Summary
Un protocollo per l'induzione in vitro di transizione endoteliali mesenchimali (EndMT), che è utile per investigare le vie di segnalazione cellulare coinvolti nella EndMT, è descritto. In questo modello sperimentale, EndMT è indotta dal trattamento con TGF-β in cellule endoteliali MS-1.
Abstract
Plasticità fenotipica delle cellule endoteliali è alla base dello sviluppo del sistema cardiovascolare, malattie cardiovascolari e varie circostanze connesse con la fibrosi dell'organo. In queste condizioni, differenziate cellule endoteliali acquisiranno fenotipi mesenchymal-like. Questo processo è chiamato transizione endoteliali mesenchimali (EndMT) ed è caratterizzato da downregulation dei marcatori endoteliali, upregulation di indicatori mesenchymal e cambiamenti morfologici. EndMT è indotta da diverse vie di segnalazione, compreso (TGF) del fattore di crescita trasformante-β, Wnt e tacca e regolata da meccanismi molecolari simili a quelli di transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) importante per gastrulazione, fibrosi del tessuto, e metastasi del cancro. Comprensione dei meccanismi di EndMT è importante sviluppare approcci diagnostici e terapeutici EndMT di targeting. Induzione robusto del EndMT in vitro è utile per caratterizzare comune firme di espressione di gene, identificare meccanismi molecolari trattabili e dello schermo per modulatori di EndMT. Qui, descriviamo un metodo in vitro per l'induzione di EndMT. Le cellule endoteliali microvascolari del pancreas di mouse MS-1 subiscono EndMT dopo una prolungata esposizione a TGF-β e mostrano upregulation dei marcatori mesenchimali ed i cambiamenti morfologici così come induzione di più infiammatoria chemochine e citochine. Sono inclusi anche i metodi per l'analisi dei microRNA (miRNA) modulazione. Questi metodi forniscono una piattaforma per studiare i meccanismi alla base di EndMT e il contributo di Mirna a EndMT.
Introduction
Transizione endothelial-mesenchimale (EndMT) è il processo mediante il quale una cellula endoteliale differenziata subisce una varietà di cambiamenti molecolari, risultante in un fibroblasto-come delle cellule mesenchimali1. EndMT è stato inizialmente descritto come una trasformazione delle cellule endoteliali durante lo sviluppo del cuore2,3. Nello sviluppo iniziale del cuore, il tubo del cuore è costituito da un endocardio interno e un esterno miocardio. Questi due strati sono separati da uno strato di matrice extracellulare chiamato la gelatina cardiaca. Le cellule embrionali endocardial, che acquisiscono gli indicatori delle cellule endoteliali, transitano in cellule mesenchimali, invadono la gelatina cardiaca sottostante e promuovano la formazione dei cuscini cardiaci, fornendo le basi per le valvole atrioventricolari e setto e le valvole semilunari. Inoltre, EndMT è stata suggerita per essere fonti di periciti e cellule muscolari lisce vascolari in altri sistemi vascolare embrionale tra cui vasi coronarici, aorta addominale e dell'arteria polmonare4,5,6. Inoltre, EndMT è implicato nella fisiologico angiogenici spuntano7.
Raccogliendo la prova ha suggerito che EndMT è anche coinvolto in molteplici malattie cardiovascolari e altre malattie1,8. EndMT-collegato condizioni includono calcificazione vascolare, aterosclerosi, ipertensione arteriosa polmonare, malformazione cavernosa, fibrosi dell'organo, che ritocca dell'innesto della vena, disfunzione dell'allotrapianto in trapianto di rene e cancro8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. un recente rapporto descritto che diversi marcatori molecolari di EndMT possono essere uno strumento per la stima di diagnosi e prognosi della disfunzione renale dell'innesto nel trapianto di rene17. Modulazione delle vie di segnalazione cellulare EndMT-correlati sono stati indicati per migliorare le condizioni di malattia diversi tra cui fibrosi cardiaca e vena innesto rimodellamento in animale modelli8,15. Pertanto, la comprensione dei meccanismi sottostanti EndMT è importante sviluppare strategie diagnostiche e terapeutiche EndMT di targeting.
EndMT è caratterizzata da perdita di giunzioni della cellula-cellula, aumento potenziale migratorio, downregulation dei geni endoteliali specifici quali VE-caderina e il upregulation dei geni mesenchimali compreso actina α-liscia del muscolo (α-SMA). Inoltre, EndMT e transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), un processo simile che converte le cellule epiteliali in cellule mesenchimali, sono associati con alterata produzione di vari componenti della matrice extracellulare, che possono contribuire allo sviluppo di tessuti fibrosi8,19.
Recentemente, parecchi studi in vitro di EndMT hanno delucidato dettagli dei meccanismi molecolari di EndMT15,20. EndMT è indotta da varie vie di segnalazione compreso (TGF) del fattore di crescita trasformante-β, Wnt e tacca1. Fra loro, TGF-β svolge ruoli fondamentali nell'induzione di EMT e di EndMT. In EndMT, prolungata esposizione ai risultati di TGF-β in EndMT in varie cellule endoteliali, mentre breve esposizione sembra essere insufficiente21. Abbiamo descritto qui un semplice protocollo per induzione di EndMT, in cui miglio SVEN 1 (MS-1) cellule endoteliali microvascolari del pancreas del mouse subiscono EndMT in vitro dopo l'esposizione prolungata a TGF-β20. In questo modello, più a valle analisi possono essere eseguite per studiare le caratteristiche di marchio di garanzia di EndMT, tra cui i cambiamenti morfologici, downregulation dei marcatori endoteliali, upregulation di mesenchymal marcatori e geni infiammatori, del citoscheletro riorganizzazioni e contrazione del gel di collagene.
I microRNA (Mirna) sono ~ 22 nt piccoli RNA regolatori che dirigono posttranscriptional repressione di vari mRNA target22,23. Attraverso il riconoscimento di destinazione di sequenza-mediata del seme, Mirna sopprimono centinaia di geni bersaglio e modulano varie funzioni cellulari quali la motilità, proliferazione e differenziazione cellulare. Questo è anche il caso di regolamento di EMT ed EndMT, e diversi miRNA sono stati segnalati come regolatori di EMT ed EndMT24,25. Il modello EndMT presentato in questa recensione sono facilmente abbinabili con procedure di modulazione di miRNA per testare i ruoli di Mirna in EndMT. L'esame attuale riassume le nostre procedure sperimentali per studiare EndMT TGF-β-indotta in cellule MS-1 e include anche il confronto delle condizioni di induzione di EndMT di TGF-β in altre cellule endoteliali.
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Protocol
1. induzione di EndMT
- Mantenere MS-1 cellule in condizioni di coltura standard ed evitare confluency. Una fonte di cellule MS-1 è descritta nella Tabella materiali. Per cellule MS-1, è possibile utilizzare Medium-α minimo essenziale (MEM-α) con 10% siero fetale di vitello (FCS), 50 U/mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina.
- Cellule di lavare MS-1 su 10 cm piatto con 1x tamponato fosfato salino (PBS) e aggiungono 1,0 mL di tripsina alla piastra. Incubare per 5 min a 37 ° C.
- Staccare le celle utilizzando 9 mL di terreno di coltura. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300-400 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante delicatamente e sospendere il pellet cellulare in terreni di coltura pre-riscaldato.
- Conteggio di cellule vitali utilizzando soluzione di blu di Trypan e un emocitometro standard o un contatore di cellule automatico.
- Cellule di piastra MS-1 sui piatti di coltura standard non patinata a 0,5 x 103 cellule per cm2 per lungo termine cultura. Ad esempio, cellule3 piastra 5,0 x 10 per pozzetto in un 6 culture ben piatto. Utilizzare lo stesso supporto di cultura, tra cui la stessa concentrazione di FCS. In cellule di MS-1, TGF-β induce EndMT nella coltura a lungo termine (almeno 48-72 h) con l'uso di FCS.
- Stimolare le cellule endoteliali con TGF-β2 (una concentrazione finale di 1 ng/mL) dopo 24 h.
- Cellule di cultura in un incubatore (5% CO2, 37 ° C). Monitorare quotidianamente le cellule quando messa a fuoco sui cambiamenti morfologici.
- Sostituire il supporto con mezzi di coltura pre-riscaldato fresco contenente TGF-β2 dopo 48 h del trattamento con TGF-β nella coltura a lungo termine.
- Procedere alle analisi a valle. In genere, riorganizzazione dell'actina è osservata dopo 24 h di trattamento e di marcatori endoteliali sottoregolazione di mesenchymal marcatori sono stati osservati dopo 48-72 h del trattamento con TGF-β.
2. immunocitochimica
- Mantenere MS-1 cellule in condizioni di coltura standard.
- Le cellule di piastra MS-1 sui 4 cella ben diapositive camera cultura a 1,0 x 103 cellule per pozzetto (1,7 cm2). I vetrini sono pre-rivestiti con gelatina. Uso 0,5 – 1,0 mL di terreno di coltura per pozzetto.
- Stimolare le cellule endoteliali con TGF-β2 (una concentrazione finale di 1 ng/mL) dopo 24 h. Quando si analizza il coinvolgimento del ROCK in EndMT, aggiungere un 1 h prima ROCK inibitore Y-27632 (10 μM) al trattamento di TGF-β. Nel valutare l'effetto di inibizione di segnalazione di TGF-β, inibitori di chinasi del recettore TGF-β possono essere utilizzati.
- Cellule di cultura in un incubatore (5% CO2, 37 ° C). Riorganizzazione dell'actina è osservata in MS-1 cellule dopo 24 h di trattamento con TGF-β. Altre modifiche diventano evidenti dopo 48-72 h di trattamento. Per la cultura di 72 h, sostituire il supporto con TGF-β che contenevano fresco dopo 48 h del trattamento con TGF-β.
-
Macchiatura di F-actina
- Dopo 24 h di trattamento di TGF-β, rimuovere i supporti, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS 1X per 20 min a temperatura ambiente e sciacquare le cellule con PBS 1X.
- Incubare con 0,2% Triton X-100 per 5 min a temperatura ambiente.
- Sciacquare le cellule tre volte con PBS 1X.
- Incubare con falloidina-tetrametilrodamina B isotiocianato da Amanita phalloides diluito 150-fold con tampone bloccante per 1 h a temperatura ambiente.
- Sciacquare le cellule tre volte con PBS 1X.
- Macchia i nuclei con associazione di acido nucleico cianina coloranti per 5 min a temperatura ambiente.
- Diapositive di risciacquo e lamelle di Monte a faccia in giù su una diapositiva utilizzando diapositiva supporti di montaggio.
- Osservare con un microscopio confocale. Utilizzare laser a 543 nm e un filtro di emissione di 560 – 615 nm per il rilevamento della fluorescenza della falloidina. Utilizzare laser a 633 nm e un filtro di emissione più di 650 nm per la macchiatura nucleare. Sul trattamento con TGF-β, formazione di fibre spesse stress sarebbe essere osservati.
-
VE-caderina e α-SMA macchiatura
- Dopo 72 h del trattamento di TGF-β, rimuovere i supporti, fissare le cellule con freddo metanolo al 50% e 50% di acetone (0,5 – 1,0 mL per pozzetto) per 5 min.
- Sciacquare le cellule tre volte con PBS 1X (0,5 – 1,0 mL per pozzetto).
- Incubare con gli anticorpi primari in tampone bloccante durante la notte a 4 ° C al buio secondo la concentrazione consigliata dal produttore. Uso dell'anticorpo monoclonale di VE-caderina (BV13, diluizione 1: 100) e α-SMA Cy3-coniugato anticorpo monoclonale (1A4, diluizione 1: 200)20.
- Sciacquare le cellule tre volte con PBS 1X.
- Incubare le cellule con un anticorpo secondario coniugato con colorante verde VE-caderina anticorpo in tampone bloccante per 1 h a temperatura ambiente al buio secondo la concentrazione consigliata dal produttore.
- Sciacquare le cellule tre volte con PBS 1X.
- Macchia i nuclei con associazione di acido nucleico cianina coloranti per 5 min a temperatura ambiente.
- Diapositive di risciacquo e lamelle di Monte a faccia in giù su una diapositiva utilizzando diapositiva supporti di montaggio.
- Osservare con un microscopio confocale. Utilizzare laser a 543 nm e un filtro di emissione di 560 – 615 nm per il rilevamento di α-SMA (Cy3). Utilizzare laser a 488 nm e un filtro di emissione di 505 – 550 nm per il rilevamento di VE-caderina. In genere, sul trattamento con il trattamento di TGF-β, diminuire nei segnali di VE-caderina e avrebbe osservato aumento α-SMA segnali.
3. analisi di contrazione del Gel di collagene tridimensionale
- Eseguire colture di cellule di MS-1 con o senza TGF-β per 72 h prima dell'analisi di contrazione del gel di collagene.
- Preparare il tipo I gel di collagene sul ghiaccio. Mescolare la soluzione fredda collagene, 10x concentrata MEM medie e tampone di diluizione di collagene che contiene 0,05 N NaOH, 2,2% NaHCO3e 200 mM HEPES pH 7,4 a un 8:1:1 rapporto.
- Mescolare 200 mL di controllo o sospensioni di cellule endoteliali TGF-β-trattati (1.0 x 106 cellule/200 μL) e 800 μl di soluzione di gel di collagene. Per TGF-β campioni trattati, aggiungere TGF-β2 (1 ng/mL) per la sospensione delle cellule.
- Aggiungere 1,0 mL della miscela in ciascun pozzetto di piatti di coltura 12-pozzetti e lasciar per solidificare in incubatore a 37 ° C per 30 – 60 min.
- Dopo la gelatinizzazione, sovrapporre 1,0 mL di MEM-α contenente 10% FCS, 50 U/mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina a galleggiare il gel. Per TGF-β campioni trattati, aggiungere TGF-β2 (1 ng/mL) per i media.
Nota: Per i campioni trattati TGF-β, aggiungere TGF-β sia il gel e terreni di coltura. - Incubare i gel galleggianti a 37 ° C per 48 h.
- La scansione delle immagini di gel dalla parte inferiore delle piastre utilizzando uno scanner. In alternativa, registrare le immagini di gel utilizzando una fotocamera digitale ad una distanza fissa sopra il gel.
- Quantificare la superficie del gel, basata sul numero di pixel usando ImageJ. Selezionare il gel utilizzando una selezione a mano libera o strumenti di selezione relative al o l'utilizzo di gel "immagine | Regolare | Soglia di colore"tool e quindi determinare l'area di utilizzo di gel" Analyze | Comando di misura".
4. inibizione di miRNA attività di Locked Nucleic Acid-base miRNA inibitori
- Mantenere MS-1 cellule in condizioni di coltura standard.
- Transfect Locked Nucleic Acid (LNA) inibitori di miRNA, miRNA sintetico su due piani o siRNA (20 o 50 nM) utilizzando reagenti lipofezione secondo le istruzioni del fabbricante. Dettagli e fonti di miRNA inibitori LNA, duplex sintetici miRNA e siRNA furono descritti nel nostro precedente report26,27. In MS-1 cellule, procedure di transfezione standard basate su istruzioni del fabbricante, funzionano bene per introduzione di LNA miRNA inibitori, miRNA sintetico su due piani o siRNA.
- Dopo 16 – 48 h, stimolano le cellule endoteliali con TGF-β2 (una concentrazione finale di 1 ng/mL).
- Procedere a varie analisi a valle, tra cui analisi di espressione (RT-PCR quantitativa e analisi di sequenziamento di RNA (RNA-seq)) RNA, analisi immunocytochemical e analisi del reporter. Analisi successive sono state descritte nel nostro precedente report20,26,27.
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Representative Results
TGF-β è un potente induttore di EndMT in varie cellule endoteliali. Dopo il trattamento 24 ore con TGF-β in cellule MS-1, macchiatura per F-actina Mostra riorganizzazione dell'actina stress fibre (Figura 1A)20. Il pretrattamento con un inibitore ROCK Y-27632 inibisce l'induzione di actina riorganizzazione20. MS-1 cellule endoteliali modificare da una classica morfologia di ciottoli-come a una morfologia fusiforme mesenchymal previo trattamento di TGF-β (Figura 1B). TGF-β-ha trattato le cellule perdono contatto cellula-cellula. Dopo il trattamento con TGF-β per 48-72 h, analisi immunocitochimiche dimostrano diminuita espressione di VE-caderina e l'espressione aumentata di α-SMA (Figura 1). TGF-β drasticamente induce l'espressione di α-SMA a livelli di mRNA e di proteina in cellule MS-1 dopo 48-72 h di trattamento (figure 1 e 1E). Comprende mammiferi TGF-β TGF-β1, 2 e 3 isoforme. Uno studio precedente utilizzando espianti Endocardica cuscino mouse coltivato ha dimostrato che il TGF-β2 ma non TGF-β3 è obbligatoria per la trasformazione di difetto del cuscinetto endocardico cellule28. D'altra parte, abbiamo tradotto ha confrontato gli effetti di tre isoforme sull'espressione di α-SMA e confermato che tutte le isoforme similmente induce espressione di α-SMA in MS-1 cellule20. Analisi di contrazione del gel di collagene dimostra una maggiore contrazione del collagene di tipo che gel da MS-1 cellule dopo il trattamento di TGF-β (Figura 1F). Questo effetto suggerisce l'acquisizione di capacità delle cellule mesenchimali di rimodellare la matrice extracellulare. Queste caratteristiche sono tratti di segno distintivo di EndMT20. Nella nostra precedente relazione20, trattamento con un inibitore ROCK Y-27632 soppresso forte induzione di indicatori mesenchymal α-SMA e SM22α senza concomitante soppressione dell'induzione di altri geni bersaglio di TGF-β come fibronectina 1 e MMP-2.
EndMT è un processo altamente dinamico. In MS-1 cellule, gli effetti di TGF-β sulla espressione di α-SMA e la morfologia sono reversibili; Dopo la privazione di TGF-β, α-SMA espressione diminuisce a livelli basali (Figura 2A) e cellule di recupero una sanpietrino-come la morfologia (Figura 2B). Inoltre, induzione di EndMT ed EMT è associato a cambiamenti dinamici nella capacità secretiva di multiple chemochine e citochine. Più infiammatoria chemochine e citochine compreso CCL17, CX3CL1, CXCL16, IL-6 e Angptl2 sono indotti dal TGF-β in cellule di MS-1, che abbiamo indicato precedentemente associati EndMT secretiva fenotipo (EndMT-SP)26. Questo modello sperimentale è utile per indagare i regolatori putativi di EndMT ed EndMT-SP. In precedenza abbiamo studiato i ruoli dei diversi Mirna in EndMT migliorando o inibendo miRNA attività26,27. In MS-1 cellule, miRNA attività può essere modulata robustamente da miRNA mimico oligonucleotidi o basati su LNA miRNA inibitori e saggi multipli a valle, tra cui analisi di RNA-seq possono essere facilmente eseguita (Figura 3). Basato su analisi del trascrittoma integrativa, ci siamo collegati in precedenza costitutivamente attiva miR-31 EndMT regolamento in MS-1 cellule26. Analisi di RNA-seq ha dimostrato che l'inibizione di miR-31 LNA miRNA inibitore risultato attenuazione di induzione di mesenchymal marcatori (Figura 3A) e geni EndMT-SP (Figura 3), mentre non influisce sulla induzione di destinazione convenzionale di TGF-β geni quali fibronectina 1, PAI-1 e Smad7 (Figura 3B) e downregulation di marcatori endoteliali (Figura 3D)26. MiR-31 e TGF-β downregulate Stk40, un regolatore negativo della via di NF-κB, che agisce come un regolatore di potenziale di EndMT-SP. Anche se TGF-β non aumenta l'espressione di miR-31, TGF-β induce alternativa esclusione di poliadenilazione-mediata della sequenza di poli (a) interno in Stk40 3' UTR, migliorando così il targeting di Stk40 costitutivo attivo miR-31 e infine sopprimendo Stk4026. Inoltre, abbiamo esaminato in precedenza i ruoli di TGF-β-inducible miR-27b in EndMT27. Inibizione di miR-27 ha soppresso il upregulation degli indicatori mesenchymal (Figura 3A) mentre gli effetti su geni bersaglio del TGF-β convenzionale, geni EndMT-SP, e gli indicatori endothelial sono stati marginali (figure 3B, 3C e 3D)27 .
Figura 1 : Induzione di EndMT in MS-1 cellule di TGF-β. (A) riorganizzazione dell'actina in MS-1 cellule dopo 24 h di trattamento TGF-β2 (1 ng/mL). Morfologiche (B) modifiche nelle celle di MS-1 dopo 72 h del trattamento di TGF-β2 (1 ng/mL). (C) Immunocytochemical analizza per VE-caderina e α-SMA in MS-1 cellule dopo 72 h del trattamento di TGF-β2 (1 ng/mL). (D, E) Cambiamenti di espressione in α-SMA, determinato dall'analisi di RT-PCR quantitativa standard (D) e Western blot analisi (E). (F) collagene gel dosaggio di contrazione. Il rapporto tra l'area della superficie dopo cultura 72h con o senza trattamento di TGF-β2 (1 ng/mL) alla superficie originale vengono visualizzati. Scala bar = 20 μm (A e C) e 200 μm (B). Figure vengono modificati da Mihira et al. 20. barre di errore rappresentano deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Effetti reversibili di TGF-β in cellule MS-1. Espressione di mRNA di α-SMA (A) e (B) morfologia delle cellule dopo ritiro di TGF-β2 in cellule MS-1. Scala bar = 200 μm. Barre di errore rappresentano deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi di RNA-seq in cellule MS-1. Dopo introduzione di LNA miRNA inibitori e trattamento con TGF-β2 (72 h), analisi di RNA-seq era eseguito26,27. NC: controllo negativo. Cambiamenti di espressione di geni rappresentativi sono indicati (A, mesenchymal marcatori; B, convenzionale geni bersaglio di TGF-β; C, geni EndMT-SP; e D, marcatori endoteliali). FPKM (frammenti per kilobase di trascrizione per letture mappate milioni) i valori sono stati normalizzati con i valori di un campione di controllo (LNA-NC senza trattamento di TGF-β2). Barre di errore rappresentano deviazioni standard.
| Tipo di cella | Condizione di induzione indicatore mesenchymal | Riferimento |
| cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC) | Induzione di mezzo di differenziazione mesenchymal (TGF-β 5 ng/mL, PDGF-BB 25 ng/mL), 5 – 21 giorni. | Krenning et al. |
| cellule endoteliali microvascolari cutanee umane (HCMEC) | Induzione di TGF-β2 (10 ng/mL), senza FBS, 2 giorni. | Medici et al. |
| cellule endoteliali coronarie umane (HCEC) | Induzione di TGF-β1 (10 ng/mL), 6 giorni. Inibizione di BMP-7. | Zeisberg et al. |
| cellule endoteliali del mouse del polmone (MLEC) | Induzione di TGF-β1 (10 ng/mL), ridurre al 2% FBS, senza endoteliale mitogene, 2 giorni. | Zeisberg et al. |
| cellule endoteliali del cervello del ratto (BEC) | Induzione di TGF-β1 (10 ng/mL), 2 giorni. | Krizbai et al. |
| cellule endoteliali aortiche bovine (BAEC) | Induzione di TGF-β1 (1 ng/mL), 5 giorni. | Arciniegas et al. |
| immortalizzate retiniche microvascolari cellule endoteliali bovine (iBREC) | Induzione di TGF-β2 (10 ng/mL), 3 – 6 giorni. | Deissler et al. |
| cellule endoteliali di ovini della valvola aortica | Induzione di TGF-β1 o 3 (1 ng/mL), 6 giorni. | Paranya et al. |
| Cellule endoteliali microvascolari del pancreas di mouse MS-1 | Induzione di TGF-β (10 ng/mL), attivato espressione di Ras, 1 giorno. | Hashimoto et al. |
| Cellule endoteliali microvascolari del pancreas di mouse MS-1 | Induzione di TGF-β2 (1 ng/mL), 2 – 3 giorni. | Bughy et al. |
Tabella 1: induzione di EndMT di TGF -β in varie cellule endoteliali. Condizioni di coltura di induzione di EndMT da TGF-β sono ricapitolate. Inoltre sono notati cambiamenti nelle condizioni di cultura tra cui concentrazione nel siero e aggiunta o rimozione di altri fattori di crescita.
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Discussion
È stato segnalato che attivato trattamento Ras e TGF-β per 24 h ha indotto la EndMT in cellule di MS-1, mentre TGF-β da solo non è riuscito a indurre EndMT in questo breve periodo21. Coerentemente, abbiamo osservato che TGF-β sostanzialmente indotto EndMT dopo trattamento più lungo (48-72 h) in MS-1 cellule20. EndMT è stato più volte osservato dopo il trattamento prolungato con TGF-β (2 – 6 giorni) in varie cellule endoteliali come cordone ombelicale umano cellule endoteliali (HUVEC), cutanee cellule endoteliali microvascolari umane (HCMEC), cellule endoteliali coronarie umane (della vena HCEC), cellule endoteliali del mouse del polmone (MLEC), cellule endoteliali del cervello del ratto (BEC), cellule endoteliali aortiche bovine (BAEC), immortalate retiniche microvascolari cellule endoteliali bovine (iBREC) e ovini aortico valvola cellule endoteliali8, 18,29,30,31,32,33,34. Nella tabella 1, abbiamo riassunto le condizioni di induzione mesenchymal marcatore da TGF-β in varie cellule endoteliali8,18,20,21,29, 30,31,32,33,34. Il confronto di questi rapporti suggerisce che ogni linea cellulare endoteliale ha diverse soglie per EndMT. Sensibilità differenziale di TGF-β o altri meccanismi possono essere alla base di diverse condizioni patologiche correlate a EndMT nei diversi organi. Questo dovrebbe essere considerato unitamente ai risultati degli studi in vivo .
I dettagli di in vitro EndMT induzione protocollo devono essere adattati in differenti linee cellulari: ad es., concentrazione di TGF-β, concentrazione di siero, aggiunta o rimozione di altri fattori di crescita e il periodo di coltura. Ad esempio, HUVECs rispondere spesso poco di TGF-β ed EndMT sarebbe indotta dalla combinazione con altri fattori quali PDGF-BB e stimoli infiammatori e/o modulazione della concentrazione nel siero e altri componenti medi in una cultura più impostazione29 , 35. Inoltre, overconfluency avrebbero mitigato le risposte di TGF-β.
EndMT è un processo dinamico e un processo opposto chiamato transizione mesenchimale-endoteliale (MEndoT) è stato recentemente segnalato36. Mentre l'induzione di mesenchymal marcatori di TGF-β da solo è reversibile in cellule MS-1 (Figura 2), è stato segnalato che downregulation dei marcatori endoteliali in MS-1 cellule con Ras attivato ha persistito dopo ritiro di TGF-β21. EndMT irreversibile è stato segnalato anche in iBREC e valvola aortica ovina cellule endoteliali33,34. Inoltre, un rapporto precedente ha mostrato che il processo di EndMT ha persistito dopo ritiro di TGF-β a causa di una prolungata attivazione di Ras-GTP e metilazione del promotore RASAL1 in cellule endoteliali coronarie umane37. Quindi, confronto di questi modelli possono essere anche utili per capire i meccanismi di regolazione della plasticità delle cellule endoteliali.
La reattività delle cellule endoteliali a induzione di EndMT sembra essere sostanzialmente eterogenei38. Xiao et al ha segnalato che le cellule endoteliali del tumore-specifici da un modello di tumore mammario mostrano forme distinte di EndMT in risposta a stimolazione di TGF-β38. EndMT di TGF-β-guidato è modulata anche da altre vie di segnalazione tra cui FGF-2, BMP-7 e IL-1 β35,37,38. Abbiamo anche trovato che il TNF-α aumenta TGF-β-induced EndMT ed EndMT-SP in MS-1 cellule26. Inoltre, è ben noto che EndMT è indotta da altre vie di segnalazione Wnt, tacca e ipossia1di compreso. Quindi, la combinazione con altri stimoli in varie cellule endoteliali può essere importante capire l'eterogeneità della risposta EndMT.
Il protocollo di EndMT qui presentato può essere facilmente modificato per indagare i regolatori di EndMT. In realtà, abbiamo caratterizzato vari regolatori di EndMT in MS-1 cellule20,26,27. Un fattore di scambio di nucleotide della guanina Arhgef5 e il fattore di trascrizione myocardin-correlati-A (MRTF-A) è indotti da segnali di Smad, ed entrambi contribuiscono al α-SMA upregulation in MS-1 cellule20. Pertanto, segnalazione di TGF-β attiva entrambi i segnali di Rho e MRTF-A indurre EndMT. Inoltre, abbiamo anche trovato che costitutivamente attiva miR-31 e TGF-β-inducible miR-27b regolano positivamente EndMT induzione26,27. In cellule di MS-1, miR-31 costitutivamente attiva occorre inoltre per indotta da TGF-β EndMT-SP26. Nel complesso, queste procedure di induzione del EndMT in vitro sarebbe utile per la comprensione della biologia di EndMT, l'identificazione di firme di gene EndMT-collegato e sviluppare strategie per modulare questo processo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Zea Borok e Kohei Miyazono per suggerimenti in preparazione del manoscritto. H.I.S e M.H. sono supportati da Uehara Memorial Foundation Research Fellowship e H.I.S è supportato dal Osamu Hayaishi Memorial Scholarship per studiare all'estero. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione da Takeda Science Foundation (A.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |
References
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