.
- Använd fina pincett att samla bitar av brosk kvar från dissektion av vestibulära och auditiv organ från 10-12 öron. Separat bindväv och innerörat vävnader från brosk. Överföra brosk till en 30-mm petriskål och tillsätt 300 µL sterilt odlingsmedium.
- Använd en steril skalpell blad eller iridektomi sax med trubbiga böjda tips för att finhacka vävnaden för att uppnå brosk bitar cirka 0,5 mm i längd.
- Lägg till kollagenas jag till medium med brosk att uppnå en slutlig enzym koncentration på 0,25%. Överföra skålen till en vävnadskultur inkubator vid 37 ° C gasade med 5% koldioxid. Pipettera kraftigt med en 1000 µL Pipettera varje 20 min tills bitar av brosk dissociera och inte längre är distinguishable i lösningen, inkubera sedan en ytterligare 20 min.
Obs: Vid utricle förberedelserna, kan chondrocyte isolering utföras under steg 2,9; Det tar ungefär 2 h (3-4 pipettering rundor). - Samla cellsuspensionen i en 15 mL koniska rör och justera volymen till 10 mL med steril 1 x PBS. Centrifugera vid 800 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 mL steril 1 x PBS. Centrifugera vid 800 x g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten.
Obs: Det är viktigt att tvätta cellerna två gånger; eventuella återstående kollagenas jag kommer smälta kollagen jag gel. - Med en 200-µL Pipettera, tillsätt 100 µL av odlingsmedium cellpelleten och Pipettera försiktigt för att resuspendera. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och behålla dem på isen före användning.
- För att öka gel stelhet, lägga till kondrocyter i neutraliserat kollagen jag gel lösning (avsnitt 1) och blanda snabbt distribuera cellerna i hela gelen innan stelning.
Obs: Elasticitetsmodulen av kollagen jag gel (ett mått på stelhet), ökar linjärt med antalet kondrocyter lagt till11. Förhållandet beskrivs av funktionen experimentellt bestämd linjär E = 206· NC + 15, där E är elasticitetsmodulen i Pascal och Nc är antalet kondrocyter i miljoner. För ett detaljerat protokoll för gel hänvisas stelhet mätningar till den ursprungliga artikel11.
4. Placera vestibulär eller auditorisk sensoriska Organ i en kollagen jag Gel
- I en steril 1,5 mL tub, förbereda kollagen jag polymerisation lösning genom att blanda 160 µL 10 x PBS med fenolrött pH-indikator, 133 µL 0,34 M natriumhydroxid, 70 µL 0,9 M natriumbikarbonat och 40 µL av 1 M HEPES. Håll röret på is.
Obs: Detta recept ger den polymerisation-lösningen som behövs för att förbereda 2 mL av kollagen jag gel, men kan skalas efter behov. - Blanda 100 µL av polymerisation lösning och 400 µL av kollagen jag lösning på is genom att försiktigt upp och ner i ett kylt 1,5 mL rör med. För att öka gel stelhet, tillsätt 50 µL av odlingsmedium som innehåller kondrocyter och blanda försiktigt som beskrivs i avsnitt 3.
- Överföra 500 µL av neutraliserat kollagen jag lösningen på en kyld 30-mm petriskål med en 10 mm glas-bottenlocket eller en väl fyra-bra platta.
Obs: Det är viktigt att hålla alla reagenser på is för att förhindra snabb och ojämn polymerisation av kollagen som jag. - Snabbt överföra cochleae eller utricles till neutraliserat kollagen jag lösning och justera organ till sin önskade positioner med en steril hår kniv18 eller ett par fina pincett.
Obs: Kollagen I polymerisation blir märkbar efter 1-2 min som lösningen blir grumlig. - Efter lösningen runt vävnaden har polymeriserat, placera petriskål eller i 20 min plattan på fyra brunnar vid 37 ° C i en vävnadskultur inkubator gasade med 5% koldioxid att säkerställa fullständig polymerisation.
- Tillsätt 3 mL odlingsmedium som kompletteras med 0,5% fetalt bovint serum (FBS) per petriskål eller 500 µL per brunn fyra-well platta samma medium. Upprätthålla kulturen vid 37 ° C i en vävnadskultur inkubator gasade med 5% koldioxid. Om så önskas komplettera odlingsmedium med 10 µM 5-ethynyl-2´-deoxiuridin (EdU) att märka prolifererande celler.
Obs: Högre FBS koncentrationer kan användas om så önskas.
5. viral injektioner i tredimensionella kulturerna i vestibulära och auditiv sinnesorgan
- Avfrostning önskad viruset på is och blanda med trypan blå lösning i ett 0,5 mL koniska rör för att uppnå en slutlig dye koncentration på 0,05%. Använd 10-20 x färgämne för att undvika betydande utspädning av viruset. Hålla på is.
Obs: Adenovirus serotyp 5 fungerar bäst för att infektera stödjande celler i utricle19, medan adeno-associerade virus Anc80 kan infektera både hårcellerna och stödja celler i utricle och snäckan21. - Bryta ett glas nålspetsen beredd på en mikropipett avdragare med rena fina pincett medan du observerar det på högsta förstoringen av en kikare dissekera mikroskopet.
Obs: Det är viktigt att optimera inställningarna på den nål avdragare. Nålar med 9 - 12 mm skaft och 20 - 30 µm öppningar fungerar bäst. - Ta bort en sensorisk-orgel kultur från inkubatorn. Fäst nålen i microinjector och fyll den med 2-3 µL av färgämne och virus blandning. Förväg nålen till den sensoriska orgeln medan du observerar det under den kikärten dissekera mikroskopet.
- Försiktigt köra nålspetsen genom mesenkymala och epitelial skikt av taket på en tredimensionell utricular kultur. Injicera viral blandningen tills hålrum av de utricle och ampullae fylla med det blå färgämnet.
Obs: Eftersom det ger lätt tillgång till sensoriska organ, är en 10 mm glas-botten petriskål optimal för injektioner. - Inkubera vid 37 ° C i en vävnadskultur inkubator gasade med 5% koldioxid.
Obs: När grön eller röd fluorescerande protein används i den virala bygga, är fluorescensen uppenbara 24 h efter viral transduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vestibulära och auditiv sinnesorgan från embryonala öron, odlade i 40-Pa kollagen geler härma låg styvhet embryonala villkor11, behålla relativt normala tredimensionella strukturer (figur 1) och underhålla hårcellerna och stödja celler (figur 2 och figur 3). Även om stödja cell densiteten minskar med över 30% (Students t -test: n = 4, p < 0,004) och hår cell densiteten minskar med 60% (Students t -test: n = 5, p < 0,0001) efter 3 dagar i utricular kulturer (figur 2 ), området av gula fläcken mer än fördubblas under samma period av tid11 (n = 3, p = 0,0002). Detta visar att metoden för tredimensionella kultur beskrivs här möjliggör en betydande ökning av antalet av stödjande celler11, bibehållen 80% av befintliga hårcellerna i utricle över en 3-dagarsperiod. I tredimensionella kulturer etablerat från E14.5 cochlean, skilja Sox2-positiv stamceller som morfologiskt distinguishable rader av inre och yttre hårceller efter 3 dagar i kultur (figur 3).
Genuttryck kan manipuleras i tredimensionella kulturerna i vestibulära och auditiv sensoriska organ med hjälp av virusinfektion. 4hydroxytamoxifen läggs till odlingsmediet till etiketten stödja celler i de cochlear bladsticklingar etablerat från E15.5 embryon från Lfng-CreERT2/tdTomato möss17. Injektion av adenovirus typ 5 i lumen av kultur resultaten i infektion av stödjande celler vid orgelns bas (figur 4A). Injektion av samma virus i lumen av utricular kultur etablerade från E17.5 embryo, resultat framförallt infektion av stödjande celler i hela det sensoriska epitelet (figur 4B).
Figur 1. Schematiskt diagram av dissektioner och ljus-mikroskopiska bilder av representativa kulturer av utricle och snäckan i tredimensionella kollagen jag geler. (A) A Schematisk ritning skildrar de sensoriskt epitel (grön) av de sex receptor organen av murina innerörat. De röda linjerna avgränsa de nedskärningar som infördes under dissektion av ett utricle och snäckan. (B) ljusmikroskopi bilder skildrar den E17.5 utricle (övre panelen) och E14.5 snäckan (nedre panelen) inbäddad i kollagen I gel och odlade för 48 h. De skala staplarna representerar 100 µm. Denna siffra har ändrats från Gnedeva et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Hår och stödjande celler i tredimensionella utricular kulturer. (A) Confocal-mikroskopiska bilder skildrar en E18.5 utricle före explantation (översta paneler) och efter 3 dagar i en tredimensionell kultur i 40-Pa kollagen jag gel (bottenpaneler). Hårcellerna är märkta för Myo7A (grön) och stödja celler för Sox2 (röd). Skalstapeln representerar 50 µm. (B) kvantifieringar av stödjande cell tätheter (röda staplar), hår cell tätheter (gröna staplar) och macular områden (grå staplar) i E18.5 utricles före explantation och efter 3 dagar i tredimensionella orgelkultur är representerade som betyder ± SEMs (p < 0,001 representeras som ** och p < 0,0001 som ***). Denna siffra har ändrats från Gnedeva et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Hår och stödjande celler i tredimensionella cochlear kulturer. Confocal-mikroskopiska bilder skildrar en E14.5 snäckan före explantation (översta paneler) och efter 3 dagar i en tredimensionell kultur i 40-Pa kollagen jag gel (bottenpaneler). Myo7A - och Sox2-positiva inre hårcellerna (IHC) och yttre hårceller (OHC) visas i 4-5 rader efter 3 dagar i kultur. Stödjande celler är också märkta för Sox2 (röd). Skalstapeln representerar 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa resultat av virusinfektioner i tredimensionella orgel kulturer av cochlean och utricle. (A) injektion av adenovirus serotyp 5 in tredimensionella cochlear kulturer grundades infektion (GFP, gröna) av stödjande celler (tomat, röda) vid basen av orgeln från Lfng-CreERT2/tdTomato26 E15.5 embryon resultat. Det sensoriska epitelet är avgränsad i grått. Skalstapeln representerar 100 µm. (B) en identisk injektion i en tredimensionell utricular kultur etablerat från ett E17.5 embryo resulterar i infektion (GFP, grön) av stödjande celler (Sox2, röd) i hela orgeln. Det sensoriska epitelet är avgränsad i grått. Skalstapeln representerar 100 µm. Denna siffra har ändrats från Gnedeva et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De molekylära signaler som medla tillväxt och differentiering i innerörat under utveckling har studerats ingående5,6,7,8,9,10. Bevisning som erhållits från utricular modell systemet tyder dock på att mekaniska ledtrådar, kände igenom cellen korsningar och aktivering av Hippo signalering, också spela en viktig roll i dessa processer2,11, 22. Dessutom både extrudering av döende hårcellerna från sensoriska epitelet och efterföljande bildandet av nya sensoriska receptorer genom transdifferentiation kan påverka den mekaniska kraft som kände av återstående stödja celler, orsakar dem att återinträda cellcykeln under regenerering. Tredimensionella kultur systemet beskrivs här innebär en experimentell att utreda både rollen av mekanisk kraft tillväxt kontroll under innerörat utveckling11 och, eventuellt, samma kraft under hår cell roll förnyelse. Dessutom metoden underlättar virusinfektion som ger en metod för att ändra genuttryck i sensoriska epitelet, således tillåter en kombination av mekaniska och molekylär manipulationer för utredning av tillväxt och förnyelse i den örats sinnesorgan11.
Begränsningar i metoden avser minimal information tillgänglig på endogena krafter och mekaniska stimuli under innerörat embryogenes. Mätningar av vävnad stelhet i utvecklingsländer innerörat existerar inte enligt vår kännedom; Därför är det svårt att uppskatta vilken stelhet av kollagen jag gel motsvarar i vivo villkor. Våra observationer och modell föreslår att den kraft som motsatta tillväxten av utricle är låg initialt och ökar när orgeln närmar sig sin slutliga storlek11. Vi bygger därför på att en kollagen jag gel utan kondrocyter är ett fysiologiskt relevanta substrat där kultur embryonala vestibulära och auditiv sinnesorgan.
Den tredimensionella kultur-metod som beskrivs här inducerar bildandet av nya stödjande celler i utricular gula fläcken11, bibehållen också över 80% av hårceller efter 3 dagar i kultur (figur 2). Metoden, därför representerar ett överlägset alternativ till tvådimensionella kulturer av utricle, där endast 40-50 procent av hårcellerna överleva efter de första 24 h i kultur5,8och kan användas för att studera hår cell sårbarheter och Regeneration in vitro.
Även om vi demonstrera bildandet av anatomiskt distinguishable organiserade rader av inre och yttre hårcellerna i den odlade organ of Corti, krävs mer arbete för att avgöra om den tredimensionella kultur-metod som beskrivs här stöder normala Cochlear kanalen töjning under processen konvergent förlängning (CE)23,24,25. CE är en mycket dynamisk process som involverar cell migration, omflyttning och cell-cell kontakt förändringar26 som sannolikt kommer att påverkas av den yttre kraft som produceras av de vävnader som omger utveckla cochlear kanalen. Denna metod bevarar relativt normal tredimensionella vävnad arkitekturen, och skulle kunna vara fördelaktigt för studiet av CE i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr A. Jacobo, Dr. J. Salvi och A. Petelski för deras bidrag till den ursprungliga forskningen som detta protokoll baseras. Vi tackar också J. lamor och W. Makmura för tekniskt bistånd och djurhållning. Vi erkänner NIDCD utbildning grant T32 DC009975, NIDCD bevilja R01DC015530, Robertson terapeutiska utvecklingsfonden och stiftelsen Caruso familj för finansiering. Slutligen, vi erkänner stöd från Howard Hughes Medical Institute, som Dr Hudspeth är en utredare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , Humana Press. Totowa, N.J. 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
