Summary
En protokol til in vitro- induktion i endothelial-mesenchymale overgang (EndMT), som er nyttige for efterforskningen cellulær signalering veje involveret i EndMT, er beskrevet. I denne eksperimentelle model, er EndMT foranlediget af behandling med TGF-β i endothelial celler, MS-1.
Abstract
Fænotypisk plasticitet i endothelial celler ligger til grund for systemudvikling af hjerte-kar-, hjerte-kar-sygdomme og forskellige betingelser forbundet med orgel fibrose. I disse betingelser erhverve differentieret endotelceller mesenchymale-lignende fænotyper. Denne proces kaldes endotel-mesenchymale overgang (EndMT) og er kendetegnet ved downregulation i endothelial markører, opregulering af mesenchymale markører og morfologiske ændringer. EndMT er foranlediget af flere signaling veje, herunder omdanne vækst faktor (TGF)-β, Wnt og hak, og reguleret af molekylære mekanismer ligner dem af epitel-mesenchymale overgang (EMT) vigtig for gastrulation, væv fibrose, og kræft metastaser. Forstå mekanismerne i EndMT er vigtigt at udvikle diagnostiske og terapeutiske strategier rettet mod EndMT. Robust induktion af EndMT i vitro er nyttige til at karakterisere fælles gene expression signaturer, identificere druggable molekylære mekanismer og skærmen for modulatorer af EndMT. Her, beskriver vi en in vitro- metode til induktion af EndMT. MS-1 mus i bugspytkirtlen mikrovaskulære endotelceller underkastes EndMT efter langvarig udsættelse for TGF-β og vise opregulering af mesenchymale markører og morfologiske ændringer samt induktion af flere inflammatoriske kemokiner og cytokiner. Metoder til analyse af mikroRNA (miRNA) graduering er også inkluderet. Disse metoder giver en platform til at undersøge mekanismerne bag EndMT og bidrag af miRNAs til EndMT.
Introduction
Endotel-mesenchymale overgang (EndMT) er den proces, hvorved en differentieret endotel celle gennemgår en række forskellige molekylære ændringer, hvilket resulterer i en fibroblast-lignende mesenchymale celler1. EndMT blev oprindeligt beskrevet som en endotel celle transformation under udviklingen af hjertet2,3. I tidlig udvikling af hjertet består hjerte rør af en indre endokardiet og en ydre myokardiet. Disse to lag er adskilt af et lag af ekstracellulære matrix kaldes den kardiale jelly. De embryonale endokardial celler, som erhverver endotel celle markører, transit til mesenchymale celler, invadere de underliggende hjerte gelé og fremme dannelsen af den kardiale puder, giver grundlaget for atrieventrikelklapperne og septum og semilunar ventiler. Desuden er EndMT blevet foreslået for at være kilder til pericytes og vaskulære glatte muskelceller i andre embryonale vaskulære systemer, herunder koronar fartøjer, abdominal aorta og lungepulsåren4,5,6. Derudover er EndMT impliceret i fysiologiske angiogene spiring7.
Akkumulere beviser har foreslået, at EndMT også er involveret i flere hjerte-kar-sygdomme og andre sygdomme1,8. EndMT-associerede betingelser omfatter vaskulære forkalkning, åreforkalkning, pulmonal arteriel hypertension, bundløs misdannelser, orgel fibrose, vene graft remodeling, allograft dysfunktion i nyre transplantation og kræft8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. en nylig rapport beskrev, at flere molekylære EndMT markører kan være et redskab til diagnose og prognose forudsigelse af renal graft dysfunktion i nyre transplantation17. Graduering af EndMT-relaterede cellulær signalering veje har vist sig at forbedre adskillige sygdomstilstande, herunder hjerte fibrose og vene graft remodeling i dyre modeller8,15. Derfor er forstå mekanismerne underliggende EndMT vigtigt at udvikle diagnostiske og terapeutiske strategier rettet mod EndMT.
EndMT er karakteriseret ved tab af celle-celle vejkryds, forøgelse af vandrende potentiale, downregulation i endothelial-specifikke gener som VE-cadherin, og opregulering af mesenchymale gener herunder α-glat muskel aktin (α-SMA). Desuden er EndMT og epitel-mesenchymale overgang (EMT), en lignende proces, der konverterer epitelceller mesenchymale celler, forbundet med ændret produktion af forskellige ekstracellulære matrix komponenter, som kan bidrage til udviklingen af væv fibrose8,19.
For nylig, flere in vitro- undersøgelser af EndMT har belyst detaljer molekylære mekanismer i EndMT15,20. EndMT er foranlediget af forskellige signaling veje herunder omdanne vækst faktor (TGF)-β, Wnt, og hak1. Blandt dem spiller TGF-β afgørende roller i induktion af både EMT og EndMT. Lang tids udsættelse for TGF-β resultater i EndMT i forskellige endotelceller, i EndMT, mens korte eksponering ser ud til at være utilstrækkelig21. Vi har her beskrevet en enkel protokol for EndMT induktion, i hvilke MILE SVEN 1 (MS-1) mus i bugspytkirtlen mikrovaskulære endotelceller gennemgå EndMT i vitro efter langvarig udsættelse for TGF-β20. I denne model, kan flere downstream analyser udføres for at undersøge hallmark egenskaber i EndMT, herunder morfologiske ændringer, downregulation i endothelial markører, opregulering af mesenchymale markører og inflammatoriske gener, cytoskeletal rearrangementer, og kollagen gel sammentrækning.
MicroRNA (miRNAs) er ~ 22 nt små lovgivningsmæssige RNA'er, der direkte posttranskriptionelle undertrykkelse af forskellige mRNA mål22,23. Gennem seed sekvens-medieret mål anerkendelse, miRNAs undertrykke hundredvis af target gener og modulere forskellige cellulære funktioner såsom Celledifferentiering, spredning og motilitet. Dette er også tilfældet for regulering af EMT og EndMT, og flere miRNAs er blevet rapporteret som regulatorer af EMT og EndMT24,25. Den EndMT model præsenteret i denne gennemgang kan let kombineres med miRNA graduering procedurer til test af miRNAs rolle i EndMT. Denne undersøgelse opsummerer vores eksperimentelle procedurer for at undersøge TGF-β-induceret EndMT i MS-1 celler og omfatter også sammenligning af EndMT induktion af TGF-β forhold i andre endotelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. induktion af EndMT
- Vedligeholde MS-1 celler i standard dyrkningsbetingelserne og undgå confluency. En kilde til MS-1 celler er beskrevet i Tabel af materialer. For MS-1 celler, skal du bruge Minimum afgørende Medium-α (MEM-α) med 10% føtalt kalveserum (FCS), 50 U/mL penicillin og 50 μg/mL streptomycin.
- Vaske MS-1 celler på 10 cm parabol med 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og tilsættes 1,0 mL trypsin til pladen. Inkuber i 5 min. ved 37 ° C.
- Frigør celler ved hjælp af 9 mL dyrkningsmedier. Indsamle cellesuspension i en 15 mL tube.
- Der centrifugeres cellesuspension ved 300-400 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Omhyggeligt fjernes supernatanten og suspendere celle pellet i pre varmede dyrkningsmedier.
- Grev levedygtige celler benytter Trypan blå løsning og en standard hemocytometer eller en automatisk celle counter.
- Plade MS-1 celler på ubestrøget standard kultur plader på 0,5 x 103 celler pr. cm2 for lange sigt kultur. For eksempel, kultur pladen 5,0 x 103 celler pr. brønd i en 6 godt plade. Brug den samme kultur medier, herunder den samme koncentration af FCS. I MS-1 celler og inducerer TGF-β EndMT på lang sigt kultur (mindst 48-72 h) med brug af FCS.
- Stimulere endotelceller med TGF-β2 (en endelig koncentration på 1 ng/mL) efter 24 timer.
- Kultur celler i en fugtig inkubator (5% CO2, 37 ° C). Overvåge celler dagligt, når der fokuseres på morfologiske ændringer.
- Erstatte medierne med friske pre varmede kultur medier indeholdende TGF-β2 efter 48 h behandling med TGF-β på lang sigt kultur.
- Gå videre til de efterfølgende analyser. Typisk actin reorganisering er observeret efter 24 timer behandling, og downregulation i endothelial markører og opregulering af mesenchymale markører er observeret efter 48-72 h af behandling med TGF-β.
2. andre analyse
- Vedligeholde MS-1 celler i standard kultur betingelser.
- Plade MS-1 celler på 4 celle godt kultur kammer dias på 1,0 x 103 celler pr. brønd (1,7 cm2). Slides er præ-coatede med gelatine. Brug 0,5 – 1,0 mL af Kulturmedier pr. brønd.
- Stimulere endotelceller med TGF-β2 (en endelig koncentration på 1 ng/mL) efter 24 timer. Når du analyserer inddragelse af ROCK i EndMT, tilføje en ROCK hæmmer Y-27632 (10 μM) 1 h forudgående til TGF-β behandling. Ved vurderingen af effekten af TGF-β signaling hæmning, kan TGF-β receptor kinase hæmmere anvendes.
- Kultur celler i en fugtig inkubator (5% CO2, 37 ° C). Aktin reorganisering er observeret i MS-1 celler efter 24 timer behandling med TGF-β. Andre ændringer bliver indlysende efter 48-72 h af behandling. 72 h kultur, erstatte medierne med friske medier indeholdende TGF-β efter 48 h af behandling med TGF-β.
-
F-actin farvning
- Efter 24 timer af TGF-β behandling, fjerne medier, lave celler med 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS i 20 min. ved stuetemperatur og skyl celler med 1 x PBS.
- Der inkuberes med 0,2% Triton X-100 i 5 min ved stuetemperatur.
- Skyl celler tre gange med 1 x PBS.
- Der inkuberes med phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanat fra Amanita phalloides fortyndet 150-fold med blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur.
- Skyl celler tre gange med 1 x PBS.
- Pletten kerner med cyanine nukleinsyre bindende farvestoffer i 5 min ved stuetemperatur.
- Skyl dias og mount coverslips med billedsiden nedad på et dias ved hjælp af slide montering medier.
- Observere med en Konfokal mikroskop. Bruge en 543 nm laser og en emission filter 560-615 nm for afsløring af fluorescens af phalloidin. Bruge en 633 nm laser og en emission filter længere end 650 nm for nukleare farvning. Ved behandling med TGF-β, ville blive overholdt dannelsen af tykt stress fibre.
-
VE-cadherin og α-SMA farvning
- Efter 72 h af TGF-β behandling, fjerne medier, lave celler med kolde 50% methanol og 50% acetone (0,5 – 1,0 mL pr. brønd) i 5 min.
- Skyl celler tre gange med 1 x PBS (0,5 – 1,0 mL pr. brønd).
- Inkuber med primære antistoffer i blokerende buffer natten over ved 4 ° C i mørke ifølge producentens anbefalede koncentration. Brug VE-cadherin monoklonalt antistof (BV13, 1: 100 fortynding) og Cy3-konjugeret α-SMA monoklonalt antistof (1A4, 1:200 fortynding)20.
- Skyl celler tre gange med 1 x PBS.
- Inkuber celler med et grønt farvestof-konjugeret sekundær antistof til VE-cadherin antistof i blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur i mørke ifølge producentens anbefalede koncentration.
- Skyl celler tre gange med 1 x PBS.
- Pletten kerner med cyanine nukleinsyre bindende farvestoffer i 5 min ved stuetemperatur.
- Skyl dias og mount coverslips med billedsiden nedad på et dias ved hjælp af slide montering medier.
- Observere med en Konfokal mikroskop. Bruge en 543 nm laser og en emission filter 560-615 nm for påvisning af α-SMA (Cy3). Bruge en 488 nm laser og en emission filter 505-550 nm for påvisning af VE-cadherin. Typisk, ved behandling med TGF-β behandling, falde i VE-cadherin signaler og stigning i α-SMA signaler ville blive overholdt.
3. tre-dimensionelle kollagen Gel sammentrækning Assay
- Udføre kultur af MS-1 celler med/uden TGF-β i 72 timer før kollagen gel sammentrækning assay.
- Forberede typen jeg kollagen gel på is. Bland kolde kollagen løsning, 10 x koncentreret MEM medium og kollagen fortynding buffer indeholdende 0,05 N NaOH, 2,2% NaHCO3og 200 mM HEPES pH 7,4 en 8:1:1 ratio.
- Bland 200 mL af kontrol eller TGF-β-behandlede endotel celle suspensioner (1,0 x 106 celler/200 μl) og 800 μl af kollagen gelopløsning. TGF-β behandlede prøver, tilføje TGF-β2 (1 ng/mL) til cellesuspension.
- Tilsæt 1,0 mL af blandingen til hver brønd af 12-og kultur plader og tillade for at størkne i varmeskab ved 37 ° C i 30-60 min.
- Efter forklistring, overlay 1,0 mL af MEM-α indeholdende 10% FCS, 50 U/mL penicillin og 50 μg/mL streptomycin at flyde gel. TGF-β behandlede prøver, tilføje TGF-β2 (1 ng/mL) til mediet.
Bemærk: For TGF-β behandlet prøver, tilføje TGF-β til både gel og kultur medier. - Inkuber de flydende gel ved 37 ° C i 48 timer.
- Scanne billeder af geler fra bunden af plader ved hjælp af en scanner. Alternativt kan du optage billeder af geler ved hjælp af et digitalt kamera på en fast afstand over geler.
- Kvantificere gel areal baseret på pixel antallet ved hjælp af ImageJ. Vælg gel ved hjælp af en frihånd udvalg eller relaterede markeringsværktøjer, eller Vælg gel ved hjælp af "billede | Justere | Farve tærskel"værktøj, og derefter bestemme området af gel ved hjælp af" Analyze | Foranstaltning"kommando.
4. hæmning af miRNA aktiviteter af låst nukleinsyre-baserede miRNA hæmmere
- Vedligeholde MS-1 celler i standard kultur betingelser.
- Transfect låst nukleinsyre (LNA) miRNA hæmmere, syntetiske miRNA dobbelthuse eller siRNAs (20 eller 50 nM) ved hjælp af lipofection reagenser efter fabrikantens anvisninger. Detaljer og kilder til LNA miRNA hæmmere, syntetiske miRNA dobbelthuse og siRNAs var beskrevet i vores tidligere rapporter26,27. I MS-1 celler, standard Transfektion procedurer baseret på fabrikantens anvisninger arbejde godt for indførelsen af LNA miRNA hæmmere, syntetiske miRNA dobbelthuse eller siRNAs.
- Efter 16-48 h, stimulere endotelceller med TGF-β2 (en endelig koncentration på 1 ng/mL).
- Gå videre til forskellige downstream analyser herunder RNA udtryk analyse (kvantitativ RT-PCR og RNA-sekventering (RNA-seq) analyser), andre analyse og reporter assay. Downstream analyser har været beskrevet i vores tidligere rapporter20,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TGF-β er en potent inducer af EndMT i forskellige endotelceller. Efter 24 timer behandling med TGF-β i MS-1 celler viser farvning for F-actin reorganisering af actin stress fibre (figur 1A)20. Forbehandling med en ROCK hæmmer Y-27632 hæmmer induktion af actin reorganisering20. MS-1 endotelceller Skift fra en klassisk brostensbelagte-lignende morfologi til en mesenchymale spindel-formet morfologi på TGF-β behandling (figur 1B). TGF-β-behandlede celler mister celle-celle kontakt. Efter behandling med TGF-β for 48-72 h viser andre analyser nedsat udtryk for VE-cadherin og øget udtryk af α-SMA (figur 1 c). TGF-β inducerer drastisk udtryk af α-SMA på både mRNA og protein niveauer i MS-1 celler efter 48-72 h af behandling (tal 1 d og 1E). Pattedyr TGF-β omfatter TGF-B1, 2 og 3 isoformer. En tidligere undersøgelse ved hjælp af musen kulturperler endokardial pude explants har vist, at TGF-β2 men ikke TGF-β3 er obligatorisk for transformation af endokardial pude celler28. På den anden side vi tidligere sammenlignet virkningerne af tre isoformer på α-SMA udtryk og bekræftet at alle isoformer ligeledes induceret α-SMA udtryk i MS-1 celler20. Kollagen gel sammentrækning analysen viser øget kontraktion af kollagen type jeg gel af MS-1 celler efter TGF-β behandling (figur 1F). Denne effekt tyder erhvervelse af mesenchymale celler kapacitet til at remodel ekstracellulære matrix. Disse funktioner er kendetegnende træk af EndMT20. I vores tidligere rapport20undertrykt behandling med en ROCK hæmmer Y-27632 stærkt induktion af mesenchymale markører α-SMA og SM22α uden ledsagende undertrykkelse af induktion af andre TGF-β target gener såsom fibronektin 1 og MMP-2.
EndMT er en yderst dynamisk proces. I MS-1 celler er virkningerne af TGF-β på α-SMA udtryk og morfologi reversible; efter TGF-β afsavn inddrive α-SMA udtryk falder til basal niveauer (figur 2A) og celler en brosten-lignende morfologi (figur 2B). Derudover er induktion af EndMT og EMT forbundet med dynamiske ændringer i sekretoriske kapacitet af flere kemokiner og cytokiner. Flere inflammatoriske kemokiner og cytokiner, herunder CCL17, CX3CL1, CXCL16, IL-6 og Angptl2 er induceret af TGF-β i MS-1 celler, som vi tidligere har udpeget EndMT-associerede sekretoriske fænotype (EndMT-SP)26. Denne eksperimentelle model er nyttige til at undersøge de formodede regulatorer af EndMT og EndMT-SP. Vi har tidligere studeret roller i flere miRNAs i EndMT ved at fremme eller hæmme miRNA aktiviteter26,27. I MS-1 celler, miRNA aktiviteter kan moduleres håndfast af miRNA efterligne oligonukleotider eller LNA-baserede miRNA hæmmere og flere downstream assays herunder RNA-seq analyse kan nemt udføres (figur 3). Baseret på integrativ transkriptom analyse, har vi tidligere knyttet constitutively aktive miR-31 til EndMT forordning i MS-1 celler26. RNA-seq Analysen viste at hæmning af miR-31 af LNA miRNA hæmmer resultater i dæmpning af induktion af mesenchymale markører (figur 3A) og EndMT-SP gener (figur 3 c), mens det ikke påvirker induktion af konventionelle TGF-β mål gener som fibronektin 1, PAI-1 og Smad7 (figur 3B) og downregulation i endothelial markører (figur 3D)26. Både TGF-β og miR-31 nedregulere Stk40, en negativ regulator af NF-κB vej, der fungerer som en potentiel regulator af EndMT-SP. Selv om TGF-β ikke øger udtryk for miR-31, inducerer TGF-β alternative polyadenylation-medieret udelukkelse af indre poly(A) sekvens i Stk40 3' UTR, hvilket styrker målretning af Stk40 af konstitutiv aktiv miR-31 og endelig undertrykke Stk4026. Derudover undersøgte vi tidligere roller af TGF-β-inducerbar miR-27b i EndMT27. Hæmning af miR-27 undertrykt opregulering af mesenchymale markører (figur 3A) mens virkningerne på konventionelle TGF-β target gener, EndMT-SP gener, og endotel markører var marginal (tal 3B, 3 C og 3D)27 .
Figur 1 : Induktion af EndMT i MS-1 celler af TGF-β. (A) Actin reorganisering i MS-1 celler efter 24 h af TGF-β2 behandling (1 ng/mL). (B) Morphological ændringer i MS-1 celler efter 72 h af TGF-β2 behandling (1 ng/mL). (C) andre analyser for VE-cadherin og α-SMA i MS-1 celler efter 72 h af TGF-β2 behandling (1 ng/mL). (D, E) Udtrykket ændringer i α-SMA, bestemmes af standard kvantitativ RT-PCR analyse (D) og Western blot analyse (E). (F) kollagen gel sammentrækning assay. Forholdet mellem areal efter 72 h kultur med/uden TGF-β2 behandling (1 ng/mL) til den oprindelige overflade vises. Skalere barer = 20 μm (A og C), og 200 μm (B). Tallene er ændret fra Mihira et al. 20. fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Vendbar virkningerne af TGF-β i MS-1 celler. (A) α-SMA mRNA udtryk og (B) celle morfologi efter tilbagetrækning af TGF-β2 i MS-1 celler. Skalere barer = 200 μm. Fejllinjer udgør standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : RNA-seq analyse i MS-1 celler. Efter indførelsen af LNA miRNA hæmmere og behandling med TGF-β2 (72 h) blev RNA-seq analyse udført26,27. NC: negativ kontrol. Udtrykket ændringer af repræsentative gener er vist (A, mesenkymale markører; B, konventionelle TGF-β target gener; C, EndMT-SP gener; og D, endotel markører). FPKM (fragmenter pr. kilobase af udskrift pr. million tilknyttede læser) værdier var normaliseret med værdier af en kontrolprøve (LNA-NC uden TGF-β2 behandling). Fejllinjer udgør standardafvigelser.
| Celletype | Betingelse af mesenchymale markør induktion | Reference |
| menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC) | Induktion af mesenchymale differentiering medium (TGF-β 5 ng/mL, PDGF BB 25 ng/mL), 5-21 dage. | Krenning et al. |
| menneskelige kutane mikrovaskulære endothelial celler (HCMEC) | Induktion af TGF-β2 (10 ng/mL), uden FBS, 2 dage. | Medici et al. |
| menneskelige koronar endotelceller (HCEC) | Induktion af TGF-B1 (10 ng/mL), 6 dage. Hæmning af BMP-7. | Zeisberg et al. |
| musen lunge endotelceller (MLEC) | Induktion af TGF-B1 (10 ng/mL), reducere til 2% FBS, uden endotel mitogen, 2 dage. | Zeisberg mfl. |
| rotte hjernen endotelceller (BEC) | Induktion af TGF-B1 (10 ng/mL), 2 dage. | Krizbai et al. |
| kvæg aorta endotelceller (BAEC) | Induktion af TGF-B1 (1 ng/mL), 5 dage. | Arciniegas et al. |
| udødeliggjort bovin retinal mikrovaskulære endotelceller (iBREC) | Induktion af TGF-β2 (10 ng/mL), 3-6 dage. | Deissler et al. |
| fåre aortaklappen endotelceller | Induktion af TGF-B1 eller 3 (1 ng/mL), 6 dage. | Paranya et al. |
| MS-1 mus i bugspytkirtlen mikrovaskulære endotelceller | Induktion af TGF-β (10 ng/mL), aktiveret Ras udtryk, 1 dag. | Hashimoto et al. |
| MS-1 mus i bugspytkirtlen mikrovaskulære endotelceller | Induktion af TGF-β2 (1 ng/mL), 2-3 dage. | Mihira et al. |
Tabel 1: induktion af EndMT af TGF -β i forskellige endotelceller. Kultur betingelser af EndMT induktion af TGF-β er sammenfattet. Ændringer i kultur betingelser herunder serum koncentration og tilsætning eller fjernelse af andre vækstfaktorer er også noteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er blevet rapporteret, at aktiveret Ras og TGF-β behandling for 24 h induceret EndMT i MS-1 celler, mens TGF-β alene undladt at fremkalde EndMT i denne korte periode21. Konsekvent, konstaterede vi, at TGF-β væsentligt induceret EndMT efter længere behandling (48-72 h) i MS-1 celler20. EndMT er gentagne gange blevet observeret efter langvarig behandling med TGF-β (2-6 dage) i forskellige endotelceller såsom menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC), menneskelige kutane mikrovaskulære endotelceller (HCMEC), menneskelige koronar endotelceller ( HCEC), mus lunge endotelceller (MLEC), rotte hjernen endotelceller (BEC), kvæg aorta endotelceller (BAEC), udødeliggjort bovin retinal mikrovaskulære endotelceller (iBREC) og fåre aorta ventil endotelceller8, 18,29,30,31,32,33,34. I tabel 1sammenfattet vi betingelserne af mesenchymale markør induktion af TGF-β i forskellige endotelceller8,18,20,21,29, 30,31,32,33,34. Sammenligning af disse rapporter tyder på, at hver endotel cellelinie har forskellige tærskler for EndMT. Differential følsomhed til TGF-β eller andre mekanismer kan ligge til grund for forskellige EndMT-relaterede patologiske tilstande i forskellige organer. Dette bør overvejes sammen med resultaterne af i vivo undersøgelser.
Detaljer af in vitro- EndMT induktion protokol skal skræddersys i forskellige cellelinier: fx., koncentration af TGF-β, koncentration af serum, tilføjelse eller fjernelse af andre vækstfaktorer og kultur periode. For eksempel, HUVECs ofte dårligt svare til TGF-β og EndMT ville være fremkaldt ved kombination med andre faktorer såsom PDGF BB og inflammatoriske stimuli og/eller graduering af serum koncentration og andre mellemstore komponenter i en længere kultur indstilling29 , 35. Derudover overconfluency ville mindske svar til TGF-β.
EndMT er en dynamisk proces og en modsat proces, der kaldes mesenchymale-endotel overgang (MEndoT) har været for nylig rapporteret36. Mens induktion af mesenchymale markører af TGF-β alene er reversibel i MS-1 celler (figur 2), det er blevet rapporteret at downregulation i endothelial markører i MS-1 celler med aktiveret Ras fortsatte efter tilbagetrækning af TGF-β21. Irreversibel EndMT er også blevet rapporteret i iBREC og får aortaklappen endotelceller33,34. Derudover viste en tidligere rapport, at EndMT processen varet efter tilbagetrækning af TGF-β på grund af en vedvarende aktivering af Ras-GTP og methylering af RASAL1 promotor i menneskelige koronar endotelceller37. Sammenligning af disse modeller kan således også nyttigt at forstå reguleringsmekanismer i endothelial celle plasticitet.
Lydhørhed i endothelial celler til EndMT induktion synes at være betydeligt heterogene38. Xiao et al. rapporterede, at tumor-specifik endotelceller fra en brystkirtler tumor model viser forskellige former for EndMT i svar til TGF-β stimulation38. TGF-β-drevet EndMT er også moduleres af andre signaling veje herunder FGF-2, BMP-7 og IL-1β35,37,38. Vi fandt også, at TNF-α forbedrer TGF-β-induceret EndMT og EndMT-SP i MS-1 celler26. Desuden er det velkendt, at EndMT er foranlediget af andre signaling veje herunder Wnt, hak og hypoxi1. Kombination med andre stimuli i forskellige endotelceller kan således vigtigt at forstå heterogenitet af EndMT reaktionsevne.
EndMT protokol præsenteres her kan let modificeret til at undersøge regulatorer af EndMT. Faktisk har vi kendetegnet forskellige regulatorer af EndMT i MS-1 celler20,26,27. En guanin nukleotid udveksling faktor Arhgef5 og myocardin-relaterede transskription faktor-en (MRTF-A) er fremkaldt af Smad signaler, og både bidrage til α-SMA Opregulering i MS-1 celler20. Således TGF-β signalering aktiverer begge Rho signaler og MRTF-A til at fremkalde EndMT. Derudover fandt vi også, at constitutively aktive miR-31 og TGF-β-inducerbar miR-27b positivt regulere EndMT induktion26,27. I MS-1 celler er constitutively aktive miR-31 også nødvendige for TGF-β-induceret EndMT-SP26. Samlet, disse in vitro- EndMT induktion procedurer ville være nyttig for forståelsen af EndMT biologi, identificere EndMT-associerede gen signaturer og udvikle strategier til at modulere denne proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Zea Borok og Kohei Miyazono for forslag under forberedelse af manuskript. H.I.S. og M.H. understøttes af Uehara Memorial Foundation Research Fellowship, og H.I.S. er understøttet af Osamu Hayaishi Mindelegat for Study Abroad. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Takeda Science Foundation (A.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |
References
- Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
- Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
- DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
- Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
- Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
- Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
- Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
- Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
- Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
- Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
- Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
- Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
- Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
- Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
- Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
- Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
- Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).
- Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
- Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
- Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
- Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
- Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
- Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
- Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
- Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
- Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).
