Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

To metoder til Decellularization af plantevæv til Tissue Engineering applikationer

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57586
Automatic Translation
1, 2, 4, 4, 1, 2,3
1Department of Surgery, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin College of Engineering, 4Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Vi præsenterer her, og kontrast to protokoller bruges til at decellularize plantevæv: et vaskemiddel-baseret tilgang og et vaskemiddel-fri tilgang. Begge metoder efterlader den ekstracellulære matrix af plantevæv bruges, som derefter kan udnyttes som stilladser for væv ingeniørmæssige anvendelser.

Abstract

Autolog, syntetiske og dyr-afledte graftene i øjeblikket bruges som stilladser til væv udskiftning har begrænsninger på grund af lav ledighed, dårlig biokompatibilitet og omkostninger. Plantevæv har gunstige egenskaber, der gør dem enestående egnet til brug som stilladser, såsom høje overfladeareal, fremragende vandtransport og opbevaring, sammenkoblede porøsitet, allerede eksisterende vaskulære netværk, og en bred vifte af mekaniske egenskaber. To vellykkede metoder til plante decellularization af væv ingeniørmæssige anvendelser er beskrevet her. Den første metode er baseret på vaskemiddel bade til at fjerne cellulært materiale, der svarer til tidligere etablerede metoder bruges til at rydde mammale væv. Andet er en vaskemiddel-fri metode tilpasset fra en protokol, der isolerer blad vaskulatur og indebærer anvendelse af en opvarmet blegemiddel og salt bad til at fjerne blade og stængler. Begge metoder giver stilladser med sammenlignelige mekaniske egenskaber og lav cellulære metaboliske virkning, således at brugeren kan vælge den protokol, som passer bedre til deres tilsigtede anvendelse.

Introduction

Vævsmanipulering opstod i 1980 ' erne at skabe levende væv erstatninger, og potentielt adresse betydelig orgel og væv mangel på1. Én strategi har brugt stilladser til at stimulere og styre kroppen til at regenerere mangler væv eller organer. Selv om avanceret fremstilling tilgange, såsom 3D-udskrivning har produceret stilladser med unikke fysiske egenskaber, forbliver muligheden for at fremstille stilladser med en bred vifte af opnåelige fysiske og biologiske egenskaber en challenge2 , 3. Desuden, mangel af en funktionel vaskulære netværk, disse teknikker har været begrænset i regenererende 3-dimensionelle væv. Brugen af decellularized dyrs og menneskers væv som stilladser har hjulpet i at omgå dette problem4,5,6,7. Høje omkostninger, batch til batch variationer og begrænset tilgængelighed kan imidlertid begrænse udbredt brug af decellularized dyr scaffolds8. Der er også bekymring for potentielle smitteoverførsel til patienter og immunologiske reaktion til nogle decellularized mammale væv9.

Cellulose, fremstillet af planten og bakteriel kilder, har været flittigt brugt til at generere biomaterialer for en bred vifte af applikationer i regenerativ medicin. Nogle eksempler kan nævnes: ben10,11, brusk12,13,14 og sårheling15. Stilladser, der består af cellulose har en fordel i, at de er holdbare og modstandsdygtige over for at blive opdelt efter pattedyrceller. Dette er at pattedyrceller ikke producerer enzymer nødvendig for at nedbryde cellulose molekyler. I sammenligning, stilladser fremstillet ved hjælp af makromolekyler fra den ekstracellulære matrix, såsom kollagen, nedbrydes let16 og muligvis ikke velegnet til langsigtede programmer. Kollagen stilladser kan stabiliseres af kemiske cross-linking. Men der er et trade-off på grund af den iboende toksicitet af de cross-linkers, der påvirker biokompatibilitet stilladser17. Omvendt har cellulose potentiale til at være til stede i stedet for implantation i længere perioder af tid fordi det er uigennemtrængelig for Enzymatisk nedbrydning af pattedyrceller18,19,20. Dette kan ændres ved tuning sats for nedbrydning ved hydrolyse forbehandling og co levering af stilladser med cellulases21. Biokompatibilitet decellularized plante-afledte cellulose stilladser i vivo er også blevet påvist i en undersøgelse udført på mus22.

Gennem hundreder af millioner af års evolution, har planter raffineret deres struktur og sammensætning til at øge effektiviteten af fluid transport og opbevaring. Plante vaskulære fartøjer minimere hydrauliske modstand ved forgrening ind i mindre fartøjer, svarende til pattedyr Vaskulaturen ifølge Murrays lov23. Efter decellularization bevares plantens komplekse netværk af fartøjer og sammenkoblede porer. I betragtning af det store antal forskellige plantearter lettilgængelige har plante-afledte stilladser potentiale til at overvinde design begrænsninger i øjeblikket påvirker stilladser i tissue engineering24,25. For eksempel, demonstreret Modulevsky et al. at angiogenese og celle migration opstod decellularized apple væv blev implanteret subkutant på bagsiden af en mus22. Gershlak et al. viste ligeledes, at endotelceller kunne dyrkes i Vaskulaturen af decellularized blade24. I en særskilt eksperiment kunne Gershlak et al. også vise at cardiomyocytes kunne dyrkes på overfladen af bladene og var i stand til at indgå24.

Planter omfatter også kompleks organisation fra cellulære til makroskopisk skala, som er vanskeligt at opnå selv med de mest avancerede fremstillingsteknikker udviklet til dato. Den komplekse hierarkisk design af plantevæv gør dem stærkere end summen af deres vælgere26. Planter i besiddelse af et væld af forskellige mekaniske egenskaber spænder fra stiv og hård komponenter såsom stilke, til meget mere fleksibel og smidig dem som blade27. Bladene varierer afhængigt af arter med hensyn til størrelse, form, bryde styrke, graden af vascularization, og kan bære forskellige grader af hydrofiliciteten. Samlet, disse plante egenskaber tyder på, at decellularized planter kan tjene som unik og yderst funktionelt medicinsk udstyr, herunder som tissue engineering stilladser.

Denne protokol fokuserer på to metoder til at decellularize plantevæv, såsom blade og stilke til anvendelse som stilladser i vævsmanipulering. Den første metode er et vaskemiddel-baseret teknik, der bruger en række bade til at fjerne DNA og cellulære stof, som er blevet tilpasset fra en udbredt teknik til decellularize pattedyr og plante væv6,22,25 ,28,29,30. Den anden metode er vaskemiddel-fri og er tilpasset fra en "skeletonization" protocol almindeligvis anvendes til at fjerne det bløde væv i blade31. Forudgående arbejde viste, at ulmende blade i en blegemiddel og natriumbikarbonat løsning lettere adskillelse af Vaskulaturen fra det omgivende bløde væv31. Denne teknik kan føres tilbage til forsøg udført i de 17th og 18th århundrede, såsom Albertus Seba32 og Edward Parrish33arbejde. Disse eksperimenter centreret omkring forlader plantemateriale, blade og frugter, neddykket i vandet i længere tid (uger til måneder) og gør det muligt blødere væv til forfald væk naturligt. Her er "skeletonization" tilgang tilpasset til at bruge mildere betingelser, såsom længere inkuberingstider ved lavere temperaturer, at fjerne cellulært rester og undgå væsentligt forstyrre den bløde væv struktur. Til forsøgene detaljeret heri, tre plante typer blev brugt: Ficus hispida, Pachira aquatica og en art af Garcinia. Resultaterne af DNA kvantificering, mekaniske afprøvninger og indvirkning på cellulære metaboliske aktivitet fra begge metoder er beskrevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. decellularization af plantevæv brug af vaskemiddel-baseret tilgang

  1. Bruge friske eller frosne F. hispida, blad prøver. Fastfryse uudnyttede friske prøver i en-20 ° C fryser og gemme til senere brug (op til et år).
    Bemærk: Brug stilk eller blad væv af næsten enhver ønskede anlæg. Opbevaring gange kan forårsage skader på væv.
    1. Bestemme størrelsen og formen af prøver, der skal behandles på grundlag af den prøve anvendelsesformål (dvs. prøver skæres i strimler er velegnet til mekaniske test programmer, i mellemtiden 8 mm disc prøver er nyttige i flere godt dyrkningsbaserede applikationer ). Skåret blade i 8 mm skiver med en skarp, ren biopsi punch mens neddykket under stuetemperatur (20-25 ° C) deioniseret H2O.
      Bemærk: Denne protokol kan bruges på hele blade og stængler. Dog vil mindre prøver decellularize hurtigere.
    2. Inkuber prøver for 5-10 min. ved stuetemperatur (20-25 ° C) deioniseret H2O på en shake plade sæt til en lav hastighedsindstilling til vask og/eller tø dem. Brug nok deioniseret H2O til at sikre, at alle prøver er grundigt fugtede.
  2. Der fremstilles en opløsning af 10% (w/v) sodium dodecyl sulfat (SDS) i ionbyttet H2O. sted prøver i en egnet beholder (et glas eller plastik skål er ideelle) og tilføje SDS løsning til fuldstændig dækning af prøverne. Inkuber prøver i 5 dage ved stuetemperatur (20-25 ° C) på en shake plade sæt til en lav hastighed for at undgå skader på prøverne.
    Bemærk: Må ikke overcrowd beholderen, da dette kan sinke den decellularization og føre til ulige behandling af strategien for bæredygtig udvikling. Under dette trin, bør prøverne erhverve en brun nuance.
    1. Efter 5 dage, erstatte SDS løsning med deioniseret vand H2O. Incubate prøver for en yderligere 10-15 min på ryste pladen at grundigt skylle enhver resterende SDS løsning.
  3. Forberede en 1% (v/v) nonioniske overfladeaktive stof i 10% (v/v) blegemiddelopløsning. At gøre en 500 mL opløsning, 5 mL af det nonioniske overfladeaktive stof blandes med 50 mL af blegemiddel så tilføje 445 mL deioniseret vand H2O. Submerge prøver i den frisklavede løsning.
    Bemærk: Det nonioniske overfladeaktive stof/blegemiddelopløsning har ikke en lang holdbarhed, derfor, bør anvendes inden for 48 timer på forberedelse.
  4. Erstatte den nonioniske overfladeaktive/blegemiddelopløsning hver 24 timer, før prøverne er helt ryddet (Se figur 1A for visuel sammenligning). Derefter inkuberes prøven i ionbyttet vand på en shake tallerken for 2 min til at skylle overskydende nonioniske overfladeaktive stof/blegemiddel løsning. Indstille ryste pladen til en lav indstilling til at forhindre skadelige prøverne.
    Bemærk: Den tid, det tager at rydde de prøver, der indgår varierer, afhængigt af den type og art af planten. Den komplette misfarvning af prøverne er betegnende for fuld decellularization (udføre DNA kvantificering for at sikre grundig clearing).
    1. Lyophilize prøver for at gemme dem op til et år (flash frysning ved hjælp af flydende nitrogen foretrækkes, frysning prøver i-80 ° C er også acceptabelt) og gemme dem ved stuetemperatur (20-25 ° C) i lav luftfugtighed.
    2. Rekonstruere prøver i Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) bruger nok til at coat prøver. Skyl prøver 2 - 3 gange i serumfrit media forsigtigt med en mikropipette før brug (dvs. brug 150-300 µL pr. Skyl, i en standard 24 godt plade).
      Bemærk: Tris-HCl buffer og serum-gratis medier (dvs. DMEM, men nogen grundlæggende cellekultur medier kan erstattes) er mere effektive til at sænke virkningen til cellernes levedygtighed af SDS behandlet prøver end dem, der er behandlet med deioniseret vand H2O alene.

2. forberedelse af prøver ved hjælp af metoden med vaskemiddel-gratis Decellularization

Bemærk: De første trin i denne procedure sammenfaldende med trin 1.1-1.1.2 (se ovenfor).

  1. Forbered en 5% (v/v) blegemiddel (NaClO) og 3% (w/v) natriumbicarbonat (NaHCO3) løsning. Varm løsning i et stinkskab til 60-70 ° C for F. hispida blad prøver skåret i 8 mm diske under omrøring på en varm tallerken.
    Bemærk: Natriumbicarbonat kan erstattes med natriumkarbonat (Na2CO3) eller natriumhydroxid (NaOH). Den ønskede temperatur varierer betydeligt (fra stuetemperatur til 90 ° C) og bør tilpasses ud fra egenskaber af prøverne anvendes.
  2. Når løsningen når det ønskede temperaturinterval, nedsænkes prøverne og reducere den omrøring hastighed for at undgå at beskadige dem. Efter prøverne er synligt ryddet (Se figur 1B for visuel sammenligning), fjerne fra badet omhyggeligt. Inkuber prøver en gang i ionbyttet H2O for 1-2 min til at fjerne overskydende blegemiddelopløsning.
    Bemærk: Den tid, der kræves til at klare prøverne kan variere meget. For eksempel, kan klippe persille blive ryddet i 10-15 min, mens tykkere og/eller større prøver som hele blade eller stilke kan tage timer i høj temperatur bade til at fjerne helt.
  3. Lyophilize prøver og opbevar dem ved stuetemperatur (20-25 ° C) i lav luftfugtighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Begge metoder givet stilladser, der var egnet til cellekultur og tissue engineering applikationer. Figur 1 viser den generelle arbejdsgang af den decellularization proces ved hjælp af en intakt blad for vaskemiddel-baseret metode og cut prøver (diameter 8 mm) til metoden vaskemiddel-fri. Vellykket decellularization af Ficus hispida væv efter begge metoder givet klart og intakte prøver (figur 1A og 1B). Det var muligt at decellularize hele plantevæv (figur 1A); imidlertid syntes mindre prøver at rydde hurtigere og mere effektivt. En potentiel spørgsmål observeret med vaskemiddel-baseret tilgang involveret heterogene decellularization som følge af for tidlig fjernelse fra det nonioniske overfladeaktive stof bad (figur 1 c). En ulempe ved den vaskemiddel-fri metode er at skade kan forekomme på grund af længere tids inkubation i det opvarmede bad (fig. 1 d).

De mekaniske egenskaber af decellularized stilladser begge metoder blev undersøgt ved hjælp af enakset trækstyrke test som det var tilfældet i andre undersøgelser24,34. Denne test gav den maksimale tangent modulus (MTM) (figur 2A), stamme på fiasko (SAF) (figur 2B), og trækstyrke (UTS) (figur 2 c) F. hispida og Pachira aquatica prøver. P. aquatica prøver udarbejdet ved hjælp af begge decellularization protokoller vises lignende mekaniske egenskaber på tværs af alle tre af de parametre, der måles. F. hispida prøver viste en lignende tendens i alle tilfælde undtagen UTS test. Navnlig havde prøver udarbejdet ved hjælp af vaskemiddel-baseret (SDS) protokol højere gennemsnitlige UTS resultater end dem parat med metoden vaskemiddel-fri (blegemiddel). Disse resultater viser, at prøver fra forskellige plantearter kan producere forskellige decellularized stillads egenskaber når forberedt via to decellularization protokoller.

For at måle DNA fjernelse, prøver blev ryddet ved hjælp af enten metoden og deres genomisk DNA blev isoleret ved hjælp af en tidligere etableret protokol35. Begge decellularization metoder (vaskemiddel-baseret og vaskemiddel-fri) faldt betydeligt genomisk DNA indhold af prøver til 2,47 ng af DNA/mg (n = 3, s = 0,18) og 2,71 ng af DNA/mg væv (n = 3, s = 1,60) henholdsvis (figur 2D). Non-decellularized prøver havde 104.67 ng af DNA/mg væv (n = 3, s = 26.21) (figur 2D). Det betydelige fald i DNA indhold efter decellularization angivet en effektiv fjernelse af anlægget celle noget.

Indvirkning på cellernes levedygtighed af de to decellularization metoder blev vurderet ved at måle den metaboliske aktivitet af Human dermal fibroblaster (hDF) kulturperler i 2 dage i nærværelse af decellularized P. aquatica eller Garcinia stilladser. hDFs havde øget metabolisk aktivitet når kulturperler i overværelse af stilladser decellularized via metoden vaskemiddel-fri versus dem parat via metoden vaskemiddel-baseret (figur 3A). At sørge for grundig fjernelse af de reagenser, der anvendes under decellularization, et ekstra sæt af eksperimenter blev udført, hvor de forberedte stilladser blev vasket grundigt før cellekultur. To separate vask metoder blev afprøvet på prøver udarbejdet ved hjælp af vaskemiddel-baseret tilgang: en vask i Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,5) efterfulgt af en vask i Serum frie medier vs 2 vasker i ionbyttet H2O. Begge tilgange bruges sidste vask trin med 1 x PBS. Virkningen til pattedyrceller efterfølgende udsat for de decellularized plante stilladser blev målt ved hjælp af de samme metaboliske aktivitet assay som ovenfor. Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,5) efterfulgt af Serum frie medier bidrog til at reducere indvirkningen på cellulære metaboliske aktivitet sammenlignet med deioniseret vand H2O, gør prøver behandlet med sammenlignes med prøver fra det vaskemiddel-free vaskemiddel-baseret tilgang metode (figur 3B).

Det var tidligere vist at pattedyrceller kunne vokse på stilladser tilberedt med vaskemiddel-baseret tilgang25; Det var derfor nødvendigt at vise dette på prøver udarbejdet af den tidligere uprøvet vaskemiddel-fri metode. Mesenchymale stamceller (msc) var seedet decellularized F. hispida blad prøver (8 mm diske) på 20.000 celler pr. stillads og tilladt for at inkuberes i 24 timer. Disse stilladser var functionalized før celle med en M.H.T.-dopamin konjugat til lette at overholde. Figur 4 viser billeder indsamlet fra et typisk udsnit. En lysfelt billede blev indsamlet for at få vist den overordnede struktur af et afsnit i den anvendte prøve (figur 4A). MSCs var farves ved hjælp af calcein og afbildet med et fluorescens mikroskop (figur 4B). Billederne blev derefter belagt (figur 4 c) for at vise placeringen af de voksende celler på overfladen af bladet.

Figure 1
Figur 1 . Den generelle arbejdsgang for decellularization af plantevæv. Typiske arbejdsgang for decellularization af plantevæv (vaskepulver og forberedende skridt er universelle); (A) top stien er for vaskemiddel-baseret metode (B) bunden for metoden vaskemiddel-fri. (C) en ufuldstændig/mislykkedes decellularization for en P. aquatica blad ved hjælp af metoden vaskemiddel-baseret på grund af for tidlig fjernelse fra nonioniske overfladeaktive stof/blegemiddel bad (D) A beskadiget decellularization af en F. hispida blad på grund af længere tids inkubation i den opvarmede blegemiddelopløsning i metoden vaskemiddel-fri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Sammenligning af mekaniske egenskaber og effektiviteten af decellularization mellem metoder. Betyde ± SD; statistiske analyser blev udført ved hjælp af to stikprøver med t-test og p værdierne anført hvor statistisk signifikant (mindre end eller lig 0,05). Sammenligning af mekaniske test resultater mellem prøver af F. hispida og P. aquatica (blå søjler bruges til vaskemiddel-baseret tilgang, rød for vaskemiddel-fri og grøn for ubehandlet prøver) (F. hispida vaskemiddel-baseret n = 4, vaskemiddel-gratis n = 2; P. aquatica vaskemiddel-base n = 3, vaskemiddel-gratis n = 4) (A) maksimale Tangent Modulus (MTM) (B) stamme på fiasko (SAF) (C) og ultimative trækstyrke (UTS). (D) A dsDNA kvantificering assay blev kørt i tre eksemplarer på tre prøver fra hver gruppe: ubehandlet (friske, n = 3), vaskemiddel-fri metode (blegemiddel, n = 3) og vaskemiddel-baseret metode (SDS, n = 3), Pedersen værdier er for decellularization metode Gruppen sammenlignet med ubehandlet testgruppen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Metaboliske aktivitet assay resultater sammenligne virkningen mellem de to decellularization metoder. Betyde ± SD; statistiske analyser blev udført ved hjælp af to stikprøver med t-test og p værdier angivet hvor statistisk signifikant (mindre end eller lig 0,05). Cellulære metaboliske aktivitet blev målt i overværelse af vævsprøver af både P. aquatica og en art af Garcinia (normaliseret til kontrolhullerne med ingen prøve tilføjet) til at vise en (A) sammenligning af to metabolisk virkning decellularization metoder (n = 3 for hver gruppe) og (B) sammenligning af virkningen til metaboliske aktivitet ved hjælp af to vaske metoder i vaskemiddel-baseret protokol: Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,5) kombineret med Serum frie medier (n = 4) vs deioniseret vand H 2 O (n = 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Mesenchymale stamceller (msc) vokser på overfladen af decellularized Ficus hispida blad, functionalized med en M.H.T.-dopamin konjugat. MSC'er blev dyrket på F. hispida blade, decellularized af vaskemiddel-fri metode og functionalized med en M.H.T.-dopamin konjugat (500 µm skala barer blev tilføjet for reference) (A) lysfelt billede af en del af decellularized blad (B ) Fluorescens billede af calcein farves MSCs vokser på blad overflade (C) fusioneret lyse felt og fluorescens billede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri beskrives to metoder til at decellularize plantevæv. Resultaterne præsenteres her, kombineret med resultaterne af tidligere undersøgelser25, tyder på, at protokollerne udrakte sandsynligvis gælder for et bredt spektrum af plantearter og kan udføres på både stængler og blade. Disse procedurer er enkle og kræver ikke specialiseret udstyr, så planten decellularization kan udføres i de fleste laboratorier. Det er bemærkelsesværdigt, at efter decellularization, stilladser skal være functionalized for at lette pattedyr celle vedhæftning. Forskellige functionalization teknikker til at aktiverer pattedyr celle vedhæftning og vækst på plante væv har været beskrevet andetsteds25 og ikke emnet er af det aktuelle manuskript.

Det sidste trin i begge decellularization protokoller præsenteres her (figur 1) var afgørende for deres succes. Hvornår udfører enten metode må ikke overcrowd bad da dette vil resultere i en ujævn clearing. Disse metoder kan anvendes til hele blade og stængler; Dette vil dog øge længden af tid, der kræves til at klare dem. Sørg for, at prøverne er nedsænket helt for at holde clearing konsekvent i hele hele prøven. Ideelt set bør decellularization rydde plantevæv mest cellulære sagen samtidig minimere strukturelle skader. Det er sandsynligt, at den vaskemiddel-fri metode kan ændres efter behov for at arbejde med ønskede eksemplarer. Højere bad temperaturer kan resultere i hurtigere clearing gange men kan også resultere i mere skade at prøverne, hvis de er over rugede. Lavere temperaturer kan kræve længere inkuberingstider og ville være passende til mere skrøbelige prøver. Koncentration af blegemiddel i løsningen kan også ændres for at fremskynde eller aftage decellularization processen. Når du tester nye prøver til brug med vaskemiddel-fri metode, anbefales det at starte med en bad temperatur på 50-60 ° C med hyppig kontrol af status for decellularization (ideelt hver 15-20 minutter) indtil de er tilstrækkeligt ryddet. Dette temperaturinterval var veltolereret af de fleste af de plantearter, der blev testet under optimering af teknikken. Ved afslutningen, prøverne kan inspiceres visuelt og manuelt for at sikre, at de ikke har været over udruget og skadet uopretteligt som ville angives ved at rive eller opløsning efter udtagning fra badet. Prøver udarbejdet ved hjælp af denne fremgangsmåde viser en mindsket indflydelse på den cellevækst (Se figur 3A) end den vaskemiddel-baseret tilgang med kun vask i ionbyttet H2O. Det anbefales dog at vaske desuden med Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) og serum-gratis medier, især i følsomme anvendelser.

Metoden vaskemiddel-baseret (SDS) er sandsynligvis gælder for de fleste plantearter og er især nyttig til at rydde hele blade og fine prøver, fordi det kræver minimal fysiske agitation. Som nævnt ovenfor er er det sidste trin afgørende for decellularization af prøver. Prøver med forskellige fysiske egenskaber kan ryddes ved at justere inkubationstiden i nonionisk overfladeaktivt stof bade. En væsentlig ulempe ved denne proces er, at decellularized væv kan indeholde spor af vaske-og rengøringsmidler brugt, som efterfølgende kan påvirke den cellulære metaboliske aktivitet i pattedyrsceller. Derfor anbefales grundig vask trin før brug. Her blev det fundet at prøverne vaskes med Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,5) efterfulgt af serum-gratis medier havde højere cellernes levedygtighed end dem vasket med deioniseret H2O før deres brug (figur 3B).

Ved lagring af ubehandlet prøver til fremtidig brug i enten metode, er det vigtigt at overvåge dem for skade at sikre, at de resulterende stilladser ikke vil blive påvirket. Skader kan vises som misfarvning af plantevæv samt revner eller overdreven sprødhed når håndteres. Det anbefales at overvåge prøver på en ugentlig basis for at udnytte dem, før de ikke længere er nyttige og skal bortskaffes. Udbrud af skaden varierer mellem modellen typer, med tykkere mere robust prøver varede længere.

I almindelighed, holder planter meget lovende som en potentiel kilde til biomaterialer. Dette er suppleret med deres naturligt udviklede indviklede strukturer og karakteristika, at hjælper dem med at vokse i deres oprindelige omgivelser. Succesfuld udnyttelse af plantevæv som tissue engineering stilladser foreslår en potentielt billigt alternativ til dyre, og ofte vanskelige at designe, biomaterialer. Plantevæv overflade topografi, som i sagens natur varierer fra én art til en anden, kan også udnyttes til direkte rumligt orienterede cellulære vækst25. For eksempel, har en tidligere undersøgelse vist, at menneskelige celler reagerer på topografiske stikord til stede på decellularized planter25, således disse stilladser kan bruges til kultur celler i velorganiseret mønstre25. En anden funktion, der er ønskeligt i vævsmanipulering er de novo perfusability. Plantevæv har udviklet sig over hundreder af millioner af år at være yderst effektiv på flydende transport, og deres vaskulære netværk kan være effektivt perfunderet24. Denne egenskab kan potentielt bruges til at guide cellulære migration og angiogenese med det ultimative mål at skabe udskiftning væv til kliniske applikationer. Dette er suppleret med resultaterne af tidligere undersøgelser, der viste, at biomaterialer med høje overfladeareal og sammenkoblede porøsitet er befordrende til celleproliferation og når implanteret i vivo, aktiver tilvandringen af værtsceller ind i implantatet36,37,38,39. Den høje areal og de sammenkoblede porøsitet er også kendetegnende for anlægget væv40,41,42, således plantebaserede stilladser har potentiale til at integrere med det omgivende væv in vivo. Derudover nylige undersøgelser fandt at decellularized blade kan være held perfunderet med celler24 og at når menneskelige celler var seedet på decellularized plantevæv, de var i overensstemmelse med deres topografiske stikord25. Når taget alle sammen, plante-afledte stilladser besidder de nødvendige egenskaber skal anvendes med succes mod tissue engineering applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke John Wirth Olbrich haver for allernådigst leverer de prøver, der anvendes i dette projekt. Dette arbejde er delvist understøttet af National Heart, Lung, og Blood Institute (R01HL115282 til G.R.G.) National Science Foundation (DGE1144804 til J.R.G og G.R.G.), og University of Wisconsin Institut for kirurgi og Alumni fond (H.D.L.). Dette arbejde var også delvist understøttet af Environmental Protection Agency (STAR grant nr. 83573701), den National Institutes of Health (R01HL093282-01A1 og UH3TR000506) og National Science Foundation (IGERT DGE1144804).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium dodecyl sulfate Sigma Life Science 75746-1KG
Triton X-100 MP Biomedicals, LLC 807426 Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) Clorox Item #: 31009 Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate Acros Organics 217120010 Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch HealthLink 15111-80 Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table Stovall Life Sciences BDRAA115S Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate Fisher Scientific Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker Any Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
DMEM Corning MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay Life Technologies P11496 Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
  2. Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
  3. Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
  4. Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
  5. Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
  6. Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  7. Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
  8. Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
  9. Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
  10. Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
  11. Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
  12. Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
  13. Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
  14. Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
  15. Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
  16. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
  17. Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
  18. Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
  19. Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
  20. Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
  21. Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
  22. Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  23. McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray's law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
  24. Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  25. Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
  26. Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
  27. Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  28. Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
  29. Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  30. Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
  31. Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from: http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html (2017).
  32. Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
  33. Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
  34. Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
  35. Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
  36. Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
  37. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  38. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
  39. Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
  40. Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923 (2003).
  41. Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. Biology of Plants. , 7th edition, (2005).
  42. Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 135 Decellularized stilladser plantevæv blade stængler perfusable stilladser decellularization
To metoder til Decellularization af plantevæv til Tissue Engineering applikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak,… More

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak, J. R., Gaudette, G. R., Le, H. D., Murphy, W. L. Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (135), e57586, doi:10.3791/57586 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter