Summary
עבור במבחנה אינדוקציה של המעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT), אשר הוא שימושי עבור חוקרים הסלולר איתות המסלולים מעורב EndMT, פרוטוקול המתואר. במודל זה ניסיוני, EndMT הנגרמת על ידי טיפול עם TGF-β בתאי האנדותל MS-1.
Abstract
גמישות פנוטיפית תאי אנדותל ביסוד פיתוח מערכת הלב וכלי דם, מחלות לב וכלי דם והתנאים שונים הקשורים עם פיברוזיס איברים. בתנאים אלה, תאי אנדותל הבדיל רוכשים פנוטיפים כמו mesenchymal. תהליך זה נקרא מעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT), והוא מאופיין על-ידי downregulation של סמני אנדותל, קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal, שינויים מורפולוגיים. EndMT הנגרמת על ידי מספר איתות המסלולים, לרבות הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β, ונ ט, חריץ, ומוסדרת על ידי המנגנונים המולקולריים דומים לאלה של אפיתל mesenchymal המעבר (החובשים) חשוב עבור gastrulation, פיברוזיס רקמות, ו גרורות סרטן. הבנת המנגנונים של EndMT חשוב לפתח גישות איבחוניות מיקוד EndMT. אינדוקציה חזקים של EndMT במבחנה זו שימושית לאפיין את חתימות ביטוי גנים משותפים, לזהות את המנגנונים המולקולריים druggable להבדק מאפננים של EndMT. כאן, אנו מתארים שיטה במבחנה עבור אינדוקציה של EndMT. תאי אנדותל microvascular בלבלב עכבר MS-1 עוברים EndMT לאחר חשיפה ממושכת TGF-β ולהראות קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal, שינויים מורפולוגיים, כמו גם אינדוקציה של מספר נוגדנים דלקתיים וכן ציטוקינים. שיטות לניתוח של אפנון microRNA (miRNA) הינם כלולים גם. שיטות אלה מספקים פלטפורמה לחקור את המנגנונים שבבסיס EndMT ועל תרומתה של miRNAs כדי EndMT.
Introduction
המעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT) היא התהליך שבאמצעותו תא אנדותל הבדיל עובר מגוון שינויים מולקולריים, וכתוצאה מכך פיברובלסט דמוי תא mesenchymal1. EndMT תוארה בתחילה טרנספורמציה תא אנדותל במהלך הפיתוח של הלב2,3. בהתפתחות הלב המוקדמת, הצינור הלב מורכב endocardium הפנימי של שריר הלב החיצוני. שתי שכבות אלה מופרדים באמצעות שכבה של מטריצה חוץ-תאית, קרא את הג'לי הלב. התאים endocardial עובריים, אשר רוכשים תאי אנדותל סמנים, מעבר לתאי mesenchymal, לפלוש הריבה הלב הבסיסית, ולקדם היווצרות הכרים הלב, מתן הקרן עבור שסתומים atrioventricular ומחצה השסתומים semilunar. יתר על כן, EndMT הוצע להיות מקורות pericytes תאי השריר החלק בכלי הדם במערכות אחרות כלי דם עובריים כולל הדם הכליליים, העורק הראשי של עורק הריאה-4,-5,-6. בנוסף, הייתה שם EndMT ב האנגיוגנזה פיזיולוגיים הלבלוב7.
לצבירת ראיות הציע כי EndMT מעורבת גם מספר מחלות לב וכלי דם, מחלות אחרות,1,8. תנאים הקשורים EndMT לכלול הסתיידות כלי הדם, טרשת עורקים, יתר לחץ דם עורקי ריאתי, מום חלול, איברים פיברוזיס, שיפוץ שתל הווריד, תפקוד להשתלת השתלת כליה וסרטן8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. לאחרונה דו ח תיאר כי מספר סמנים מולקולריים EndMT יכול להיות כלי חיזוי האבחנה והפרוגנוזה של חוסר תפקוד כליות שתל כליה השתלת17. אפנון של הקשורות EndMT הסלולר איתות המסלולים הוכחו דהוא מספר תנאים המחלה כולל הלב פיברוזיס, וריד שתל שיפוץ של בעל חיים מודלים8,15. לכן, הבנת המנגנונים EndMT הבסיסי הוא חשוב לפתח אסטרטגיות איבחוניות מיקוד EndMT.
EndMT מאופיין על ידי אובדן של צמתי תא-תא, הגדלת הפוטנציאל נודדות, downregulation של גנים ספציפיים אנדותל כגון VE-קדהרין ולאחר קולטנים upregulation של גנים mesenchymal כולל שריר α-חלק אקטין (α-SMA). בנוסף, EndMT ו- mesenchymal-אפיתל המעבר (אמבולנס), תהליך דומה הממירה לתאי האפיתל לתאי mesenchymal, הם קשורים שינו בייצור רכיבים שונים מטריצה חוץ-תאית, אשר עשוי לתרום להתפתחות של רקמת פיברוזיס8,19.
לאחרונה, מספר במבחנה מחקרים של EndMT יש מבואר הפרטים של המנגנונים המולקולריים של EndMT15,20. EndMT הנגרמת על ידי איתות המסלולים השונים כולל הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β, ונ ט, וחלק1. ביניהם, TGF-β ממלא תפקיד מרכזי אינדוקציה של החובשים והן EndMT. ב- EndMT, ממושך חשיפה תוצאות TGF-β EndMT בתאי האנדותל שונים, בזמן חשיפה קצרה שנראה אין די21. אנחנו כאן תיאר פרוטוקול פשוטה עבור אינדוקציה EndMT, איזה מייל סוון 1 (MS-1) תאי אנדותל microvascular בלבלב עכבר עוברים EndMT במבחנה לאחר חשיפה ממושכת ל TGF-β20. במודל זה, ניתן לבצע ניתוחים במורד הזרם מרובים כדי לחקור תכונות סימן ההיכר של EndMT, כולל שינויים מורפולוגיים, downregulation של סמני אנדותל, קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal, גנים דלקתיים, cytoskeletal rearrangements, התכווצות ג'ל קולגן.
Rna (miRNAs) הם ~ 22 nt קטן RNAs רגולציה ישירה הדיכוי posttranscriptional של mRNA שונים מטרות22,23. דרך זיהוי המטרה בתיווך רצף זרע, miRNAs לדכא את מאות גנים היעד, לווסת פונקציות הסלולר מגוונים כגון תאית התמיינות, התפשטות, תנועתיות. זהו גם המקרה של רגולציה של החובשים, EndMT, דווח על מספר miRNAs כמבקרי סמביוזה24,החובשים, EndMT25. המודל EndMT שהוצגו בסקירה זו ניתן לשלב בקלות miRNA נהלים אפנון לבחון את התפקידים של miRNAs ב- EndMT. הסקירה הנוכחית מסכמת שלנו בצרות לחקור TGF-β-induced EndMT בתאים MS-1, כולל גם השוואה של תנאים האינדוקציה EndMT על ידי TGF-β בתאי האנדותל אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אינדוקציה של EndMT
- לשמור על MS-1 תאים בתנאים סטנדרטיים תרבות ולהימנע confluency. מקור התאים MS-1 מתוארת בטבלה של חומרים. עבור MS-1 תאים, השתמש מינימום הכרחי בינוני-α (MEM-α) עם 10% עגל עוברית סרום (FCS), פניצילין U/mL 50 50 סטרפטומיצין μg/mL.
- לשטוף את MS-1 תאים ב- 10 ס מ צלחת עם 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ולהוסיף 1.0 מ"ל של טריפסין לצלחת. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
- ניתוק התאים באמצעות 9 מ של תרבות התקשורת. לאסוף את ההשעיה תא בשפופרת 15 מ"ל.
- Centrifuge התליה תא ב x 300 – 400 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- בזהירות להסיר את תגובת שיקוע והשהה בגדר תא בתקשורת תרבות ומחוממת מראש.
- ספירת התאים קיימא באמצעות פתרון Trypan Blue ו hemocytometer רגיל או מונה הניתן תא אוטומטית.
- צלחת MS-1 תאים אל תרבות רגיל ללא ציפוי לוחות-0.5 x 103 תאים לכל ס מ2 לתרבות לטווח ארוך. לדוגמה, צלחת 5.0 x 103 תאים לכל טוב ב 6 תרבות טוב בצלחת. השתמש באותה מדיה תרבות כולל ריכוז זהה של FCS. MS-1 תאים, TGF-β גורם EndMT בתרבות לטווח ארוך (לפחות 48-72 שעות) עם השימוש של FCS.
- לעורר תאי אנדותל עם TGF-β2 (ריכוז סופי של 1 ng/mL) לאחר 24 שעות.
- התרבות התאים חממה humidified (5% CO2, 37 ° C). לפקח על תאים מדי יום בעת התמקדות שינויים מורפולוגיים.
- החלף את המדיה טריים מראש ומחוממת תרבות המדיה המכילה TGF-β2 לאחר 48 שעות של טיפול עם TGF-β בתרבות לטווח ארוך.
- המשך הבדיקות במורד הזרם. בדרך כלל, רה-ארגון אקטין נצפית לאחר 24 שעות של טיפול, downregulation של סמני אנדותל, קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal שנצפו לאחר 48-72 שעות של טיפול עם TGF-β.
2. Immunocytochemical ניתוח
- לשמור על MS-1 תאים בתנאים סטנדרטיים תרבות.
- צלחת MS-1 תאים על גבי 4 תא טוב תרבות קאמרית שקופיות ב- 1.0 x 103 תאים לכל טוב (1.7 ס מ2). שקופיות הם מצופים מראש עם ג'לטין. שימוש 0.5-1.0 מ"ל של תרבות התקשורת לכל טוב.
- לעורר תאי אנדותל עם TGF-β2 (ריכוז סופי של 1 ng/mL) לאחר 24 שעות. בעת ניתוח המעורבות של רוק EndMT, להוסיף מעכב Y-27632 רוק (10 μM) 1 h לכהן לטיפול TGF-β. בעת הערכת ההשפעה של עיכוב איתות TGF-β, TGF-β קולטן קינאז מעכבי יכול לשמש.
- התרבות התאים חממה humidified (5% CO2, 37 ° C). אקטין רה-ארגון נצפית בתאי MS-1 לאחר 24 שעות של טיפול עם TGF-β. שינויים אחרים נהיים ברורים לאחר 48-72 שעות של טיפול. לתרבות 72 h, החלף את המדיה טריים המדיה המכילה TGF-β לאחר 48 שעות של טיפול עם TGF-β.
-
צביעת F-אקטין
- לאחר 24 שעות של טיפול TGF-β, להסיר מדיה, לתקן תאים עם 4% paraformaldehyde ב- PBS 1 x עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף תאים עם 1 x PBS.
- דגירה עם 0.2% טריטון X-100 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS.
- דגירה עם phalloidin-tetramethylrhodamine isothiocyanate B מן-אמנית מדולל 150-fold עם מאגר החסימה לשעה בטמפרטורת החדר.
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS.
- כתם הגרעינים עם איגוד חומצת גרעין cyanine צבעני 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הר coverslips ושקופיות יש לשטוף פנים למטה בשקופית באמצעות שקופיות הרכבה מדיה.
- שימו לב עם מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש לייזר nm 543 מסנן פליטה של 560 – 615 nm גילוי של זריחה של phalloidin. השימוש בלייזר nm 633 מסנן פליטה יותר מ 650 nm עבור צביעת גרעינית. בעת טיפול עם TGF-β, היווצרות של סיבי סטרס עבה תיענה.
-
VE-קדהרין וα-SMA מכתים
- לאחר 72 h הטיפול TGF-β, להסיר מדיה, לתקן תאים עם מתנול 50% קר, אצטון 50% (0.5-1.0 מ"ל לכל טוב) במשך 5 דקות.
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS 1 x (0.5-1.0 מ"ל לכל טוב).
- דגירה עם נוגדנים העיקרית במאגר חסימה למשך הלילה ב 4 ° C בחושך על פי הריכוז המומלץ של היצרן. השתמש VE-קדהרין נוגדנים חד-שבטיים (BV13, דילול מטריים) וα-SMA Cy3 מצומדת נוגדנים חד-שבטיים (1A4, דילול 1:200)20.
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS.
- דגירה תאים עם ירוק מצומדת צבע משני נוגדן ל VE-קדהרין נוגדן במאגר החסימה לשעה בטמפרטורת החדר בחושך על פי הריכוז המומלץ של היצרן.
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS.
- כתם הגרעינים עם איגוד חומצת גרעין cyanine צבעני 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הר coverslips ושקופיות יש לשטוף פנים למטה בשקופית באמצעות שקופיות הרכבה מדיה.
- שימו לב עם מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש לייזר nm 543 מסנן פליטה של 560 – 615 nm גילוי של α-SMA (Cy3). השתמש 488 ננומטר לייזר של מסנן פליטה של 505 – 550 ננומטר גילוי של VE-קדהרין. בדרך כלל, בעת טיפול עם טיפול TGF-β, הדירי VE-קדהרין אותות, עלייה α-SMA אותות תיענה.
3. תלת מימדי קולגן ג'ל התכווצות Assay
- בצע לתרבות של MS-1 תאים עם או בלי TGF-β עבור 72 h לפני קולגן ג'ל התכווצות assay.
- להכין את הסוג אני קולגן ג'ל על קרח. לערבב פתרון קולגן קר, x 10 מרוכזים MEM בינוני ו קולגן דילול מאגר המכיל 0.05 N NaOH, 2.2% NaHCO3ו- 200 מ מ HEPES pH 7.4-8:1:1 יחס.
- לערבב 200 mL של פקד או השעיות TGF-β-טיפול תאי אנדותל (1.0 x 106 תאים/200 μL) ו- 800 μl של הפתרון ג'ל קולגן. TGF-β דגימות שטופלו, הוסיפו TGF-β2 (1 ng/mL) כדי התליה תא.
- להוסיף 1.0 מ"ל של התערובת כל טוב של תרבות. ובכן 12 צלחות ולאפשר שבמהלכו בחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
- לאחר gelatinization, כיסוי 1.0 מ"ל של מאמ-α המכיל 10% FCS, 50 פניצילין U/mL ו- 50 μg/mL סטרפטומיצין להפריח את הג'ל. TGF-β דגימות שטופלו, הוסיפו TGF-β2 (1 ng/mL) בכלי התקשורת.
הערה: עבור TGF-β דגימות שטופלו, להוסיף TGF-β ג'ל והן תרבות המדיה. - דגירה של ג'לים צפה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
- סריקת התמונות של ג'לים מהחלק התחתון של צלחות באמצעות סורק. לחלופין, להקליט התמונות של ג'לים באמצעות מצלמה דיגיטלית ממרחק קבוע מעל ג'לים.
- לכמת את ג'ל פני השטח בהתבסס על מספר הפיקסלים באמצעות ImageJ. בחר את הג'ל באמצעות מבחר ביד חופשית או כלי בחירה הקשורה, או בחר את ג'ל באמצעות "תמונה | התאם | צבע הסף"כלי ולאחר מכן לקבוע את האזור של ג'ל באמצעות" נתח | הפקודה מידה".
4. עיכוב של miRNA פעילויות על-ידי miRNA מבוססי חומצת גרעין נעול מעכבי
- לשמור על MS-1 תאים בתנאים סטנדרטיים תרבות.
- Transfect נעול חומצת גרעין (מגבר קדם) מעכבי miRNA, דופלקסים miRNA סינתטי או siRNAs (20 או 50 ננומטר) בעזרת ריאגנטים lipofection על פי הוראות היצרן. פרטים ומקורות של מעכבי miRNA מגבר קדם, miRNA סינתטי דופלקסים ו siRNAs תוארו שלנו26,הקודם דוחות27. MS-1 תאים, נהלים תקנים רגיל המבוסס על הוראות היצרן עובד היטב עבור הקדמה של מגבר קדם מעכבי miRNA, דופלקסים miRNA סינתטי או siRNAs.
- לאחר 16 – 48 h, לעורר תאי אנדותל עם TGF-β2 (ריכוז סופי של 1 ng/mL).
- המשך ניתוח במורד הזרם שונים לרבות RNA ניתוח ביטוי (RT-PCR כמותי וניתוחים RNA-רצף (RNA-seq)), ניתוח immunocytochemical assay כתב. ניתוחים במורד הזרם תוארו שלנו הקודם דוחות20,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TGF-β הוא משרן חזק של EndMT בתאי האנדותל שונים. לאחר 24 שעות טיפול עם TGF-β בתאים MS-1, צביעת עבור F-אקטין מראה רה-ארגון של אקטין מתח סיבים (איור 1 א')20. רעלני עם מעכב רוק Y-27632 מעכב את תנאי הגיוס של אקטין רה-ארגון20. תאי אנדותל MS-1 שנה של מורפולוגיה ריצוף דמוי הקלאסית מורפולוגיה בצורת פלך mesenchymal על טיפול TGF-β (איור 1B). תאי TGF-β-מטופלים שננתק את הקשר תא-תא. לאחר טיפול עם TGF-β 48-72 שעות, immunocytochemical ניתוחים להדגים ירידה בביטוי של VE-קדהרין ביטוי מוגבר של α-SMA (איור 1C). TGF-β גורם באופן דרסטי את הביטוי של α-SMA ברמות ה-mRNA והן חלבונים בתאים MS-1 לאחר 48-72 שעות של טיפול (דמויות 1D ו- 1E). בתרבית של TGF-β כולל TGF-β1, 2 ו- 3 איזופורמים. מחקר קודם באמצעות העכבר תרבותי כרית endocardial explants הראו כי TGF-β2 אך לא TGF-β3 היא חובה עבור שינוי של תאים כרית endocardial28. מצד שני, אנו קודם לכן השוו את ההשפעות של שלושה איזופורמים על ביטוי α-SMA, אישר כי כל איזופורמים באופן דומה המושרה α-SMA הביטוי ב- MS-1 תאים20. קולגן ג'ל התכווצות assay מראה משופר התכווצות של סוג הקולגן שאני ג'ל על ידי תאים MS-1 לאחר הטיפול TGF-β (איור 1F). אפקט זה מרמז על רכישת תא mesenchymal היכולת לשפץ מטריצה חוץ-תאית. תכונות אלה הן תכונות סימן ההיכר של EndMT20. שלנו הקודם ח20, טיפול עם מעכב רוק Y-27632 לדכא בחריפות אינדוקציה של סמנים mesenchymal α-SMA, SM22α ללא דיכוי בו-זמני של אינדוקציה של אחרים גנים היעד TGF-β כגון Fibronectin 1 ו- MMP-2.
EndMT הוא תהליך דינמי מאוד. בתאים MS-1, ההשפעות של TGF-β α-SMA ביטוי, מורפולוגיה הם הפיכים; לאחר מניעת TGF-β, α-SMA ביטוי יתקצר רמות הבזליים (איור 2 א) ותאים לשחזר עם ריצוף דמוי מורפולוגיה (איור 2B). בנוסף, אינדוקציה של EndMT, החובשים מזוהה עם שינויים דינמיים הפרשה בקיבולת של נוגדנים מרובים, ציטוקינים. מספר נוגדנים דלקתיים וכן ציטוקינים כולל CCL17, CX3CL1, CXCL16, IL-6, ו- Angptl2 הם המושרה על ידי TGF-β בתאים MS-1, אשר לנו בעבר הגדירה EndMT-הקשורים פנוטיפ הפרשה (EndMT-SP)26. מודל ניסיוני זה שימושי לחקור את הרגולטורים בשם EndMT ו- EndMT-SP. למדנו בעבר את התפקידים מספר miRNAs בהתפתחות של EndMT על ידי שיפור או עיכוב miRNA פעילויות26,27. בתאים MS-1, miRNA פעילויות יכול מווסת robustly על ידי oligonucleotides מחקים miRNA או מעכבי miRNA מבוססת מגבר קדם, וביצע מספר מבחני במורד הזרם כולל ניתוח RNA-seq ניתן בקלות (איור 3). בהתבסס על ניתוח transcriptome אינטגרטיבית, לנו יש קודם לכן קשורה מיר צורונים פעילים-31 EndMT רגולציה ב- MS-1 תאים26. ניתוח ה-RNA-seq הראה כי עיכוב של מיר-31 על ידי מגבר קדם miRNA מעכב תוצאות הנחתה של אינדוקציה של סמנים mesenchymal (איור 3 א), גנים EndMT-SP (איור 3C), בעוד זה אינו משפיע על אינדוקציה של יעד TGF-β קונבנציונלי גנים כגון Fibronectin 1, פאי-1 ו- Smad7 (איור 3B) ו- downregulation של סמנים אנדותל (איור 3D)26. Downregulate מיר-31 ו- TGF-β Stk40, מווסת שלילי של NF-κB מסלול, אשר פועל כרגולטור פוטנציאלי של EndMT-SP. למרות TGF-β לא להגדיל את הביטוי של מיר-31, TGF-β גורם אלטרנטיבית הדרה בתיווך פוליאדנילציה של רצף poly(A) פנימי Stk40 3' UTR, ובכך שיפור המיקוד של Stk40 על ידי מכוננת פעיל מיר-31 ודיכוי סוף סוף Stk4026. בנוסף, נבחנו בעבר את התפקידים של TGF-β-inducible 27b-מיר EndMT27. עיכוב של מיר-27 דיכא קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal (איור 3 א) תוך ההשפעות על-קונבנציונאלי TGF-β היעד גנים, גנים EndMT-SP, והיו סמני אנדותל שולית (דמויות 3B, 3 ג, ו 3D)27 .
איור 1 : אינדוקציה של EndMT ב MS-1 תאים על-ידי TGF-β- (א) אקטין רה-ארגון ב- MS-1 תאים לאחר 24 שעות של טיפול TGF-β2 (1 ng/mL). Morphological (B) שינויים בתאים MS-1 לאחר 72 שעות של טיפול TGF-β2 (1 ng/mL). (ג) Immunocytochemical מנתח עבור VE-קדהרין וα-SMA בתאים MS-1 לאחר 72 שעות של טיפול TGF-β2 (1 ng/mL). (יח, E) ביטוי לשינויים α-SMA, נקבע על ידי אנליזה RT-PCR כמותי סטנדרטית (D) והמערבית כתם ניתוח (E). קולגן (F) ג'ל התכווצות וזמינותו. היחס בין שטח הפנים לאחר 72 h תרבות עם או בלי טיפול TGF-β2 (1 ng/mL) השטח המקורי מוצגים. גודל ברים = 20 μm (A ו- C), and μm 200 (B). הדמויות עוברות שינוי מ. Mihira et al. 20. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : אפקטי הפיכה של TGF-β בתאים MS-1- הביטוי mRNA α-SMA (א), (B) מורפולוגיה תאים לאחר נסיגה של TGF-β2 בתאים MS-1. גודל ברים = 200 μm. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : ניתוח RNA-seq בתאים MS-1- לאחר הקדמה של מעכבי miRNA מגבר קדם וטיפול עם TGF-β2 (72 h), ניתוח ה-RNA-seq היה שבוצעו26,27. NC: בקרה שלילית. שינויים ביטוי של גנים נציג מוצגים (A, סמנים mesenchymal; B, TGF-β קונבנציונאלי היעד גנים; C, גנים EndMT-SP; ו- D, סמני אנדותל). ערכים FPKM (קטעים מפוצלים kilobase של תעתיק לכל מיליון קריאות ממופה) היו מנורמל עם הערכים של מדגם שליטה (מגבר קדם-NC ללא טיפול TGF-β2). קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן.
| סוג התא | מצבו של סמן mesenchymal אינדוקציה | הפניה |
| הוא יפתור תאי אנדותל (HUVEC) | אינדוקציה על ידי בידול mesenchymal בינוני (TGF-β 5 ננוגרם למ"ל, PDGF-BB 25 ng/mL), 5 – 21 יום. | . Krenning et al. |
| עורית microvascular אנדותל תאים אנושיים (HCMEC) | אינדוקציה על ידי TGF-β2 (10 ng/mL), בלי FBS, 2 ימים. | מדיצ'י. et al. |
| תאי אנדותל כלילית אדם (HCEC) | אינדוקציה על ידי TGF-β1 (10 ng/mL), 6 ימים. עיכוב מאת BMP-7. | . Zeisberg et al. |
| העכבר ריאות אנדותל תאים (MLEC) | אינדוקציה על ידי TGF-β1 (10 ng/mL), להפחית ל- 2% FBS, מבלי mitogen אנדותל, 2 ימים. | Zeisberg ואח '. |
| עכברושים תאי אנדותל המוח (BEC) | אינדוקציה על ידי TGF-β1 (10 ng/mL), 2 ימים. | . Krizbai et al. |
| שור תאי אנדותל של אבי העורקים (BAEC) | אינדוקציה על ידי TGF-β1 (1 ng/mL), 5 ימים. | . Arciniegas et al. |
| מונצחים שור microvascular אנדותל תאים ברשתית (iBREC) | אינדוקציה על ידי TGF-β2 (10 ng/mL), 3-6 ימים. | . Deissler et al. |
| תאי אנדותל שסתום אבי העורקים ovine | אינדוקציה TGF-β1 או 3 (1 ng/mL), 6 ימים. | . Paranya et al. |
| תאי אנדותל microvascular בלבלב עכבר MS-1 | אינדוקציה על ידי TGF-β (10 ng/mL), הופעל ראס ביטוי, 1 יום. | השימוטו. et al. |
| תאי אנדותל microvascular בלבלב עכבר MS-1 | אינדוקציה על ידי TGF-β2 (1 ng/mL), 2-3 ימים. | . Mihira et al. |
טבלה 1: אינדוקציה של EndMT מאת TGF -β בתאי האנדותל שונים. תרבות תנאים האינדוקציה EndMT על ידי TGF-β מסוכמים. שינויים בתנאי תרבות כולל ריכוז סרום, בהוספה ובהסרה של גורמי גדילה אחרים גם מצוינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבר דווח כי הטיפול Ras ו- TGF-β מופעל במשך 24 שעות ביממה המושרה EndMT בתאים MS-1, בעוד TGF-β לבד לא הצליחה לגרום EndMT זו תקופה קצרה21. באופן עקבי, הבחנו כי TGF-β באופן משמעותי המושרה EndMT לאחר טיפול ארוך יותר (48-72 שעות) ב- MS-1 תאים20... EndMT נצפתה שוב ושוב לאחר טיפול ממושך עם TGF-β (2-6 ימים) בתאי האנדותל שונים כגון הטבור האנושי הווריד תאי אנדותל (HUVEC), עורית microvascular אנדותל תאים אנושיים (HCMEC), תאי אנדותל כלילית אדם ( HCEC), העכבר ריאות אנדותל תאים (MLEC), עכברושים תאי אנדותל המוח (BEC), תאי אנדותל אבי העורקים שור (BAEC), מונצחים שור microvascular אנדותל תאים ברשתית (iBREC) ו- ovine אבי העורקים שסתום תאי אנדותל8, 18,29,30,31,32,33,34. טבלה 1, נוכל לסכם התנאים האינדוקציה סמן mesenchymal על ידי TGF-β שונים תאי אנדותל8,18,20,21,29, 30,31,32,33,34. השוואה של דוחות אלה עולה כי כל שורה תא אנדותל יש סף שונים עבור EndMT. רגישות דיפרנציאלית TGF-β או מנגנונים אחרים עשויה ביסוד מגוונות EndMT פתולוגית מחלות הקשורות באיברים שונים. זה צריך לקחת בחשבון יחד עם התוצאות של מחקרים ויוו .
הפרטים של במבחנה פרוטוקול אינדוקציה EndMT צריכים להיות מותאמים בשורות תאים שונים: למשל., ריכוז של TGF-β, ריכוז של סרום, הוספה או הסרה של גורמי גדילה אחרים, ואת תקופת תרבות. לדוגמה, HUVECs בדרך כלל מגיבים TGF-β ו EndMT להיגרם על ידי בשילוב עם גורמים אחרים כמו PDGF-BB, גירויים דלקתיות ו/או אפנון של ריכוז סרום ורכיבים אחרים בינוני בתרבות עוד הגדרה29 , 35. בנוסף, overconfluency להמתיק את התגובות TGF-β.
EndMT הוא תהליך דינמי והוא תהליך הפוך שנקרא mesenchymal-אנדותל המעבר (MEndoT) דיווחו לאחרונה36. בעוד אינדוקציה של סמנים mesenchymal על ידי TGF-β לבד הוא הפיך בתאים MS-1 (איור 2), דווח כי downregulation של סמני אנדותל בתאים MS-1 עם ראס מופעל שהתמידו לאחר נסיגה של TGF-β21. EndMT בלתי הפיכה דווחה גם iBREC, שסתום אבי העורקים ovine-תאי אנדותל-33,-34. בנוסף, הדוח הקודם הראה כי תהליך EndMT התקיים לאחר נסיגה של TGF-β עקב הפעלה ממושכת של Ras-GTP ומתילציה של האמרגן RASAL1 של תאי אנדותל כלילית אדם37. לפיכך, השוואה של מודלים אלה עשויה להועיל גם להבין את מנגנוני הרגולציה של תאי אנדותל פלסטיות.
ההיענות של תאי אנדותל כדי אינדוקציה EndMT נראה באופן משמעותי הטרוגנית38. שא. et al. דיווח כי הגידול הספציפי תאי אנדותל של המודל הגידול החלב להראות צורות שונות של EndMT בתגובה לגירוי TGF-β38. EndMT מונחה-TGF-β הוא גם מווסת על ידי איתות המסלולים אחרות, לרבות FGF-2, BMP-7 ו- IL-1β35,37,38. מצאנו גם כי TNF-α מגבירה TGF-β-induced EndMT, EndMT-SP ב- MS-1 תאים26. יתר על כן, ידוע כי EndMT הנגרמת על ידי איתות המסלולים אחרות, כולל ונ ט, דרגה, היפוקסיה1. וכך, בשילוב עם גירויים אחרים בתאי האנדותל שונים עשוי להיות חשוב להבין הטרוגניות של תגובתיות EndMT.
פרוטוקול EndMT המובאות כאן ניתן לשנות בקלות לחקור את הרגולטורים של EndMT. למעשה, אנחנו שאפיינו הרגולטורים השונים של EndMT MS-1 תאים20,26,27. גואנין נוקלאוטיד exchange פקטור Arhgef5 בעלת גורם שעתוק הקשורות myocardin-(MRTF-A) הם המושרה מאת Smad אותות, ולתרום שניהם קולטנים upregulation α-SMA ב- MS-1 תאים20. לפיכך, TGF-β איתות מפעילה שני אותות רו, MRTF-A כדי לגרום EndMT. בנוסף, מצאנו גם מיר צורונים פעילים-31 ו- TGF-β-inducible מיר-27b חיובי לווסת EndMT אינדוקציה26,27. בתאים MS-1, 31-מיר צורונים פעילים הכרחית גם TGF-β-induced EndMT-SP26. בסך הכל, במבחנה EndMT אינדוקציה הליכים אלה יהיה שימושי להבנת הביולוגיה של EndMT, זיהוי גנים הקשורים EndMT חתימות של פיתוח אסטרטגיות כדי לווסת את תהליך זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים Zea אחרי הכרזת העצמאות בהודו, Kohei Miyazono על הצעות הכנה של היד. H.I.S., מ. ה נתמכים על ידי אנדרטת Uehara קרן מחקר לאגודה, H.I.S. נתמכת את המלגה של ממוריאל Hayaishi וסאמא עבור מחקר בחו ל. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של קרן המדע טקדה (A.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |
References
- Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
- Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
- DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
- Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
- Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
- Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
- Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
- Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
- Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
- Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
- Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
- Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
- Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
- Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
- Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
- Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
- Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).
- Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
- Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
- Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
- Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
- Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
- Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
- Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
- Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
- Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).
