Summary
Dorsal root ganglia (DRG) primaire culturen worden vaak gebruikt om te studeren fysiologische functies of pathologie-gerelateerde gebeurtenissen in de sensorische neuronen. Wij tonen hier, het gebruik van lumbale DRG culturen te detecteren het vrijkomen van neurotransmitters nadat neuropeptide FF receptor 2 stimulatie met een selectieve agonist.
Abstract
Dorsal root ganglia (DRG) bevatten cel organen van de sensorische neuronen. Dit type van neuron is pseudo-unipolaire, met twee axonen die perifere weefsels, zoals huid, spier en viscerale organen, alsmede de spinale dorsale Hoorn van het centrale zenuwstelsel innervate. Sensorische neuronen zenden somatische sensatie, met inbegrip van de aanraking, pijn, thermische en proprioceptieve sensaties. Daarom worden DRG primaire culturen veel gebruikt om te studeren de cellulaire mechanismen van Nociceptie, fysiologische functies van de sensorische neuronen, en neurale ontwikkeling. In studies waarbij electrofysiologie, signaaltransductie, neurotransmitter release of calcium beeldvorming kunnen de beschaafde neuronen worden toegepast. Met DRG primaire culturen, wetenschappers kunnen cultuur gedissocieerde DRG neuronen als u wilt controleren van biochemische veranderingen in één of meerdere cellen, het overwinnen van veel van de beperkingen die zijn gekoppeld aan in vivo experimenten. Ten opzichte van commercieel zijn beschikbare DRG-hybridoma cellijnen of vereeuwigd DRG neuronale cellijnen, de samenstelling en eigenschappen van de primaire cellen veel meer vergelijkbaar met de sensorische neuronen in weefsel. Vanwege het beperkt aantal gekweekte DRG primaire cellen die geïsoleerd uit een enkel dier worden kunnen, is het echter moeilijk uit te voeren van high-throughput schermen voor drug targeting studies. In het huidige artikel, worden procedures voor het verzamelen van de Deutsche Reichsbahn en cultuur beschreven. Daarnaast tonen we de behandeling van gekweekte DRG cellen met een agonist van neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) voor het opwekken van de release van peptide neurotransmitters (calcitonine-gen-gerelateerde peptide (CRGP) en stof P (SP)).
Introduction
De organen van de cel van de sensorische neuronen bevinden zich in de Deutsche Reichsbahn. Deze neuronen zijn pseudo-unipolaire en innervate zowel perifere weefsels en het centrale zenuwstelsel. De perifere zenuwuiteinden van de sensorische neuronen zijn gevonden in de spier, huid, viscerale organen en bot, onder andere weefsels. Zij zenden perifere sensatie signalen aan de zenuw uitgangen in de spinale dorsale hoorn en de signalen worden vervolgens doorgestuurd naar de hersenen via verschillende oplopende trajecten voor somatische sensatie1,2. Somatische sensatie maakt het lichaam te voelen (dat wil zeggen, aanraking, pijn en thermische gewaarwordingen) en het waarnemen van verkeer en ruimtelijke oriëntatie (proprioceptief sensaties)1,3. Er zijn vier subklassen van primaire afferent axonen, met inbegrip van groep I (Aα) vezels die inspelen op de proprioceptie van skeletspieren, groep II (Aβ) vezels die inspelen op de mechanoreceptors van de huid, en groep III (Aδ) en groep V C vezels die inspelen op de pijn en temperatuur. Alleen de C vezels zijn unmyelinated, terwijl de rest zijn myelinated op verschillende graden.
Nociceptors zijn de primaire sensorische neuronen, die worden geactiveerd door schadelijke stimuli (mechanische, thermische en chemische stimulatie) die potentieel voor weefselschade dragen. Deze neuronen zijn samengesteld uit myelinated Aδ vezels en unmyelinated C vezels1,4. De vezels van de Aδ express de receptoren voor zenuw groeifactor (NGF, trkA receptor), CGRP en SP. De C-vezels worden geclassificeerd als ofwel peptidergic en niet-peptidergic C-vezels. Aan de andere kant, express de niet-peptidergic C vezels de receptoren voor gliale-afgeleide neurotrophic factor (GDNF, RET en GFR-receptoren), isolectin IB4 en ATP-gated ion kanaal subtype (P2X3)5,6,7. Nociceptors kan onderscheiden door de expressie van ionenkanalen en geactiveerd door neurotrophic factoren, cytokines, neuropeptides, ATP of andere chemische verbindingen8. Bij stimulatie, worden neurotransmitters, waaronder CGRP, SP en glutamaat vrijgesteld van sensorisch neuron terminals in de spinale dorsale hoorn voor het verzenden van Nociceptieve signalen2. Deutsche Reichsbahn zijn niet alleen bestaat uit neuronen, maar bevatten ook satelliet gliacellen. Satelliet cellen rondom de sensorische neuronen en bieden ondersteuning voor mechanische en metabole9,10. Interessant, is er een groeiend lichaam van aanwijzingen waaruit blijkt dat satelliet gliale cellen in de DRG kunnen worden betrokken bij de regulering van pijn sensatie11.
Sensorische neuronen zijn bij de meest vaak gebruikte primaire neuronale cellen12 en hebben gebruikt voor electrofysiologie, signaaltransductie en neurotransmitter release studies gemeld. Ze worden ook vaak gebruikt om te verkennen van de cellulaire mechanismen van neuronale ontwikkeling, inflammatoire pijn, neuropathische pijn, gevoel van de huid (zoals jeuk) en axon uitgroei12,13,14,15. Deutsche Reichsbahn primaire culturen kunnen worden gekweekt als gedissocieerde neuronen te beoordelen van biochemische veranderingen in één of meerdere cellen, zodat wetenschappers voor het uitvoeren van studies die in experimentele onderwerpen kunnen niet worden uitgevoerd. Onlangs, DRG werden met succes gekweekt uit menselijke orgaandonoren die misschien veel profijt hebben van translationeel onderzoek16. Aan de andere kant, kunnen sensorische neuronen ook worden gekweekt zoals DRG explants. De DRG explantaten behouden de oorspronkelijke architectuur van het weefsel van de neuronen, met inbegrip van cellen van Schwann en satelliet gliale cellen, en zijn met name nuttig zijn te onderzoeken van interacties tussen neuronale en non-neuronale cellen17. Deutsche Reichsbahn primaire culturen kunnen gemakkelijk worden voorbereid binnen 2,5 uur. De cel samenstelling en eigenschappen zijn weerspiegelend van de bron van de Deutsche Reichsbahn, en als zodanig, specifieke DRG (lumbale of thoracale DRG) kan worden verzameld volgens experimentele eisen. Culturen van embryonale en neonatale DRG neuronen vereist NGF om te overleven en induceren axon uitgroei, maar culturen van volwassen neuronen vereisen niet de toevoeging van neurotrophic factoren de media12,17. Er zijn ook commercieel beschikbare DRG-hybridoma cellijnen zoals ND7/23 en F11, die niet dat het gebruik van proefdieren eisen. Echter het gebrek aan de potentiële catie van voorbijgaande receptor onderfamilie V lid 1 (TRPV1) kanaal expressie (een belangrijke marker voor kleine zintuiglijke Nociceptieve neuronen) en elkaar gene expressieprofielen beperken hun toepassingen-18. Onlangs, vereeuwigd DRG neuronale cel lijnen zijn afgeleid van de rat (50B11)19 en muis (MED17.11)20, die geschikt zijn voor gebruik in high-throughput schermen voor drug targeting studies. Genexpressie profilering voor deze cellijnen moet echter nog worden uitgevoerd. De experimenten van de validatie vergelijken deze vereeuwigd cellen te sensorische neuronen zijn dus nog aan de gang.
NPFFR2 wordt gesynthetiseerd in de DRG en translocated aan op de ingangen van de sensorische zenuw in de spinale dorsale hoorn21. In dit artikel bieden wij een protocol voor het kweken van lumbale DRG-cellen en hen te behandelen met een agonist van NPFFR2 voor het opwekken van de vrijlating van neurotransmitters, CGRP en SP. De afhankelijkheid van NPFFR2 is verder getest met behulp van NPFFR2 Klein Mengend RNA (siRNA), die kan zijn transfected in de gekweekte cellen van de Deutsche Reichsbahn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hierin beschreven methoden die gebruikmaken van proefdieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruiken Comité (IACUC) van Chang Gung Universiteit (CGU 13-014).
1. Verzamel lumbale DRG van experimentele ratten
- 2 tot 3 weken oude Sprague-Dawley (SD) ratten voor lumbale DRG-collectie gebruiken
Opmerking: DRG neuronen van ratten verzameld van meer dan 4 weken oud groeien niet goed onder de voorwaarden van de cultuur die hierin worden beschreven. - Alle chirurgische instrumenten in een autoclaaf steriliseren.
- Anesthetize van de rat met een 1:1 mengsel van tiletamine en zolazepam (20 mg/kg; intraperitoneale injectie (IP)) en wacht totdat het dier geen reactie van voet-intrekking in een teen-snuifje-test toont.
Opmerking: Verschillende verdoving strategieën kunnen worden gebruikt met succes in dit protocol. - Offeren de rat door onthoofding met een commerciële guillotine.
- Gebruik de guillotine te isoleren van de romp van het lichaam van de rat tussen de voorpoot en dijbeen. Zie figuur 1A voor een diagram van de regio te verzamelen.
Opmerking: De caudal gesneden regel moet gewoon rostraal van het dijbeen. De lumbale L6-DRG zal worden verwijderd als de gesneden site te hoog in de wervelkolom is. - Snij langs het borstbeen en verwijder alle organen/weefsels met een dissectie schaar (figuur 2A-a).
- U snijdt langs de kant van de kofferbak te verzamelen van het dorsale deel van de rat en het verwijderen van de huid. Zie figuur 1B voor een foto van de ontleed dorsale stam.
- Het weefsel op ijs bereiden vóór het verzamelen van de Deutsche Reichsbahn. Reinig de bont en bloed van handschoenen en steriliseren hen met 75% ethanol voordat u verdergaat met de volgende stap.
- Verwijder de spieren die betrekking hebben op de lumbale wervelkolom. Controleer eerst twee sneden langs de zijkanten van de wervelkolom (links en rechts) en een laterale knippen ter gelegenheid van de rostraal omvang van de lumbale wervelkolom. Verwijder vervolgens de dorsale spieren van de wervelkolom met een bot snijden Tang (figuur 2A-b).
- Verwijder het dorsale gedeelte van de wervels met bot snijden pincet en bloot van het ruggenmerg.
- Het verwijderen van het ruggenmerg met een dissectie schaar (figuur 2A-c) en pincet (figuur 2A-d).
- De lumbale DRG identificeren door te tellen vanaf de laatste rib (Thoracic Vertebra 13) wervels. Zie Figuur 1 c voor een diagram van de posities van de wervels.
- De bilaterale lumbale DRG (L1-L6) met micro-schaar (figuur 2A-f) in een 35-mm cultuur schotel met 2 mL ijskoud serumvrij medium verzamelen. Verwijder de neuronale vezels (zoals aangegeven in Figuur 1 c) uit het aansluiten van de Deutsche Reichsbahn en breng dit in de cultuur-schotel ter verbetering van de zuiverheid van de culturen.
Opmerking: De verzamelde DRG kan worden gehouden in medium op het ijs gedurende ongeveer 1 uur. Ondertussen kunnen meerdere ratten worden euthanized om te maken een grotere pool van de Deutsche Reichsbahn.
2. primair cultuur van Rat Lumber DRG
Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.
- Bereiden kweekmedium dat 10% foetale runderserum, 100 mM natrium pyruvaat en 1 x penicilline/streptomycine in 1 x DMEM-F12.
- Jas de celcultuur behandeld 24-well plaat met 200 µg/mL poly-L-lysine voor 2 h dan wassen met gesteriliseerd water.
- De cultuur-schotel met 1 mL gestolde voedingsbodem in een 37 ° C CO2 incubator vóór gebruik gedurende ten minste 30 minuten vooraf uit te broeden.
- De DRG-bevattende 35 mm schotel overboeken naar een laminaire kap, en wassen van de DRG met serumvrij medium 3 keer Pipetteer.
Opmerking: De buitenkant van de schotel moet worden gereinigd met 75% ethanol voordat overgeplaatst naar de kap. De 35 mm-schotel kan DRG uit een aantal ratten (dit zal afhangen van de eisen van de proefopzet) bevatten. - Verplaatsen van de Deutsche Reichsbahn (uit een enkele rat of gecombineerd uit meerdere ratten) naar een nieuwe schotel voor de cultuur van de 35 mm, waarin 2 mL van collagenase type IA (1 mg/mL in serumvrij medium) met een steriel pincet (figuur 2A-e).
Opmerking: De collagenase oplossing moet worden gesteriliseerd door het passeren van een 0,22 µm spuit filter. - Het verteren van de DRG in de collagenase oplossing in een 37 ° C CO2 incubator voor 30 min.
- Verwijder de collagenase oplossing en wassen de DRG 3 keer in 2 mL Hank evenwichtig zoutoplossing (HBSS).
Opmerking: Kan er resterende vezels of weefsels die uit de DRG in de oplossing komen. Pipetteer met het wassen-oplossing verwijderen. - Voeg toe 2 mL opgewarmd vooraf trypsine-EDTA 0,05% in de DRG-bevattende 35 mm schotel en verteren de DRG in een 37 ° C CO2 incubator voor 30 min.
- De 2 mL van oplossing DRG-bevattende overbrengen in een centrifugebuis 15 mL door glazen pipet.
Opmerking: De DRG zou vasthouden aan de glazen pipet dus deze stap moet met zorg worden uitgevoerd. Deutsche Reichsbahn verlies kan worden vermeden door het bijhouden van de DRG-bevattende oplossing in de taps toelopende einde van een glazen pipet (ongeveer 0,5 mL) en het overbrengen van de oplossing in de centrifugebuis langzaam maar zonder pauze. - Centrifugeer de oplossing bij 290 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en een ander 2-mL serumvrij medium om resuspendeer de DRG toevoegen.
- Herhaal stap 2.10 2 keer maar verandering de middellange serumvrij cultuurmedium voorverwarmde op de laatste tijd.
- Handmatig triturate de DRG ongeveer 60 keer met behulp van een pipet Pasteur vlam-gepolijst (lengte 230 mm en tip hoofd inwendige diameter 1 mm). Zie figuur 2B voor een foto van de opening van een vlam-gepolijst Pasteur pipet om een niet-gepolijst pipet te vergelijken.
Opmerking: De binnen diameter van de vlam-gepolijst Pasteur Pipet is ongeveer 10% kleiner dan de controle pipet en de binnenkant van het tapse einde moet soepeler. Wees voorzichtig niet te maken bellen wanneer de cellen triturating. - Verwijder de poly-L-lysine-coated schotel uit de CO2 incubator. Gecombineerd bebroede voedingsbodem van de schotel en zaad van de gedissocieerde cellen op de gecoate schotel.
- Zaad van de DRG cellen van een rat (bilaterale collectie van L1-L6, voor 12 totale DRG) in vier putjes van de plaat van een 24-well; Er zijn ongeveer 5 x 104 cellen in één putje van de plaat van een 24-well.
Opmerking: Deze dichtheid is geschikt voor de opsporing van de vrijgegeven CGRP of SP en ook geschikt voor immunokleuring. Beënt de DRG cellen van een rat (bilaterale L1-L6) in één putje van de plaat van een 6-well voor westelijke vlek of RNA extractie. - Vervang het kweekmedium op de volgende dag met de toevoeging van 10 µM cytarabine (Ara-C) en 100 ng/mL NGF en vernieuwen van het medium daarna om de twee dagen.
Opmerking: De thoracale DRG ook kan ook worden gekweekt door dit protocol, als zij verzameld van de thoracale wervelkolom zijn.
3. de transfectie van NPFFR2 siRNA in DRG cellen
- Uitvoeren van de transfectie van NPFFR2 siRNA en controle van siRNA volgens protocol van de fabrikant.
Opmerking: Het protocol moet worden aangepast als de gekozen transfectiereagens is anders dan degene die we gebruikt (Zie de Tabel van de materialen). - Op dag 3 na cel plating, als u het medium op 0,5 mL pre warme serumvrij gemiddeld en de DRG in een 37 ° C CO2 incubator voor 1 h uit te broeden.
- Toevoegen van 50 nM van siRNA (in 1 µL RNase-gratis water) in 12,5 µL serumvrij middellange.
- 2.5 µL transfectiereagens toevoegen tot 10 µL van de serum-vrij van het medium.
- Meng de oplossing van stap 3.3 en 3.4 door Pipetteer en incubeer deze gemengde transfectie oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg de transfectie oplossing in één DRG-bevattende 24-well plaat en meng de oplossing met medium door zacht te schudden.
Opmerking: Meerdere oplossingen van de transfectie moeten worden ingezet op hetzelfde moment als meerdere wells nodig om te zijn transfected. - Incubeer de DRG in een 37 ° C CO2 incubator voor 6 uur.
- Voeg 0,5 mL/goed kweekmedium bevattende 20% foetale runderserum, 100 mM natrium pyruvaat en 1 x penicilline/streptomycine in 1 x DMEM-F12, met de toevoeging van 10 µM Ara-C en 100 ng/mL NGF, in de 24-well-plaat.
- Incubeer de DRG in een 37 ° C CO2 incubator voor een ander 66 h (refresh het medium bij 48 h).
4. vrijlating van Neurotransmitters uit primaire DRG cellen
- Op dag 6 na cellen werden verguld (72 uur na de siRNA transfectie), te wijzigen in het kweekmedium 200 µL serumvrij normaal en Incubeer de cellen in een 37 ° C CO2 incubator voor 30 min.
- Voeg 1 µL stimulatie chemical(s) en meng voorzichtig de media door pipetteren. Incubeer de schotel in een 37 ° C CO2 incubator voor de aangewezen tijd.
Opmerking: In dit artikel de gekweekte cellen werden gestimuleerd met de NPFFR2-agonist, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2, 5 nmol), gedurende 1 uur. - Het kweekmedium ophalen op de cultuur schotel en centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot een zwevende onzuiverheden te verwijderen.
- De bovendrijvende vloeistof van het centrifugeren verzamelen en verdunnen van de monsters met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), zo nodig. -Test op het niveau van neurotransmitters met enzyme-immunoassay (EIA) kits.
Opmerking: Hier, het supernatant waren verdunde 1:100 voor het analyseren van de hoeveelheid CGRP. De bovendrijvende substantie was niet verdund voor het analyseren van het niveau van de SP.
5. CGRP en SP EIA
- Analyseer de monsters onmiddellijk volgens protocol van de CGRP of SP EIA kit van de fabrikant.
Opmerking: Het protocol zal variëren afhankelijk van de kit gebruikt. - Spoel de CGRP EIA putten 5 keer met was buffer bij de kit geleverd.
- Voeg 100 µL monsters met 100 µL anti-CGRP acetylcholinesterase (AChE) tracer in de putjes CGRP EIA, en voeg 50 µL monsters, 50 µL anti-SP AChE tracer en 50 µL anti-SP antiserum in de SP EIA-putten.
- Verzegel de CGRP en SP putjes met plastic folie die bij de kits is geleverd.
- Incubeer de putjes 's nachts bij 4 ° C.
- Was de putjes goed 5 keer met CGRP of SP wassen buffer en verwijder alle de resterende oplossing uit de putten.
- Voeg 200 µL Ellman van reagens in de CGRP of SP putten die bij de overeenkomstige EIA-kits is geleverd.
- Incubeer de CGRP putten gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, en de SP putten gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur incuberen. De putjes beschermen tegen licht voor beide testen.
- Lees de platen bij golflengte 414 nm en de resultaten volgens de overeenkomstige EIA-instrument te berekenen.
Opmerking: Raak de bodem van de putten met de hand de allertijden en schoon het water vlekken van goed onder door lens schoonmaak doekjes voor het toevoegen van de Ellman reagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rat lumbale DRG neuronen, gekweekt in een 24-well plaat, zijn geteeld in een kweekvloeistof met extra Ara-C voor de remming van gliale celproliferatie en NGF neuronale groei te ondersteunen. De morfologie van levende cellen van de DRG werd waargenomen. Zoals blijkt uit Figuur 3, was de cel lichaam van een enkel neuron aangesloten op de bodem van een schotel op dag 1 en geselecteerd voor observatie. Axon groei werd gecontroleerd vanaf dag 1 – 3. De gliacellen gedupliceerd en processen om te omringen de cel lichaam van het sensorisch neuron uitgebreid. In een andere cultuur, werd CGRP eiwit gekleurd te onthullen van de vorm van neuronen. In Figuur 4weergegeven CGRP eiwit kleuring in het cytoplasma en axonen van de sensorische neuronen. De nucleaire morphologies van zenuwcellen en gliacellen zijn verschillend wanneer gekleurd met DAPI. De neuronen hebben de kern van een grotere en meer afgerond dan gliacellen. Ter vergelijking: de kernen van glia zijn meer ovaal (figuur 4B).
De selectieve agonist van de NPFFR2, dNPA, werd gebruikt om te stimuleren het vrijkomen van CGRP en SP. Bovendien is de afhankelijkheid van dNPA-gestimuleerd neurotransmitter release van NPFFR2 werd getest door transfecting cellen met NPFFR2 siRNA. NPFFR2 siRNA of besturingselement siRNA zijn transfected in de primaire DRG cellen 72 h voorafgaand aan de behandeling van de agonist. Deutsche Reichsbahn cellen werden behandeld met dNPA (5 nmol) voor 1 h en de vrijlating van CGRP en SP werd gemeten door afzonderlijke EIA kits. De simulatie van de DRG met dNPA verhoogd het niveau van CGRP en SP in de media (figuur 5A, B). Pas de dNPA-geïnduceerde CGRP release werd echter geremd door expressie van NPFFR2 siRNA in gekweekte cellen van de Deutsche Reichsbahn. De resultaten afgebeeld in Figuur 5 werden aangepast ten opzichte van een eerdere publicatie en hier worden gebruikt met toestemming22.
Figuur 1: weefsel verwerking diagrammen. Lumbale DRG worden bijeengezocht uit 3 weken oude ratten. (A) de posities waar de guillotine moet worden gebruikt voor het knippen van het dier worden aangegeven door stippellijnen. (B) de dorsale stam met huid verwijderd en (C) de locaties van lumbale DRG (van L1-L6) worden weergegeven. De insert vertegenwoordigt de DRG- en de aansluitende vezels (die worden aangegeven door de pijlen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: speciale apparatuur die nodig is voor het isoleren van de DRG primaire culturen. (A) chirurgische instrumenten gebruikt in de collectie van de Deutsche Reichsbahn. Van links naar rechts: (een) dissectie schaar (groot), (b) bot snijden pincet, (c) dissectie schaar (kleine), (d, e) punt pincet en (f) micro-schaar. (B) een gewone Pasteur pipet en een pipet Pasteur vlam-gepolijst. "a" duidt de binnen diameter van regelmatige Pipet van Pasteur, en "b" geeft de binnenkant diameter van de vlam-gepolijst Pasteur pipet. b / a ≒ 0.9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: de morfologie van levende cellen van de Deutsche Reichsbahn. Levende DRG cellen werden gecontroleerd door microscopie. Cellen worden weergegeven (A) een dag na het zaaien, (B) twee dagen na het zaaien, en (C) drie dagen na het zaaien. Pijlen geven neuron en pijlpunten geven glia. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: immunokleuring van gekweekte cellen van de Deutsche Reichsbahn. Deutsche Reichsbahn cellen waren immunostained met anti-CGRP antilichaam om te laten zien van neuronen, en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) voor de kernen van zenuwcellen en gliacellen. (A) CGRP eiwit kwam tot uitdrukking in het sensorisch neuron cel organen en axon vezels. (B) kernen van neuronen en glia werden gekleurd met DAPI. (C) samengevoegde afbeelding van A en B. pijl duidt een neuron en pijlpunt duidt een gliale cel. Schaal bar = 30 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: het vrijkomen van neurotransmitters uit gekweekte cellen van de Deutsche Reichsbahn. De selectieve agonist van de NPFFR2, dNPA, werd gebruikt om te stimuleren het vrijkomen van CGRP en SP uit DRG culturen. De afhankelijkheid van de neurotransmitter release van NPFFR2 werd gecontroleerd door de transfecting cellen met NPFFR2 siRNA. (A en B) na DRG cellen werden transfected met NPFFR2 siRNA of niet-gericht op controle siRNA (72 h), dNPA (5 nmol) 1 h voor het opwekken van de release van CGRP werd aangevraagd en SP. gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) en werden geanalyseerd door t wo-weg variantieanalyse (ANOVA) met Bonferroni post hoc test. p < 0,01, ***p < 0,001; in vergelijking met de overeenkomstige besturingselementen van het voertuig (N = 12 per groep). Panelen A en B zijn gewijzigd van Lin et al. 22 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel, tonen we de collectie enzym-dissociatie en de cultuur van rat lumbale DRG. Met de steun van de neurotrophic van de NGF uitgebreid de axonen van neuronen van de DRG binnen 3 dagen na het zaaien van de cel. De uitgebreide axonen waren duidelijk waarneembare nadat cellen werden gekleurd voor CGRP eiwit, die wordt gesynthetiseerd in de cel soma en vervoerd worden langs de axon vezels. De processen van satelliet cellen ook uitgebreid, waardoor deze scheidslijn gliale cellen te omringen de neuronen binnen dagen. De primaire cellen van de DRG gegroeid door dit protocol zijn geschikt voor onderzoek naar de cellulaire mechanismen die de sensorische neuronen reguleren. Hier, stimuleren we het vrijkomen van neuropeptides, CGRP en SP, van gekweekte DRG neuronen door een selectieve agonist van de NPFFR2, dNPA. NPFFR2 is de cognaat receptor voor NPFF en deel te nemen aan pijn sensatie en verordening trajecten22,23heeft gemeld. De NPFFR2-afhankelijkheid van CGRP en SP vrijlating werd verder gecontroleerd door het gebruik van NPFFR2 siRNA.
Deutsche Reichsbahn culturen bevatten zowel sensorische neuronen en satelliet gliacellen. De satelliet gliacellen neuronen metabole ondersteunen en onderhouden van neuronale functies9,10. In de immunokleuring foto's, het is gemakkelijk te identificeren van de zenuwcellen en gliacellen, aangezien hun kernen zijn anders van vorm (Toon in figuur 4B). Het bestaan van de satelliet cellen in de cultuur-schotel zou worden problematisch als er een experimentele vraag onderscheid maken tussen de specifieke functie van neuronen en glia. Bijvoorbeeld, is het onmiskenbaar dat satelliet cellen bij de ontwikkeling en het onderhoud van pijn11,24 betrokken zijn, en in sommige studies, de acties van zenuwcellen en gliacellen zou moeilijk te onderscheiden met behulp van de DRG culturen.
In dit protocol zijn er een paar essentiële stappen die extra voorzichtigheid vereist. Eerst, aangezien de DRG worden verzameld buiten de laminaire kap, extra zorg moet worden genomen tijdens het proces van het verzamelen van weefsel te voorkomen van de cel. Moet er geen behoefte aan het maken van een steriele ruimte, net als in een menselijke chirurgische kamer, maar sterilisatie van het instrument en een schone operationele ruimte zijn essentieel. Tips om verontreiniging te voorkomen zijn houden de gesteriliseerde instrumenten op het zakje sterilisatie wanneer niet in gebruik en het vermijden van het raken van alle overbodige items. Ook, contaminerende organismen mogen vervoerd worden op bont dat aan de rat lichaam boomstam of handschoenen houden kan. Bont en bloedvlekken op handschoenen moeten als zodanig worden verwijderd door reiniging met 75% ethanol. Het is ook nuttig voor de exploitant om het dragen van een chirurgisch masker om te voorkomen dat de overdracht van organismen uit de adem of speeksel. Bovendien, de 35-mm schotel moet gesloten blijven te allen tijde en alleen geopend wanneer plaatsen ontleed DRG binnen. Het is belangrijk om de 35 mm-schotel vervangen door een nieuwe schotel voordat enzym spijsvertering. Tijdens de spijsvertering van het enzym, doen niet uit te breiden de incubatietijd, aangezien overmatige spijsvertering schade aan de neuronen veroorzaken kan. Zorg ervoor dat vooraf de trypsine-EDTA tot 37 ° C warm met het oog op de efficiëntie van de juiste spijsvertering. De efficiëntie drastisch zal worden verminderd in lagere temperaturen en het zal moeilijk zijn om een enkele celsuspensie bereiken wanneer de DRG triturating vlam-gepolijst Pasteur Pipetteer. Vlam polijsten de pipet zal de opening glad en verhinderen dat de scherpe glazen rand verwonden van de neuronen. Oververhitting van de pipet met een vlam echter zal de binnenkant diameter te klein, en weefsel - of cel-bevattende oplossing zal moeilijker te passeren. Deze kleinere diameter kan ook leiden tot veel bubbels te vormen tijdens de fase van de verpulvering, sterk verminderen van de collectable aantal DRG neuronen. Tot slot moeten de DRG culturen worden behandeld voorzichtig te allen tijde, vooral bij het wisselen van middellange of uitvoerende medicamenteuze behandeling.
De DRG neuronen worden gemeld dat de meest gebruikte primaire gekweekte neuronale cellen12. Ze kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van verschillende studies, variërend van electrofysiologie of cel biologie tot het verkennen van de functies van het fysiologische of pathologische van sensorische neuronen. De belangrijkste beperking van de DRG primaire culturen is dat ze niet geschikt voor high-throughput screening. Het aantal cellen die kunnen worden verzameld van de Deutsche Reichsbahn van een enkele rat zijn beperkt, en de neuronen zijn niet in staat om te dupliceren in cultuur. Vanwege de beperkte celaantal, zijn verschillende DRG-hybridoma cellijnen of vereeuwigd DRG neuronale cellijnen ontwikkeld ter vervanging van de primaire culturen18,19,20. Echter de eiwit expressieprofielen van DRG cellijnen mogelijk niet hetzelfde als de originele Deutsche Reichsbahn, en dus, elk modelsysteem moet zorgvuldig worden gecontroleerd. Afgezien van de cellen in het lab te isoleren, hebben rat embryonale of neonatale DRG neuronen commercieel beschikbaar gesteld zijn. Aankoop uit commerciële bronnen kan dus een levensvatbaar alternatief voor vers bereide DRG culturen.
Deutsche Reichsbahn primaire culturen hebben gebruikt voor vele jaren als een waardevolle experimentele hulpmiddel dat meestal in pijn-gerelateerde studies wordt aangenomen. Dit modelsysteem is het onwaarschijnlijk dat in de nabije toekomst worden vervangen. Met goede kwaliteit DRG neuronen kunnen wetenschappers stabiel en reproduceerbare resultaten die profiteren van de vele gebieden van studie van de neurowetenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. M. Calkins voor Engelse bewerken. Dit werk werd gesteund door de Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung Universiteit, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) en Ministerie van wetenschap en technologie (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. Neuroscience: exploring the brain. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W.
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of neural science. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
