Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57586
Automatic Translation
1, 2, 4, 4, 1, 2,3
1Department of Surgery, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin College of Engineering, 4Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

כאן אנו מציגים, ניגודיות שני פרוטוקולים נהגה decellularize רקמות הצמח: גישה מבוססת דטרגנט וגישה ללא חומרי ניקוי. שתי השיטות להשאיר מאחור את מטריצה חוץ-תאית של רקמות הצמח בשימוש, אשר אז יכול להיות מנוצל כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.

Abstract

השתלים עצמיים סינתטי, מהחי המשמשים כעת בתור פיגומים להחלפת רקמות יש מגבלות בשל זמינות נמוכה, הביו המסכן ועלות. רקמות הצמח יש מאפיינים חיוביים שהופכים אותם באופן ייחודי מתאים להשתמש פיגומים, כגון שטח גבוהה, תחבורת מים מעולה ושמירה, נקבוביות מחוברים, המקובץ רשתות כלי דם, ומגוון רחב של מכונות מאפיינים. שתי שיטות מוצלחת של צמח decellularization עבור יישומים הנדסת רקמות מתוארים כאן. השיטה הראשונה מבוססת על אמבטיות דטרגנט להסיר חומר הסלולר, הדומה שנוצרו קודם לכן שיטות השתמשו כדי לנקות רקמות יונקים. השניה היא שיטה ללא דטרגנט הותאם מפרוטוקול מבודד להערכת עלה, כרוכה בשימוש אקונומיקה מחוממת וחדר אמבט מלח כדי לנקות את העלים והגבעולים. שתי השיטות תשואות פיגומים עם תכונות מכניות דומות, השפעה מטבולית סלולרית נמוכה, ובכך מאפשר למשתמש לבחור פרוטוקול אשר מתאים יותר יישום המיועד שלהם.

Introduction

הנדסת רקמות הופיע בשנות השמונים כדי ליצור רקמה חיה תחליפים, ואפשרות כתובת משמעותית האיברים והרקמות מחסורים1. אסטרטגיה אחת השתמשה פיגומים כדי לעורר את הגוף להתחדש חסרים לרקמות או לאיברים מדריך. למרות מתקדם ייצור גישות כגון הדפסה תלת-ממדית יצרו פיגומים עם מאפיינים הפיזיים ייחודיים, היכולת לייצר פיגומים עם מגוון רחב של מאפיינים פיזיים וביולוגיים השגה נשאר אתגר2 , 3. יתר על כן, עקב מחסור של רשת כלי הדם פונקציונלי, טכניקות אלו היה מוגבל בהתחדשות רקמות תלת-ממדי. השימוש decellularized ברקמות בעלי חיים ואנושית כמו פיגומים עזר תוך עקיפת זו בעיה4,5,6,7. עם זאת, עלות גבוהה, השתנות אצווה-כדי-אצווה וזמינות מוגבלים עלולה להגביל השימוש הנרחב של פיגומים חיה decellularized8. ישנם חששות לגבי העברת מחלות פוטנציאליות לחולים ותגובה אוטואימונית כמה רקמות בתרבית של decellularized9.

תאית, נגזר צמח ו מקורות חיידקי, נעשה שימוש נרחב לייצר biomaterials למגוון רחב של יישומים רפואה רגנרטיבית. להלן מספר דוגמאות: עצם10,11, סחוס12,13,14 ו-15ריפוי הפצע. פיגומים זה מורכבות תאית יש יתרון נוסף בכך הם הם עמידים עמידים להיות שבור על-ידי תאי יונקים. זה בשל העובדה כי בתרבית של תאים אינם מייצרים אנזימים הדרושים לשבור מולקולות תאית. לשם השוואה, פיגומים המיוצר באמצעות מקרומולקולות של מטריצה חוץ-תאית, כמו קולגן, מפורקים ברצון16 , לא יכול להיות גם מתאים ליישומי לטווח ארוך. קולגמן יכול מיוצב על ידי cross-linking כימי. עם זאת, יש פשרה עקב רעילות הטבועה של cross-linkers להשפיע על התאימות של ה-פיגומים17. לעומת זאת, תאית יש פוטנציאל להיות נוכח באתר של ההשתלה לתקופות ממושכות של זמן כי הוא חסין מפני השפלה אנזימטי תאים בתרבית של18,19,20. זה יכול להשתנות על-ידי כיוונון הקצב של השפלה באמצעות הידרוליזה רעלני ואספקה שיתוף של פיגומים עם cellulases21. התאימות של תאית decellularized הצמחי פיגומים ויוו הוכח גם במסגרת מחקר על עכברים22.

דרך מאות מיליוני שנים של אבולוציה, צמחים יש מעודן שלהם מבנה והרכב כדי להגביר את היעילות של תחבורה נוזלים ושמירה. כלי הדם צמח למזער הידראולי ההתנגדות על ידי הסתעפות לתוך כלי קטן יותר, בדומה להערכת יונקים על פי החוק של מורי23. לאחר decellularization, רשת מורכבת של הצמח של כלים נקבוביות מחוברים נשמר. בהתחשב המספר העצום של מיני צמחים שונים זמינים, פיגומים הצמחי יש את היכולת להתגבר על מגבלות עיצוב משפיע כעת פיגומים הנדסת רקמות24,25. למשל, Modulevsky. et al. הוכיח כי ההעברה אנגיוגנזה ותא התרחשה כאשר אפל decellularized רקמות הושתל subcutaneously על גב עכבר22. באופן דומה, Gershlak. et al. הראה כי תאי אנדותל יכול להיות מבוגר בתוך להערכת העלים decellularized24. בניסוי נפרדים, Gershlak. et al. היו גם מסוגל להראות כי cardiomyocytes יכול להיות גדל על פני השטח של עלים, הצליחו חוזה24.

צמחים כוללים גם ארגון מורכב מן הטלפון הסלולרי הסולם מאקרוסקופית, שקשה להשיג אפילו עם טכניקות הייצור המתקדמים ביותר שפותחה עד היום. העיצוב הירארכי מורכבים של רקמות הצמח מחזק מסכום המרכיבים שלהם26אותם. צמחים בעלי שפע של תכונות מכאניות שונות החל נוקשה וקשוח רכיבים כגון הגבעולים, אלה הרבה יותר גמיש, גמיש כמו עלים27. העלים משתנים בהתאם המינים מבחינת גודל, צורה, לשבור את כוח, מידת vascularization, והוא מסוגל לשאת דרגות שונות של hydrophilicity. בסך הכל, מאפיינים אלה צמח מראים כי צמחים decellularized יכול לשמש פונקציונליים מאוד וייחודי ומכשור רפואי, כולל רקמות הנדסה פיגומים.

פרוטוקול זה מתמקד בשתי שיטות כדי decellularize רקמות הצמח, כגון עלים, גבעולים, לשימוש פיגומים בהנדסת רקמות. השיטה הראשונה היא טכניקה המבוססת על חומרי ניקוי המשתמשת סדרה של אמבטיות להסיר את ה-DNA והחומר הסלולר, אשר הותאם של טכניקה בשימוש נרחב decellularize יונקים ולשתול רקמות6,22,25 ,28,29,30. השיטה השנייה היא ללא דטרגנט והוא ממאמרו של פרוטוקול "skeletonization" משמש בדרך כלל כדי להסיר רקמות רכות של עלים31. בעבר הראו כי רותח עלים בפתרון אקונומיקה, סודיום ביקרבונט הקל פרידתה של להערכת הרקמות שמסביב31. טכניקה זו אפשר להביא חזרה על ניסויים שבוצעו ב 17 אתth ו המאותה 18, כגון העבודה של אלברטוס סבע32 ו אדוארד פאריש33. ניסויים אלה כיעד עוזב משנה הצמח, כגון עלים ופירות, שקוע במים לתקופות ממושכות של זמן (שבועות עד חודשים) ומאפשר הרקמות רך יותר לריקבון משם באופן טבעי. כאן הגישה "skeletonization" מותאמת לשימוש תנאים מתון יותר, כגון פעמים יותר זמן דגירה בטמפרטורות נמוכות, כדי להסיר את שאריות תאי וכדי למנוע באופן משמעותי לשבש את מבנה רקמות רכות. על הניסויים מפורט במסמך זה, שימשו שלושה סוגי צמחים: פיקוס hispida, Pachira aquatica , זן של Garcinia. התוצאות של ה-DNA כימות בדיקות מכניות, השפעה על פעילות חילוף החומרים הסלולר של שתי השיטות שתוארו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. decellularization של רקמת הצמח באמצעות גישה מבוססת-חומרי ניקוי

  1. השתמש טרי או קפוא hispida פ, דגימות עלים. הקפאת דגימות טריים שאינם בשימוש מקפיא-20 ° C, חנות לשימוש עתידי (עד שנה).
    הערה: השתמש רקמות הגבעול או עלה של כמעט כל צמח הרצוי. אחסון מורחב פעמים יכול לגרום נזק לרקמות.
    1. לקבוע את הגודל והצורה של דגימות להיות מעובד על בסיס השימוש המיועד של המדגם (כלומר מדגמים חתוך לרצועות מתאימים היטב עבור יישומי בדיקות מכניות, בינתיים 8 מ"מ דיסק דוגמאות שימושיות ביישומים culturing רב טוב ). חותכים העלה 8 מ"מ דיסקים עם ביופסיה חדה, נקייה אגרוף בזמן שקוע מתחת לטמפרטורת החדר (20-25 ° C) יונים H2O.
      פתק: ניתן להשתמש בפרוטוקול זה על כל העלים והגבעולים. עם זאת, דגימות קטנות decellularize מהר יותר.
    2. דגירה בדגימות למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר (20-25 ° C) יונים H2O על סט צלחת טלטול להגדרת מהירות נמוכה לשטוף ו/או להפשיר אותם. השתמש מספיק יונים H2O כדי להבטיח שכל הדגימות wetted ביסודיות.
  2. להכין פתרון של 10% (w/v) dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) יונים H2O. המקום הדגימות במיכל מתאים (בכוס, או צלחת פלסטיק הוא אידיאלי) ולהוסיף מרחביות פתרון לכסות לגמרי את הדגימות. דגירה בדגימות במשך 5 ימים בטמפרטורת החדר (20-25 ° C) על סט צלחת לנער כדי מהירות נמוכה כדי למנוע נזק הדגימות.
    הערה: לא overcrowd את המיכל כמו זה יכול להאט את תהליך decellularization, להוביל טיפול לא אחיד לפי זמנים תוססים. במהלך שלב זה, דוגמאות כדאי לרכוש גוון חום.
    1. לאחר 5 ימים, החלף הפתרון מרחביות יונים H2O. Incubate הדגימות דקות 10-15 נוספים על הצלחת לנער כדי לשטוף ביסודיות כל פתרון מרחביות שיורית.
  3. להכין חומרים פעילי שטח ללא יונית של 1% (v/v) בתמיסה אקונומיקה 10% (v/v). כדי להפוך את פתרון 500 מ"ל, מערבבים 5 מיליליטר חומרים פעילי שטח ללא יונית עם 50 מ של אקונומיקה ואז להוסיף 445 מ של יונים H2O. Submerge דוגם בפתרון המוכנים באופן טרי.
    הערה: הפתרון חומרים פעילי שטח ללא יונית/אקונומיקה אין חיי מדף ארוכים, לכן, אמור לשמש בתוך 48 שעות של הכנה.
  4. להחליף את הפתרון חומרים פעילי שטח ללא יונית/אקונומיקה בכל 24 שעות עד הדגימות נמחקים לחלוטין (עיין איור 1A להשוואה ויזואלית). ואז דגירה המדגם במים יונים על צלחת טלטול למשך 2 דקות כדי לשטוף הפתרון עודף חומרים פעילי שטח ללא יונית/אקונומיקה. הגדר את הצלחת לנער קביעת ערך נמוך כדי למנוע פגיעה הדגימות.
    הערה: הזמן הנדרש כדי לנקות את דגימות המשמשות משתנה, בהתאם לסוג מינים של הצמח. Discoloring מלאה של הדגימות הוא מרמז על decellularization מלא (לבצע כימות דנ א כדי להבטיח ניקוי יסודי).
    1. Lyophilize את הדוגמאות כדי לאחסן אותם עד שנה (פלאש הקפאה בעזרת חנקן נוזלי הוא המועדף, הקפאת דגימות ב- 80 ° C הוא גם מקובל) ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר (20-25 ° C) בלחות נמוכה.
    2. לשקם דוגמאות טריס-HCl (10 מ מ, pH 8.5) באמצעות מספיק כדי המעיל דגימות. לשטוף דגימות 2 - 3 פעמים בתקשורת ללא סרום בעדינות באמצעות micropipette לפני השימוש (קרי שימוש 150-300 µL לכל שטיפה, לתוך צלחת רגילה טוב 24).
      הערה: מאגר טריס-HCl ומדיה ללא סרום (קרי DMEM, אבל כל תרבות התא הבסיסי ניתן יהיה להחליף את המדיה) הם יעיל יותר בהורדת להשפעה תא הכדאיות של דגימות מרחביות התייחסו יותר מאלה שטופלו יונים H2O לבד.

2. הכנת דוגמאות באמצעות גישה ללא חומרי ניקוי Decellularization

הערה: השלבים הראשונים של הליך זה מתנגשים עם שלבים 1.1-1.1.2 (ראה לעיל).

  1. להכין 5% (v/v) מלבין (NaClO) של 3% (w/v) הפתרון סודיום ביקרבונט (NaHCO3). חממו את הפתרון בשכונה fume ל- 60-70 ° C עבור דגימות עלים פ hispida לחתוך לתוך דיסקים 8 מ"מ תוך כדי ערבוב על פלטה חמה.
    הערה: ניתן להחליף את סודה לשתייה עם נתרן פחמתי (2CO נה3), או הידרוקסיד הנתרן (NaOH). הטמפרטורה הרצויה משתנה באופן משמעותי (מ בטמפרטורת החדר עד 90 ° C), צריך להיות מותאם על פי המאפיינים של הדגימות בשימוש.
  2. מרגע שהתמיסה הטווח לטמפרטורה הרצויה, להטביע את הדגימות, להפחית את המהירות מלהיב כדי למנוע פגיעה בהם. לאחר הדגימות נמחקים בעליל (ראה איור 1B להשוואה ויזואלית), להסיר האמבטיה בקפידה. דגירה דגימות פעם ב יונים H2O למשך 1-2 דקות להסיר עודפי אקונומיקה פתרון.
    הערה: הזמן הנדרש כדי לנקות את הדגימות יכול להשתנות באופן נרחב. לדוגמה, פטרוזיליה חתוך ניתן לפנות ב 10-15 דקות, בזמן דגימות עבה יותר ו/או גדולים יותר כגון כל עלים או גבעולים ניתן לקחת שעות בטמפרטורה גבוהה אמבטיות כדי לנקות לחלוטין.
  3. Lyophilize את הדגימות ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר (20-25 ° C) בלחות נמוכה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שתי השיטות הניב פיגומים שהיו מתאימים עבור יישומי הנדסה תרבית תאים ורקמות. איור 1 מציג את תהליך העבודה הכללי של התהליך decellularization באמצעות עלים שלמים של שיטה המבוססת על חומרי ניקוי ו לחתוך דוגמיות (8 מ מ קוטר) עבור פעולת השירות ללא חומרי ניקוי. Decellularization מוצלחת של רקמות פיקוס hispida בעקבות שתי השיטות הניב דוגמאות ברורות ללא פגע (איור 1A ו 1B). היה אפשר decellularize רקמות הצמח כולו (איור 1 א'); עם זאת, דגימות קטנות יותר הופיע כדי לנקות מהר יותר וביעילות רבה יותר. בעיית פוטנציאליים נצפתה עם הגישה המבוסס על אבקת מעורב decellularization הטרוגניות עקב הסרה מוקדמת מהאמבטיה ללא יונית חומרים פעילי שטח (איור 1C). החיסרון של השיטה ללא דטרגנט הוא כי הנזק יכול להתרחש עקב דגירה ממושכת באמבטיה מחוממת (איור 1D).

תכונות מכניות של פיגומים decellularized שהוכנו באמצעות שתי השיטות נחקרו באמצעות בדיקות מתיחה uniaxial כפי שנעשה ב-24,האחרות מחקרים34. בדיקות הניב את המשיק המקסימום (MTM) (איור 2 א), זן כשל (SAF) (איור 2B), וכן מתיחה (UTS) (איור 2C) עבור דגימות פ hispida Pachira aquatica . דוגמאות aquatica פ שהוכנו באמצעות פרוטוקולים decellularization להציג תכונות מכניות דומה על פני כל שלושת הפרמטרים הנמדדים. הדגימות פ hispida הראו מגמה דומה בכל המקרים למעט UTS בדיקות. בפרט, דגימות שהוכנו באמצעות הפרוטוקול (מרחביות) המבוסס על אבקת היו תוצאות UTS ממוצע גבוה יותר מאשר אלו המוכנים הגישה (אקונומיקה) ללא חומרי ניקוי. תוצאות אלו מראות כי הדגימות שנאספו מכל מיני צמחים שונים אולי לייצר מאפיינים ברורים לגרדום decellularized כאשר להכין אותה באמצעות הפרוטוקולים decellularization שני.

כדי למדוד את הסרת ה-DNA, דגימות פונו באמצעות כל אחת מהשיטות, הדנ א הגנומי שלהם הופרדה באמצעות פרוטוקול שנקבעו קודם על35. שתי השיטות decellularization (מבוססי דטרגנט ללא דטרגנט) ירד באופן משמעותי את התוכן דנ א גנומי של דגימות 2.47 ng של הדנ א/מ"ג (n = 3, s = 0.18) ו- 2.71 ng של הדנ א/מ"ג של רקמות (n = 3, s = 1.60) בהתאמה (איור דו-ממדי). בדגימות Non-decellularized היה 104.67 ng של הדנ א/מ"ג של רקמות (n = 3, s = 26.21) (איור דו-ממדי). הירידה משמעותי בתוכן דנ א לאחר decellularization המצוין של סילוק יעיל של תא צמח משנה.

ההשפעה על התא הכדאיות של שתי השיטות decellularization הוערכה על ידי מדידת הפעילות המטבולית של fibroblasts עורי אנושי (hDF) בתרבית במשך יומיים בנוכחות decellularized aquatica פ או Garcinia פיגומים. hDFs הייתה פעילות מטבולית גבוהה יותר כאשר תרבותי בנוכחות פיגומים decellularized באמצעות שיטת ללא דטרגנט לעומת אלה שהוכנו באמצעות השיטה מבוססת דטרגנט (איור 3 א). כדי להבטיח הסרה יסודית של ריאגנטים ששימש את decellularization, קבוצה נוספת של הניסויים בוצעה בו פיגומים מוכן נשטפו בהרחבה לפני תרבית תאים. שתי שיטות כביסה נפרד נבדקו על דגימות שהוכנו באמצעות הגישה מבוססת על חומרי ניקוי: שטיפה במאגר טריס-HCl (10 מ מ, pH 8.5) ואחריו שטיפה של מדיה פנויה סרום נגד שוטף 2 יונים H2O. שתי הגישות להשתמש כביסה הסופי צעדים עם 1 x PBS. הפגיעה בתאי יונקים נחשפים לאחר מכן פיגומים צמח decellularized נמדדה באמצעות וזמינותו פעילות חילוף החומרים אותו כאמור לעיל. מאגר טריס-HCl (10 מ מ, pH 8.5) ואחריו מדיה פנויה סרום עזר להפחית את ההשפעה על פעילות מטבולית תאית לעומת יונים H2O, ביצוע דגימות שטופלו להשוות דגימות מן ללא דטרגנט הגישה מבוססת-חומרי ניקוי שיטה (איור 3B).

היא שודרה בעבר כי תאים בתרבית של יכול לגדול על פיגומים שהוכנו באמצעות גישה המבוססות על אבקת25; לפיכך, היה צורך להדגים את זה על דגימות שהוכנו על ידי שיטת בעבר שלא נבדקו ללא חומרי ניקוי. גזע mesenchymal (MSCs) היו נזרע decellularized hispida פ דגימות עלים (8 מ מ דיסקים)-תאי 20,000 לגרדום, רשאית תקופת דגירה של 24 שעות. פיגומים אלו היו functionalized לפני תא מבוא עם המספר RGD-דופמין המשלים כדי להקל על הקפדה. איור 4 מדגימה תמונות שנאסף מדגם טיפוסי. תמונת שדה בהיר נאסף להראות את המבנה הכללי של מקטע של המדגם המשמש (איור 4A). MSCs היו מוכתמים באמצעות calcein, עם תמונה עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 4B). התמונות אז פרסו (איור 4C) כדי להציג את המיקום של תאי גידול על פני השטח של העלה.

Figure 1
איור 1 . תהליך העבודה הכללי עבור decellularization של רקמות הצמח. טיפוסי זרימת עבודה עבור decellularization של רקמות הצמח (שטיפת, הכנה השלבים הם אוניברסליים); (א) נתיב העליון הוא על החלק התחתון בשיטה המבוססת דטרגנט (B) עבור פעולת השירות ללא חומרי ניקוי. (ג) לא שלם/נכשל decellularization של עלה aquatica פ באמצעות השיטה מבוססת דטרגנט עקב הסרה מוקדמת של decellularization אמבט (D) א פגום חומרים פעילי שטח ללא יונית/אקונומיקה של עלה hispida פ עקב דגירה ממושך בפתרון אקונומיקה מחוממת בשיטה ללא חומרי ניקוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . השוואה של תכונות מכניות ואת האפקטיביות של decellularization בין השיטות. זאת אומרת ± SD; ניתוח סטטיסטי נעשה באמצעות שני מדגמים מבחן t ו- p הערכים המפורטים שם משמעותי סטטיסטית (קטן או שווה ל 0.05). השוואה של בדיקות מכניות תוצאות בין דוגמאות hispida פ פ aquatica (סרגל כחול המשמש עבור גישה המבוססות על חומרי ניקוי, אדום מסמל דטרגנט ללא ו ירוק לקבלת דוגמאות ללא טיפול) (פ hispida המבוסס על אבקת n = 4, ללא דטרגנט n = 2; Aquatica פ . בסיס דטרגנט n = 3, ללא דטרגנט n = 4) (א) המתח המרבי משיק מודולוס (MTM) (B) כשל (SAF) (C), חוזק האולטימטיבי (UTS). (ד) A dsDNA כמת assay הופעל שהפקידים על שלוש דגימות מכל קבוצה: לא מטופל (טריים, n = 3), השיטה ללא דטרגנט (מלבין, n = 3) ואת שיטת מבוססי דטרגנט (מרחביות, n = 3), p הערכים הם עבור שיטת decellularization קבוצת לעומת קבוצת מדגם שלא טופלו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . פעילות חילוף החומרים assay תוצאות השוואת ההשפעה בין שתי השיטות decellularization. זאת אומרת ± SD; ניתוח סטטיסטי נעשה באמצעות שני-sample t-המבחן ו p הערכים המפורטים שם משמעותי סטטיסטית (קטן או שווה ל 0.05). פעילות מטבולית תאית נמדדה בנוכחות דגימות רקמה של aquatica פ וגם מין Garcinia (מנורמל כדי שליטה וולס עם אין דגימת הוסיף) כדי להציג השוואה (A) של ההשפעה מטבולית של השניים שיטות decellularization (n = 3 עבור כל קבוצה) ושטיפת (B) השוואת ההשפעה על פעילות חילוף החומרים באמצעות שתי שיטות בפרוטוקול המבוסס על אבקת: מאגר טריס-HCl (10 מ מ, pH 8.5) בשילוב עם מדיה פנויה סרום (n = 4) נגד יונים H 2 O (n = 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . גזע mesenchymal (MSCs) גוברת על פני השטח של decellularized hispida פיקוס עלה, functionalized עם המספר המשלים דופמין RGD. MSCs היו גדל על פ hispida עלים, decellularized בשיטה ללא דטרגנט, functionalized עם המספר המשלים RGD-דופמין (ברים נוספו לעיון סולם 500 מיקרומטר) (A) תמונת שדה בהיר של מקטע של decellularized העלה (B ) זריחה דימוי calcein צבעונית MSCs גוברת על עלה שטח ממוזג (C) בהיר של שדות קרינה פלואורסצנטית התמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במסמך זה, מתוארות שתי שיטות decellularize רקמות הצמח. התוצאות שהוצגו כאן, יחד עם התוצאות של מחקרים קודמים25, מציע כי הפרוטוקולים הושיט צפויים החלים מגוון רחב של זנים של צמחים, יכול להתבצע על גבעולים ועלים. הליכים אלה הם פשוטים, אינם דורשים ציוד מיוחד, כך הצמח decellularization יכול להתבצע במעבדות רוב. ראוי לציין כי לאחר decellularization, פיגומים חייב להיות functionalized כדי להקל על הידבקות בתרבית של תאים. טכניקות שונות functionalization כדי לאפשר בתרבית של תאים אדהזיה וצמיחה על צמח רקמות כבר תיאר במקום25 והם לא הנושא של כתב היד הנוכחי.

השלב האחרון פרוטוקולים decellularization המובאת כאן (איור 1) הייתה קריטית להצלחה שלהם. בעת ביצוע אחת מהשיטות לא overcrowd לאמבטיה כגון זה תגרום בקרחת לא אחיד. שיטות אלה ניתן ליישם כל העלים והגבעולים; עם זאת, זה יהיה להגדיל את משך הזמן הנדרש כדי לנקות אותם. ודא כי הדגימות טובע לחלוטין כדי לשמור על קרחת היער עקביות לאורך כל המדגם כולו. באופן אידיאלי, decellularization צריך לנקות רקמות הצמח של החומר ביותר הסלולר תוך מזעור הנזק המבני. סביר כי השיטה ללא דטרגנט ניתן לשנות לפי הצורך לעבוד עם דגימות הרצוי. אמבט שהטמפרטורות עלול לגרום מהר יותר ניקוי פעמים אך עלול גם לגרום יותר נזק הדגימות אם הם incubated יתר על המידה. טמפרטורות נמוכות עשויה לדרוש יותר זמן דגירה פעמים, יהיה מתאים יותר עדין דגימות. ניתן גם לשנות את הריכוז של אקונומיקה בפתרון כדי להאיץ או להאט את תהליך decellularization. בעת בדיקת דגימות חדשות לשימוש עם השיטה ללא חומרי ניקוי, מומלץ להתחיל עם אמבט לטמפרטורה של 50-60 מעלות צלזיוס עם תכופים בודק על התקדמות decellularization (אידיאלי כל 15-20 דקות) עד הם נמחקים בצורה הולמת. טווח טמפרטורה זה היה נסבל היטב על ידי רוב מיני צמחים שנבדקו במהלך המיטוב של הטכניקה. בגמר, הדגימות יכול להיבדק באופן חזותי ומצוינות באופן ידני כדי לוודא שיש לא היה יתר מודגרות עם ניזוק ללא תקנה כמו להיות על ידי קריעה או התפוררות בעת הסרת מהאמבטיה. דוגמאות שהוכנו באמצעות גישה זו הראה השפעה מופחתת על גידול התא (ראה איור 3A) מאשר הגישה מבוססת על חומרי ניקוי עם שטיפת רק יונים H2O. עם זאת, מומלץ לשטוף בנוסף עם טריס-HCl (10 מ מ, pH 8.5) ומדיה ללא סרום, במיוחד ביישומים רגישים.

השיטה (מרחביות) המבוסס על אבקת סביר החלים על מרבית מיני צמחים, שימושי במיוחד עבור ניקוי העלה כולו ודוגמאות עדין כי זה דורש עצבנות גופנית מינימלית. כפי שהוזכר לעיל, הצעד האחרון הוא קריטי עבור decellularization של דגימות. דגימות עם תכונות פיזיקליות שונות ניתן לפנות באמצעות התאמת זמן הדגירה של המרחצאות חומרים פעילי שטח ללא יונית. חיסרון משמעותי של תהליך זה היא כי רקמות decellularized עשוי להכיל עקבות של דטרגנטים בשימוש, אשר לאחר מכן יכולים להשפיע על פעילות חילוף החומרים הסלולר של תאי יונקים. לכן, שטיפה יסודית צעדים מומלצים לפני השימוש. כאן התברר שיש דוגמאות לרחוץ עם מאגר טריס-HCl (10 מ מ, pH 8.5) ואחריו מדיה ללא סרום הכדאיות תא גבוה יותר מאשר אלה נשטפים עם יונים H2O לפני השימוש בהם (איור 3B).

בעת אחסון שאינו מטופל דוגמאות לשימוש עתידי בתיקיה אחת מהשיטות, חשוב לעקוב אחר אותם בגין נזק להבטיח כי פיגומים וכתוצאה מכך לא ייפגע. נזק יכול להופיע בתור-דהוי של רקמות הצמח, כמו גם פריכות פיצוח או מופרז בעת הטיפול. מומלץ כדי לנטר את הדוגמאות על בסיס שבועי כדי לנצל אותם. לפני שהם כבר לא שימושי, צריך להיות מסולק. תחילתה של נזק משתנה בין סוגי הדגימה, עם עבה יותר דגימות עמידים יותר לאורך זמן.

באופן כללי, צמחים החזק מבטיח הרבה כמקור פוטנציאלי biomaterials. זה הוא חיזק by מבנים מסובכים באופן טבעי המפותח שלהם, מאפיינים לעזור להם לגדול בסביבה הטבעית שלהם. ניצול מוצלח של רקמות הצמח כמו פיגומים הנדסת רקמות מציעה אלטרנטיבה שעשויות להיות זול יקר וקשה לעיתים קרובות לעצב, biomaterials. הטופוגרפיה פני השטח של צמח רקמות, אשר מטבעו משתנה ממין אחד למשנהו, יכול לשמש גם צמיחה סלולרי אוריינטציה במרחב ישירה25. לדוגמה, מחקר קודם הראה כי תאים אנושיים מגיבים על צמחים decellularized25, טופוגרפיים רמזים ובכך שפיגומים אלה יכולים לשמש התרבות תאים דפוסי מאורגן25. תכונה נוספת זה רצוי הנדסת רקמות היא perfusability דה נובו . רקמות הצמח התפתחו במשך מאות מיליוני שנים כדי להיות יעילים מאוד נוזלים תחבורה, רשתות כלי הדם שלהם וניתן ביעילות perfused24. מאפיין זה יכול לשמש באופן פוטנציאלי כדי להדריך ההעברה הסלולר אנגיוגנזה עם המטרה הסופית של יצירת רקמה תחליף עבור יישומים קליניים. זה הוא חיזק by ממצאי מחקרים קודמים הראו כי biomaterials עם שטח גבוהה, נקבוביות מחוברים הן מסייעות התפשטות תאים, כאשר השתילו ויוו, לאפשר העברה פנימה של התאים מארח לתוך השתל36,37,38,39. את פני השטח גבוהה שהנקבוביות הן מחוברות גם הם סימן ההיכר של הצמח רקמות40,41,42, ולכן פיגומים הצמחי יש פוטנציאל להשתלב עם הרקמות הסובבות אין ויוו. יתר על כן, מחקרים שנערכו לאחרונה מצאו עלים decellularized להיות perfused בהצלחה עם תאים24 כי כאשר תאים אנושיים היו נזרע על רקמות הצמח decellularized, הם תאמו שלהם רמזים הטופוגרפי25. כאשר נלקח פיגומים הכל יחד, הצמחי להחזיק את המאפיינים הדרושים להיות מיושם בהצלחה כלפי רקמות יישומי הנדסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות ג'ון וירט של הגנים אולבריך לאספקת באדיבות דגימות שימוש בפרוייקט זה. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (R01HL115282 אל-G.R.G.) הקרן הלאומית למדע (DGE1144804 J.R.G, G.R.G.), המחלקה לכירורגיה באוניברסיטת ויסקונסין ואת קרן הבוגרים (H.D.L.). עבודה זו גם נתמך בחלקה על ידי הסוכנות להגנת הסביבה (כוכב גרנט 83573701 מס), מכוני הבריאות הלאומיים (R01HL093282-01A1 ו- UH3TR000506), הקרן הלאומית למדע (IGERT DGE1144804).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium dodecyl sulfate Sigma Life Science 75746-1KG
Triton X-100 MP Biomedicals, LLC 807426 Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) Clorox Item #: 31009 Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate Acros Organics 217120010 Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch HealthLink 15111-80 Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table Stovall Life Sciences BDRAA115S Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate Fisher Scientific Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker Any Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
DMEM Corning MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay Life Technologies P11496 Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
  2. Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
  3. Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
  4. Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
  5. Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
  6. Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  7. Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
  8. Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
  9. Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
  10. Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
  11. Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
  12. Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
  13. Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
  14. Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
  15. Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
  16. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
  17. Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
  18. Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
  19. Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
  20. Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
  21. Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
  22. Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  23. McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray's law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
  24. Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  25. Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
  26. Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
  27. Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  28. Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
  29. Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  30. Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
  31. Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from: http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html (2017).
  32. Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
  33. Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
  34. Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
  35. Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
  36. Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
  37. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  38. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
  39. Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
  40. Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923 (2003).
  41. Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. Biology of Plants. , 7th edition, (2005).
  42. Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 135 Decellularized פיגומים רקמות הצמח עלים גבעולים פיגומים perfusable decellularization
שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak,… More

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak, J. R., Gaudette, G. R., Le, H. D., Murphy, W. L. Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (135), e57586, doi:10.3791/57586 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter