Dorsal Root Ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de Neurotransmitter Release

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van sensorisch onderzoek te beantwoorden, zoals perifere nociception. Het belangrijkste voordeel van deze technische is dat het onderzoeken van het cellulaire mechanisme van sensorische neuronen met het model dat de meeste simuleert tot fysiologische conditie. Verzamel de lendenen rugwortel ganglia uit de stam van een twee tot drie weken oude rat.

Begin met het maken van twee sneden langs de zijkanten van de wervelkolom en een laterale snede om de rostrale omvang van de lumbale wervelkolom te markeren. Gebruik vervolgens botsnijdende tangen om de rugspieren van de wervelkolom te verwijderen. Verwijder vervolgens het dorsale gedeelte van de wervels en stel het ruggenmerg bloot.

Gebruik vervolgens dissectie schaar en tangen om het ruggenmerg te verwijderen. Identificeer de lumbale DRG door wervels van de laatste rib te tellen. Dit diagram toont de wervelposities.

Gebruik een microschaar om de 12 bilaterale lumbale DRG van L1 naar L6 te verzamelen. Verwijder alle bijgevoegde neuronale vezels om de zuiverheid van de cultuur te verbeteren. Breng elke lumbale DRG over op een 35 millimeter kweekschotel met twee milliliter ijskoud serumvrij medium. Breng de DRG-bevattende 35 millimeter schotel in een laminaire kap, en was de DRG met serum-vrij medium drie keer door pipet.

Gebruik steriele pincetten om de DRGs te verplaatsen naar een nieuwe 35 millimeter kweekschotel met twee milliliter steriele collagenase type 1A. Plaats het weefsel in collagenase oplossing in de 37 graden Celsius weefsel cultuur incubator gedurende 30 minuten om te beginnen met dissociatie van de cellen. Na de incubatie, verwijder de collagenase oplossing en was de DRG drie keer in twee milliliter van evenwichtige zout hank’s oplossing.

Voeg vervolgens twee milliliter voorverwarmde 0,05% trypsin EDTA toe aan de schotel en vert verteer de DRG in de couveuse 30 minuten zoals voorheen. Gebruik na de spijsvertering een glazen pipet om de twee milliliter DRG-bevattende oplossing over te brengen naar een 15 milliliter centrifugebuis. De DRG kan vasthouden aan de glazen pipet, zodat deze stap moet worden uitgevoerd met zorg.

Het werkelijke verlies kan worden voorkomen door de DRG-bevattende oplossing in het tappeneinde van de glazen pipet te houden en de oplossing langzaam maar zonder pauze in de centrifugebuis te brengen. Vervolgens centrifuge de oplossing op 290 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Na het centrifugeren, verwijder de supernatant en voeg nog eens twee milliliter serumvrij medium toe om de DRG opnieuw op te hangen.

Herhaal de was twee keer, met behulp van twee milliliter van voorverwarmde kweekmedium om het weefsel na de laatste centrifugatie opnieuw op te hangen. Gebruik de eerder voorbereide steriele vlam gepolijste pipet om de DRG ongeveer 60 keer handmatig te tritureren. Verwijder vervolgens een poly-L-lysine gecoate 24 putplaat met één milliliter kweekmedium per put uit de CO2-incubator.

Aspirate de geïncubeerde cultuur medium uit het gerecht. Zaad de DRG cellen van een rat in vier van de putten. Dit geeft een zaaidichtheid van ongeveer 500.000 cellen per put.

De volgende dag, vervang het kweekmedium met medium aangevuld met 10 micromolar AraC, en 100 nanogram per milliliter NGF. Verander op dag drie na celbeplating het medium tot 0,5 milliliter voorverwarmd serumvrij medium en broed gedurende een uur in. Voeg tijdens de incubatie 50 millimolar siRNA toe in één microliter RNase-vrij water tot 12,5 microliter serumvrij medium per transfectie.

Dan pipette 2,5 microliter van transfectie reagens in 10 microliter van serum-vrij medium voor elke transfectie. Meng beide oplossingen door pipet, en uitbroed deze gemengde transfectie oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 10 minuten de transfectieoplossing toe aan de putten van de DRG-bevattende 24 putplaat en meng door zachtjes te schudden.

Na een incubatie van zes uur voegt u 0,5 milliliter kweekmedium toe met 20%FBS, 10 micromolar AraC en 100 nanogram per milliliter NGF in elke put van cellen. Tot slot, inculbateren van de DRG in een 37 graden Celsius CO2 incubator voor nog eens 66 uur. Op dag zes na beplating, en 72 uur na siRNA transfection, verander het kweekmedium tot 200 microliters van serumvrij medium.

Na een incubatie van 30 minuten, voeg een microliter van de stimulatie chemische stof en voorzichtig mengen door pipetten. De NPFFR2 agonist, dNPA, en bijbehorende voertuig worden hier gebruikt. Na het uitbroeden voor de vereiste periode, verzamel het cultuurmedium van de cultuurschotel, en centrifuge bij 5000 keer G vijf minuten bij vier graden Van Celsius om om het even welke opgeschorte onzuiverheden te verwijderen.

Verzamel de supernatant uit de centrifugatie en verdun indien nodig met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Test de niveaus van neurotransmitters met commercieel beschikbare enzym immunoassay kits. Op dag één, het cellichaam van een enkel neuron aangegeven door de pijl werd bevestigd op de bodem van een schotel.

Een gliacel aangegeven door een pijlpunt is ook aanwezig. De gliacellen gedupliceerd en uitgebreid processen om het cellichaam van het sensorische neuron te omringen op dag twee, een proces dat nog prominenter was op dag drie. In een andere cultuur werd CGRP-eiwit gekleurd om de vorm van neuronen te onthullen.

CGRP eiwit kleuring verschijnt in het cytoplasma en axonen van zintuiglijke neuronen. De nucleaire morfologieën van neuronen en gliacellen zijn verschillend wanneer ze met DAPI worden gekleurd. De neuronen hebben een grotere en meer afgeronde kern dan gliacellen.

Ter vergelijking, de kernen van glia zijn meer ovaal van vorm. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in twee en een half uur als het goed wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, moet je een goed begrip van hoe te ontleden en cultuur van de dorsale wortel ganglion, en gebruik het als een instrument om onderliggende fysiologische functies te onderzoeken.

Vergeet niet dat het werken met primaire cellen kan veel moeilijker zijn dan het werken met gewone cellijnen, en zacht is altijd de beste manier bij het uitvoeren van deze procedure.