Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Deux méthodes de DÉCELLULARISATION de tissus végétaux pour utilisations en génie tissulaire

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57586
Automatic Translation
1, 2, 4, 4, 1, 2,3
1Department of Surgery, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin College of Engineering, 4Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Nous présentons ici, et contraste deux protocoles utilisés pour decellularize les tissus végétaux : une approche axée sur le détergent et une approche sans tensioactifs. Les deux méthodes laissent derrière eux de la matrice extracellulaire des tissus végétaux utilisés, qui peut ensuite servir d’échafaudages pour applications d’ingénierie tissulaire.

Abstract

Les greffes autologues, synthétiques et issus d’animaux actuellement utilisées comme échafaudages pour le remplacement de tissus ont des limitations dues à la faible disponibilité, mauvaise biocompatibilité et coût. Tissus végétaux ont des caractéristiques favorables qui les rendent particulièrement bien adapté pour les utiliser comme échafaudages, tels que la grande surface, le transport de l’eau excellente et rétention, porosité interconnectée, préexistant des réseaux vasculaires et un large éventail de mécanique Propriétés. Deux méthodes réussies de DÉCELLULARISATION plante pour applications d’ingénierie tissulaire sont décrites ici. La première méthode repose sur des bains de détergent pour enlever les matières cellulaires, ce qui est semblable aux méthodes établies auparavant utilisés pour effacer les tissus des mammifères. La seconde est une méthode sans détergent adaptée d’un protocole qui isole la vascularisation de la feuille et implique l’utilisation d’une eau de Javel chauffée et un bain de sel pour dégager les feuilles et les tiges. Les deux méthodes donnent des échafaudages avec des propriétés mécaniques comparables et faible impact métabolique cellulaire, permettant ainsi à l’utilisateur de sélectionner le protocole qui convient le mieux à leur application prévue.

Introduction

Génie tissulaire a émergé dans les années 1980 pour créer un tissu vivant des substituts et potentiellement adresse importants organes et tissus pénuries1. Une stratégie a utilisé des échafaudages pour stimuler et guider le corps pour régénérer des tissus ou des organes manquants. Bien que la fabrication de pointe des approches telles que l’impression 3D ont produit des échafaudages avec des propriétés physiques uniques, la capacité de fabriquer des échafaudages avec une gamme variée de réalisables propriétés physiques et biologiques reste un challenge2 , 3. en outre, en raison de l’absence d’un réseau vasculaire fonctionnel, ces techniques ont été limités dans la régénération de tissus 3-dimensions. L’utilisation de DECELLULARISE tissus animaux et humains comme échafaudages a aidé à contourner ce problème,4,5,6,7. Cependant, coût élevé, la variabilité de lot et disponibilité limitée peuvent limiter l’utilisation généralisée des animaux DECELLULARISE échafaudages8. Il y a également des préoccupations concernant l’éventuelle transmission de la maladie aux patients et de la réaction immunologique à certains tissus de mammifères DECELLULARISE9.

Cellulose, dérivée de la plante et des sources bactériennes, a été largement utilisée pour générer des biomatériaux pour un large éventail d’applications dans la médecine régénérative. Voici quelques exemples : OS10,11, cartilage12,,du13,14 et15de cicatrisation. Les échafaudages qui sont composés de cellulose ont un avantage supplémentaire car ils sont durables et résistantes à ventilées selon les cellules de mammifères. Cela est dû au fait que les cellules de mammifères ne produisent pas les enzymes nécessaires pour décomposer les molécules de cellulose. En comparaison, les échafaudages produites à l’aide de macromolécules de la matrice extracellulaire, comme le collagène, sont facilement décomposés de16 et peuvent ne pas être bien adaptés aux applications à long terme. Les échafaudages de collagène peuvent être stabilisées par réticulation chimique. Cependant, il y a un compromis en raison de la toxicité intrinsèque de l’agents qui affectent la biocompatibilité des échafaudages17. À l’inverse, cellulose peut rester présents sur le site d’implantation pour de longues périodes car il est imperméable à la dégradation enzymatique par les cellules de mammifères18,19,20. Cela peut être modifiée par le réglage de la vitesse de dégradation par un prétraitement hydrolyse et co-exécutants des échafaudages avec cellulases21. La biocompatibilité des échafaudages DECELLULARISE cellulose végétale en vivo a aussi démontrée dans une étude réalisée sur des souris,22.

À travers des centaines de millions d’années d’évolution, les plantes ont raffiné leur structure et leur composition pour accroître l’efficacité du transport des fluides et de la rétention. Plante vasculaires navires minimisent la résistance hydraulique de ramification en petits navires, semblables à la vascularisation mammifères selon Murray Loi23. Après DÉCELLULARISATION, réseau complexe de l’usine de navires et les pores interconnectés est maintenue. Compte tenu de la multitude d’espèces végétales distinctes disponibles, échafaudages d’origine végétale sont susceptibles de surmonter les limites de conception qui affectent actuellement les échafaudages en tissu technique24,25. Par exemple, Modulevsky et coll. ont démontré que l’angiogenèse et la migration cellulaire s’est produite lorsque le tissu DECELLULARISE apple a été implanté par voie sous-cutanée sur le dos d’une souris22. De même, Gershlak et coll. ont montré que les cellules endothéliales pouvaient être cultivés dans le système vasculaire des feuilles DECELLULARISE24. Dans une expérience distincte, Gershlak et coll. purent aussi montrer que les cardiomyocytes pourrait être cultivés sur la surface des feuilles et ont été capables de se contracter de24.

Plantes comprennent également une organisation complexe de la cellulaire à l’échelle macroscopique, ce qui est difficile à réaliser même avec les techniques de fabrication les plus avancées développés à ce jour. La conception hiérarchique complexe de tissus végétaux qui les rend plus fort que la somme de leurs constituants26. Les plantes possèdent une multitude de propriétés mécaniques différentes, allant des composants rigides et difficiles tels que les tiges, à celles beaucoup plus souples et malléable comme laisse27. Feuilles varient selon l’espèce en termes de taille, forme, briser la force, le degré de vascularisation et peuvent transporter différents degrés de hydrophilicité. Dans l’ensemble, ces propriétés de la plante suggèrent que les plantes DECELLULARISE peuvent servir d’uniques et hautement fonctionnels des dispositifs médicaux, y compris comme des échafaudages en génie tissulaire.

Ce protocole met l’accent sur deux méthodes pour decellularize les tissus végétaux, tels que feuilles et découle, pour servir d’échafaudages en génie tissulaire. La première méthode est une technique à base de détergent qui utilise une série de bains pour supprimer ADN et matière cellulaire, qui a été adaptée d’une technique largement utilisée pour decellularize chez les mammifères et plantes tissus6,22,25 ,28,29,30. La deuxième méthode est sans détergent et est une adaptation d’un protocole de « squelettisation » généralement utilisé pour enlever les tissus mous des feuilles31. Travaux antérieurs ont montré que faire mijoter les feuilles dans une solution d’eau de Javel et de bicarbonate de sodium facilité de séparation de la vascularisation des tissus mous environnants31. Cette technique peut être citée retour d’expériences menées dans le 17ème et 18ème siècles, tels que les travaux de Albertus Seba32 et33de la Edward Parrish. Ces expériences centrées laissant la matière végétale, comme les feuilles et les fruits, immergé dans l’eau pendant de longues périodes de temps (semaines ou mois) et en permettant les tissus plus douces à la pourriture, naturellement. Ici, l’approche « squelettisation » est adapté pour utiliser des conditions plus clémentes, comme des périodes d’incubation plus longues à basse température, afin d’éliminer les résidus cellulaires et à éviter de perturber considérablement la structure des tissus mous. Pour les essais décrits dans les présentes, trois types de plantes ont été utilisées : Ficus hispida, Pachira aquatica et une espèce de Garcinia. Résultats de quantification ADN, essais mécaniques et impact sur l’activité métabolique cellulaire de ces deux méthodes sont décrites.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DÉCELLULARISATION de tissus de la plante à l’aide de l’approche axée sur le détergent

  1. Utilisez des fraîches ou congelées F. hispida, échantillons de feuilles. Congeler des échantillons frais inutilisés dans un congélateur-20 ° C et le magasin pour une utilisation future (jusqu'à un an).
    Remarque : Utiliser des tissus tige ou feuille de presque n’importe quelle usine désirée. Durée de conservation prolongée peut endommager les tissus.
    1. Déterminer la taille et la forme des échantillons à traiter sur la base de l’utilisation prévue de l’échantillon (c'est-à-dire les échantillons coupés en lanières sont bien adaptés pour des applications de test mécaniques, en attendant les échantillons de disque de 8 mm sont utiles dans des applications de culture multipuites ). Couper la feuille en disques de 8 mm avec une biopsie forte, propre poinçon submergé sous la température ambiante (20-25 ° C) désionisée H2O.
      Remarque : Ce protocole peut être utilisé sur les tiges et les feuilles entières. Toutefois, les échantillons plus petits seront decellularize plus vite.
    2. Incuber les échantillons pendant 5-10 min à température ambiante (20-25 ° C) désionisée H2O sur un ensemble de plaque de secousse à un réglage de vitesse réduite à laver et/ou de les décongeler. Assez désionisée H2O permet de s’assurer que tous les échantillons sont minutieusement mouillés.
  2. Préparer une solution de 10 % (p/v) dodécylsulfate de sodium (SDS) dans désionisée H2O. Place les échantillons dans un récipient approprié (un verre ou un plat en plastique est idéal) et ajouter la solution SDS pour couvrir complètement les échantillons. Incuber les échantillons pendant 5 jours à température ambiante (20-25 ° C) sur un shake réglé à une vitesse lente pour éviter d’endommager les échantillons.
    Remarque : Ne surchargez pas le conteneur car cela peut ralentir le processus de DÉCELLULARISATION et conduire à un traitement inégal par le SDS. Au cours de cette étape, les échantillons devraient acquérir une teinte brune.
    1. Après 5 jours, remplacez la solution SDS par désionisée H2O. Incuber les échantillons pendant un supplémentaire 10-15 min sur la plaque de secousse à rincer soigneusement toute solution SDS résiduelle.
  3. Préparer un surfactant non ionique de 1 % (v/v) dans une solution d’eau de Javel 10 % (v/v). Pour faire une solution de 500 mL, mélangez 5 mL de l’agent de surface non ioniques avec 50 mL d’eau de Javel puis ajouter 445 mL de désionisée H2O. Submerge les échantillons dans la solution fraîchement préparée.
    Remarque : La solution de tensioactif non ionique/eau de Javel n’a pas une longue durée de vie, par conséquent, doit être utilisé dans les 48 h de préparation.
  4. Remplacer la solution de tensioactif non ionique/eau de Javel toutes les 24 h, jusqu'à ce que les échantillons sont complètement effacées (voir Figure 1 a pour comparaison visuelle). Puis incuber l’échantillon dans l’eau désionisée sur une plaque de secouer pendant 2 min pour rincer la solution excès agent tensio-actif non ionique/eau de Javel. Mettre la plaque de secouer un réglage bas pour éviter d’endommager les échantillons.
    NOTE : Le temps nécessaire pour effacer les échantillons utilisés varie selon le type et l’espèce de la plante. La décoloration complète des échantillons est révélateur de DÉCELLULARISATION complet (effectuer la quantification de l’ADN afin d’assurer une compensation complète).
    1. Lyophiliser les échantillons pour les stocker jusqu'à un an (congélation à l’aide d’azote liquide flash est préféré, est également acceptable de congélation des échantillons à-80 ° C) et les stocker à température ambiante (20-25 ° C) à faible taux d’humidité.
    2. Exemples de Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) de reconstituer en utilisant assez d’échantillons du manteau. Rincer les échantillons 2 ou 3 fois dans un milieu sans sérum délicatement à l’aide d’une micropipette avant utilisation (c.-à-d. utilisation 150 à 300 µL par rinçage, dans un plat bien 24 standard).
      NOTE : Tampon Tris-HCl et médias sans sérum (c.-à-d. DMEM, mais n’importe quelle culture de cellule de base médias peuvent être substituées) sont plus efficaces dans la réduction de l’impact sur la viabilité des cellules d’échantillons SDS traités que ceux traités avec désionisée H2O seul.

2. préparation des échantillons à l’aide de l’approche de DÉCELLULARISATION sans tensioactifs

Remarque : Les premières étapes de cette procédure coïncident avec les étapes 1.1-1.1.2 (voir ci-dessus).

  1. Préparer une solution de bicarbonate de sodium (NaHCO3) 3 % (p/v) et de 5 % (v/v) eau de Javel (NaClO). Chauffer la solution sous une hotte à 60-70 ° C pour les échantillons de feuilles F. hispida coupée en rondelles 8 mm tout en remuant sur une plaque chauffante.
    Remarque : Le bicarbonate de sodium peut être substitué avec du carbonate de sodium (Na2CO3) ou d’hydroxyde de sodium (NaOH). La température varie grandement (de la température de la pièce à 90 ° C) et doit être ajustée selon les propriétés des échantillons utilisés.
  2. Une fois la solution atteigne la température désirée, submerger les échantillons et réduire la vitesse d’agitation pour ne pas les endommager. Après que les échantillons sont visiblement effacées (voir Figure 1 b pour comparaison visuelle), retirer du bain avec soin. Incuber les échantillons une fois dans désionisée H2O pendant 1-2 min enlever l’excès de Javel.
    NOTE : Le temps nécessaire pour effacer les échantillons peut varier considérablement. Par exemple, persil haché peut être effacée en 10-15 min, alors que les échantillons plus épaisses ou plus grandes, comme ensemble de feuilles ou tiges peuvent prendre des heures à haute température des bains pour effacer complètement.
  3. Lyophiliser les échantillons et les stocker à température ambiante (20-25 ° C) à faible taux d’humidité.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Les deux méthodes ont donné des échafaudages qui convenaient pour culture cellulaire et applications en génie tissulaire. La figure 1 illustre le déroulement général du processus DÉCELLULARISATION en utilisant une feuille intacte pour la méthode à base de détergent et coupe des échantillons (diamètre 8 mm) pour la méthode sans détergent. DÉCELLULARISATION réussie des Ficus hispida tissus suivant les deux méthodes a donné des échantillons claires et intacts (Figure 1 a et 1 b). Il était possible de decellularize les tissus de la plante entière (Figure 1 a) ; Cependant, les échantillons plus petits semblent clairement plus rapidement et plus efficacement. Un problème potentiel observé avec l’approche axée sur le détergent impliqué DÉCELLULARISATION hétérogène en raison de l’élimination prématurée du bain de surfactant non ionique (Figure 1). L’inconvénient de la méthode sans tensioactifs, c’est que les dommages peuvent se produire en raison d’une incubation prolongée dans le Bain thermostaté (Figure 1).

Les propriétés mécaniques des échafaudages DECELLULARISE préparés en utilisant les deux méthodes ont été étudiées en utilisant l’essai de traction uniaxiale comme cela a été fait dans d’autres études24,34. Ces essais ont donné le module tangent maximal (MTM) (Figure 2 a), déformation à la rupture (SAF) (Figure 2 b) et résistance à la traction (UTS) (Figure 2) pour les échantillons F. hispida et Pachira aquatica . Aquatica P. échantillons préparés en utilisant les deux protocoles DÉCELLULARISATION affichent des propriétés mécaniques similaires dans l’ensemble tous les trois des paramètres mesurés. Les échantillons de F. hispida ont montré une tendance similaire dans tous les cas sauf l’UTS stable. En particulier, les échantillons préparés en utilisant le protocole (SDS) de la base de détergent avaient des résultats UTS moyennes plus élevés que ceux préparés avec l’approche de (eau de Javel) sans tensioactifs. Ces résultats montrent que les échantillons prélevés dans différentes espèces de plantes peuvent produire des propriétés distinctes échafaudage DECELLULARISE préparé par l’intermédiaire des deux protocoles DÉCELLULARISATION.

Pour mesurer le retrait de l’ADN, les échantillons ont été déminés en utilisant les deux méthodes et leur ADN génomique a été isolé à l’aide d’un protocole établi précédemment35. Les deux méthodes de DÉCELLULARISATION (base de détergent et sans détergent) diminue significativement la teneur en ADN génomique d’échantillons à 2,47 ng d’ADN/mg (n = 3, s = 0,18) et 2,71 ng d’ADN/mg de tissu (n = 3, s = 1,60) respectivement (Figure 2D). Échantillons non-DECELLULARISE avaient 104.67 ng d’ADN/mg de tissu (n = 3, s = 26.21) (Figure 2D). Relatif à la diminution importante teneur en ADN après que DÉCELLULARISATION indique une élimination efficace de la cellule végétale.

L’impact sur la viabilité des cellules des deux méthodes DÉCELLULARISATION a été évaluée en mesurant l’activité métabolique des fibroblastes dermiques humains (hDF) cultivées pendant 2 jours en présence de DECELLULARISE P. aquatica ou échafaudages de Garcinia . hDFs avait une activité métabolique plus élevée lorsqu’il est cultivé en présence d’échafaudages DECELLULARISE via la méthode sans tensioactifs par rapport à ceux établis par l’intermédiaire de la méthode à base de détergent (Figure 3 a). Afin d’assurer l’élimination complète des réactifs utilisés pendant la DÉCELLULARISATION, un jeu supplémentaire d’expériences a été réalisée dans lequel les échafaudages préparés ont été lavés abondamment avant la culture cellulaire. Deux méthodes de lavage distinctes ont été testés sur des échantillons préparés à l’aide de l’approche axée sur le détergent : un lavage en tampon Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) suivie d’un lavage au sérum médias libres vs 2 lavages désionisée H2O. Les deux approches utilisées étapes de lavage final avec du PBS 1 x. L’impact sur les cellules de mammifère exposées ensuite aux échafaudages DECELLULARISE plante a été mesurée à l’aide de la même épreuve d’activité métabolique comme ci-dessus. Tampon Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) suivie de sérum de liberté de la presse a contribué à réduire l’impact sur l’activité métabolique cellulaire contre désionisée H2O, faire des échantillons traités par la gestion axée sur les détergents comparable aux échantillons de la sans tensioactifs méthode (Figure 3 b).

Il a déjà été démontré que les cellules de mammifères pourraient croître sur des échafaudages, préparés à l’aide de l’approche axée sur le détergent25; par conséquent, il fallait démontrer ceci sur des échantillons préparés par la méthode précédemment non testée sans tensioactifs. Cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été ensemencées en DECELLULARISE les échantillons de feuilles F. hispida (disques de 8 mm) à 20 000 cellules par échafaudage et incubés pendant 24 h. Ces échafaudages sont fonctionnalisés avant l’introduction de la cellule avec un conjugué RGD-Dopamine pour faciliter l’adhérence. La figure 4 illustre les images collectées auprès d’un échantillon typique. Une image du champ lumineux ont été recueillis pour afficher la structure globale d’une partie de l’échantillon utilisé (Figure 4 a). Les CSM ont été colorées à l’aide de calcéine et photographié avec un microscope à fluorescence (Figure 4 b). Les images étaient ensuite recouvertes (Figure 4) pour afficher l’emplacement des croissance des cellules sur la surface de la feuille.

Figure 1
Figure 1 . Le déroulement général DÉCELLULARISATION de tissus végétaux. Des flux de travail typique pour la DÉCELLULARISATION de tissus végétaux (étapes de lavage et préparatoires sont universels) ; (A) haut de la page chemin d’accès est pour le fond de la méthode à base de détergent (B) pour la méthode sans détergent. (C) une incomplète/échec DÉCELLULARISATION d’une feuille P. aquatica à l’aide de la méthode à base de détergent en raison du retrait prématuré de la DÉCELLULARISATION de bain (D), A endommagé de surfactant non ionique/eau de Javel d’une feuille de F. hispida en raison d’une incubation prolongée dans la solution d’eau de Javel chauffée dans la méthode sans tensioactifs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Comparaison des propriétés mécaniques et de l’efficacité de DÉCELLULARISATION entre les méthodes. Moyenne ± écart-type ; l’analyse statistique a été faite à l’aide de deux échantillons test t et p valeurs répertoriées où statistiquement significative (inférieur ou égal à 0,05). Résultats de comparaison des essais mécaniques entre les échantillons de F. hispida et P. aquatica (barres bleues utilisés pour l’approche à base de détergent, rouge pour le détergent libres et vert pour les échantillons non traités) (F. hispida base de détergent n = 4, sans tensioactifs n = 2 ; Aquatica P. détergent-base n = 3, sans tensioactifs n = 4) souche Maximum tangente modulo (MTM) (B) (A) à l’échec (SAF) (C) et ultime à la traction (UTS). (D), un essai de quantification ADN double brin a été exécuté en trois exemplaires sur trois échantillons de chaque groupe : non traitées (fraîche, n = 3), la méthode sans tensioactifs (Bleach, n = 3) et la méthode à base de détergent (SDS, n = 3), les valeurs de p sont pour méthode DÉCELLULARISATION groupe par rapport au groupe témoin non traité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Les résultats d’analyse de l’activité métabolique en comparant le choc entre les deux méthodes de DÉCELLULARISATION. Moyenne ± écart-type ; l’analyse statistique a été faite à l’aide de la t-test à deux échantillons et p valeurs énumérés cas statistiquement significative (inférieur ou égal à 0,05). L’activité métabolique cellulaire a été mesurée en présence d’échantillons de tissus de P. aquatica et une espèce de Garcinia (normalisé aux puits de contrôle avec aucun échantillon ajouté) pour afficher une comparaison entre les effets métaboliques des deux (A) Méthodes DÉCELLULARISATION (n = 3 pour chaque groupe) et (B) Comparaison de l’impact de l’activité métabolique à l’aide de deux méthodes de lavage à base de détergent protocole : tampon Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) combinée à des médias libres sériques (n = 4) vs désionisée H 2 O (n = 4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . DECELLULARISE des cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui poussent sur la surface de feuilles de Ficus hispida , fonctionnalisés avec un conjugué RGD-Dopamine. MSCs ont été cultivés sur des feuilles de F. hispida , DECELLULARISE par la méthode sans tensioactifs et fonctionnalisées avec un conjugué de RGD-Dopamine (500 µm échelle bars ont été ajoutés pour référence) (A) image de champ lumineux d’une section de feuille de DECELLULARISE (B ) Image de fluorescence de calcéine teinté MSCs qui poussent sur les feuilles surface : fusion (C) domaine et fluorescence image lumineuse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ici, deux méthodes pour decellularize les tissus végétaux sont décrites. Les résultats présentés ici, couplé avec les résultats d’études antérieures25, suggèrent que les protocoles mis en avant sont probables applicable à un large éventail d’espèces végétales et peuvent être effectuées sur les tiges et les feuilles. Ces procédures sont simples et ne nécessitent pas de matériel spécialisé, donc plante DÉCELLULARISATION peut être effectuée dans la plupart des laboratoires. Il convient de noter qu’après DÉCELLULARISATION, les échafaudages doivent être fonctionnalisés pour faciliter l’adhérence des cellules de mammifères. Techniques de fonctionnalisation différents pour permettre l’adhérence de cellules de mammifères et de la croissance sur l’usine de tissus ont été décrites ailleurs25 et le manuscrit actuel ne sont pas le sujet.

L’étape finale dans les deux protocoles de DÉCELLULARISATION présentés ici (Figure 1) était essentielle à leur succès. Quand effectuer les deux méthodes ne surchargez pas le bain comme cela se traduira par une compensation inégale. Ces méthodes peuvent être appliquées à feuilles entières et les tiges ; Toutefois, cela augmentera la durée de temps nécessaire pour les faire disparaître. Veiller à ce que les échantillons sont immergés entièrement pour maintenir la clairière cohérente tout au long de l’ensemble de l’échantillon. Idéalement, DÉCELLULARISATION devrait dissiper les tissus végétaux de matière plus cellulaire tout en minimisant les dommages structurels. Il est probable que la méthode sans détergent peut être modifiée au besoin pour travailler avec les échantillons souhaités. Des températures plus élevées de bain peuvent dégager plus vite fois mais peuvent également entraîner plus de dégâts aux échantillons si elles sont trop couvés. Des températures plus basses peuvent nécessiter de plus longues périodes d’incubation et seraient appropriés pour les échantillons plus fragiles. La concentration d’eau de Javel dans la solution peut également être modifiée pour accélérer ou ralentir le processus de DÉCELLULARISATION. Lors de l’essai de nouveaux échantillons pour une utilisation avec la méthode sans détergent, il est recommandé de commencer avec une température de bain de 50-60 ° C avec fréquentes vérifications sur l’état d’avancement de la DÉCELLULARISATION (idéalement toutes les 15-20 minutes) jusqu'à ce qu’ils sont bien dégagés. Cette plage de température a été bien tolérée par la plupart des espèces de plantes qui ont été testés lors de l’optimisation de la technique. Une fois terminé, les échantillons peuvent être inspectés visuellement et manuellement pour s’assurer qu’ils n’ont pas été trop incubés et endommagés irrémédiablement comme serait indiquée par la déchirure ou la désintégration lors du retrait de la baignoire. Les échantillons préparés en utilisant cette approche montrent un impact moindre sur la croissance cellulaire (voir la Figure 3 a) que l’approche axée sur le détergent avec lavage uniquement dans désionisée H2O. Toutefois, il est recommandé de laver en outre avec Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) et les médias sans sérum, particulièrement dans les applications sensibles.

La méthode (SDS) de la base de détergent est probablement applicable à la plupart des espèces végétales et est particulièrement utile pour dégager les feuilles entières et échantillons délicats parce qu’elle exige une agitation physique minimale. Comme mentionné ci-dessus, la dernière étape est critique pour la DÉCELLULARISATION d’échantillons. Échantillons avec des propriétés physiques distinctes peuvent être effacées en réglant le temps d’incubation dans les bains de surfactant non ionique. Un inconvénient important de ce processus, c’est que des tissus DECELLULARISE peuvent contenir des traces des détergents utilisés, qui peuvent par la suite influencer l’activité métabolique cellulaire des cellules de mammifères. Donc, pas de lavage minutieux sont recommandés avant l’utilisation. Ici, on a constaté que les échantillons lavés avec un tampon Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) suivi d’un milieu sans sérum avaient la viabilité cellulaire plus élevée que ceux laver à grande eau désionisée H2O avant leur utilisation (Figure 3 b).

Lors du stockage des échantillons non traités pour une utilisation future dans les deux méthodes, il est important de surveiller les dommages pour s’assurer que les échafaudages qui en résulte ne seront pas touchés. Des dommages peuvent apparaître comme une décoloration des tissus végétaux et le fendillement ou excessive fragilité lorsque géré. Il est recommandé de surveiller les échantillons sur une base hebdomadaire afin de les utiliser avant qu’ils ne sont plus utiles et doivent être éliminés. L’apparition des dégâts varie selon les types de spécimens, avec des échantillons plus robustes plus épais, une durée plus longue.

En général, les plantes bien promettent comme une source potentielle de biomatériaux. Ceci est renforcé par leurs structures complexes naturellement développées et caractéristiques que les aideront à grandissent dans leur environnement natif. Une utilisation réussie des tissus végétaux comme échafaudages ingénierie tissulaire propose une alternative potentiellement bon marché aux coûteux et souvent difficiles à concevoir, biomatériaux. Topographie de la surface du tissu de la plante, qui par nature varie d’une espèce à l’autre, peut également être exploitée directement dans l’espace orienté croissance cellulaire25. Par exemple, une étude antérieure a montré que les cellules humaines répondent aux repères topographiques présents sur les plantes DECELLULARISE25, donc que ces échafaudages peuvent être utilisés pour la culture de cellules dans les modèles hautement organisée,25. Une autre caractéristique qui est souhaitable en génie tissulaire est de novo perfusability. Tissus végétaux ont évolué au fil des centaines de millions d’années pour être extrêmement efficace pour le transport des fluides, et leurs réseaux vasculaires peut être efficacement perfusé24. Cette propriété peut être potentiellement utilisée pour guider la migration cellulaire et l’angiogenèse dans le but ultime de créer des tissus de remplacement pour des applications cliniques. Cela est étayé par les conclusions d’études antérieures qui ont démontré que les biomatériaux avec la grande surface et de la porosité interconnectée est propices à la prolifération des cellules et lorsqu’ils sont implantés en vivo, enable migration vers l’intérieur des cellules hôte dans l’implant36,37,38,39. La grande surface et la porosité interconnectée sont aussi la marque d’usine tissus40,41,42, donc échafaudages végétale sont susceptibles de s’intégrer avec les tissus environnants in vivo. En outre, des études récentes constaté que DECELLULARISE feuilles peuvent être perfusés avec succès avec cellules24 et que, lorsque les cellules humaines ont été ensemencés sur des tissus végétaux DECELLULARISE, elles soient conformes à leurs repères topographiques25. Lorsque les échafaudages pris tous ensemble, d’origine végétale possèdent les propriétés nécessaires pour être appliquée avec succès vers des applications en génie tissulaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier John Wirth des jardins Olbrich pour fournir gracieusement les spécimens utilisés dans ce projet. Ce travail est soutenu en partie par le National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL115282 à G.R.G.) Fondation nationale des sciences (DGE1144804 à J.R.G et G.R.G.) et le département de chirurgie de l’Université du Wisconsin et Alumni Fund (H.D.L.). Ce travail a été également soutenu en partie par l’Environmental Protection Agency (subvention no 83573701 de STAR), le National Institutes of Health (R01HL093282-01 a 1 et UH3TR000506) et la National Science Foundation (IGERT DGE1144804).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium dodecyl sulfate Sigma Life Science 75746-1KG
Triton X-100 MP Biomedicals, LLC 807426 Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) Clorox Item #: 31009 Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate Acros Organics 217120010 Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch HealthLink 15111-80 Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table Stovall Life Sciences BDRAA115S Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate Fisher Scientific Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker Any Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
DMEM Corning MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay Life Technologies P11496 Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
  2. Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
  3. Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
  4. Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
  5. Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
  6. Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  7. Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
  8. Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
  9. Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
  10. Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
  11. Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
  12. Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
  13. Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
  14. Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
  15. Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
  16. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
  17. Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
  18. Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
  19. Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
  20. Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
  21. Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
  22. Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  23. McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray's law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
  24. Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  25. Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
  26. Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
  27. Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  28. Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
  29. Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  30. Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
  31. Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from: http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html (2017).
  32. Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
  33. Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
  34. Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
  35. Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
  36. Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
  37. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  38. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
  39. Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
  40. Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923 (2003).
  41. Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. Biology of Plants. , 7th edition, (2005).
  42. Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).

Tags

Bio-ingénierie numéro 135 Decellularized échafaudages tissus végétaux feuilles tiges échafaudages irrigables DÉCELLULARISATION
Deux méthodes de DÉCELLULARISATION de tissus végétaux pour utilisations en génie tissulaire
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak,… More

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak, J. R., Gaudette, G. R., Le, H. D., Murphy, W. L. Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (135), e57586, doi:10.3791/57586 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter