Summary
Hier stellen wir Ihnen und Kontrast zwei Protokolle zum Pflanzengewebe decellularize verwendet: ein Waschmittel-basierten Ansatz und einem Reinigungsmittel-freie Ansatz. Beide Methoden hinterlassen die extrazelluläre Matrix von Pflanzengewebe verwendet, die dann als Gerüste für Tissue-engineering-Anwendungen genutzt werden können.
Abstract
Die autologe, synthetische und tierische Transplantate, die derzeit als Gerüste für Gewebeersatz genutzt haben Einschränkungen aufgrund der geringen Verfügbarkeit, schlechte Biokompatibilität und Kosten. Pflanzengewebe haben günstige Eigenschaften machen sie einzigartig für geeignet als Gerüste, wie hohe Oberfläche, hervorragende Wasser-Transport und Aufbewahrung, miteinander verbundenen Porosität, bereits vorhandenen vaskulären Netzwerken und eine breite Palette von mechanischen verwenden Eigenschaften. Zwei erfolgreiche Methoden der Pflanze Decellularization für Gewebe-engineering-Anwendungen werden hier beschrieben. Die erste Methode basiert auf Waschmittel Bäder zellulären Materie zu entfernen, die vorher festgelegten Methoden verwendet, um Säugetier-Gewebe ähnelt. Das zweite ist ein Waschmittel-freie Methode adaptiert von einem Protokoll, die isoliert Blatt Gefäßsystem und beinhaltet die Verwendung einer beheizten Bleichmittel und Salzbad, Blätter und Stängel zu löschen. Beide Methoden liefern Gerüste mit vergleichbare mechanische Eigenschaften und geringen zellulären metabolischen Auswirkungen, so dass des Benutzers, das Protokoll zu wählen, das besser zu ihrer Anwendung passt.
Introduction
Gewebetechnik entstanden in den 1980er Jahren erstelle ich lebendes Gewebe Ersatzstoffe und potenziell Adresse erhebliche Organ- und Engpässe1. Eine Strategie hat Gerüste verwendet, zu stimulieren und führen den Körper um fehlende Gewebe oder Organe zu regenerieren. Obwohl erweiterte Herstellung Ansätze wie 3D-Druck Gerüste mit einzigartigen physikalischen Eigenschaften hergestellt haben, bleibt die Fähigkeit zur Herstellung von Gerüsten mit den unterschiedlichsten erzielbaren physikalischen und biologischen Eigenschaften eine Herausforderung2 , 3. Darüber hinaus aufgrund mangelnder ein funktionsfähiges vaskuläre Netzwerk, diese Techniken bei der Regeneration von 3-dimensionalen Gewebe begrenzt haben. Die Verwendung von decellularized tierischen und menschlichen Geweben als Gerüste hat in Umgehung dieses Problems4,5,6,7unterstützt. Jedoch hohe Kosten, Variabilität von Charge zu Charge und begrenzten Verfügbarkeit können weit verbreiteten Einsatz von begrenzen decellularized Tier Gerüste8. Es gibt auch Bedenken hinsichtlich möglicher Krankheitsübertragung auf den Patienten und immunologische Reaktion auf einige decellularized Säugetier-Gewebe-9.
Zellulose, Pflanze und bakteriellen Quellen abgeleitet wurde ausgiebig zur Biomaterialien für ein breites Anwendungsspektrum in der regenerativen Medizin zu generieren. Hier einige Beispiele: Knochen,10,11, Knorpel12,13,14 und15der Wundheilung. Gerüste, die bestehen aus Zellulose haben einen zusätzlichen Vorteil, dass sie langlebig und resistent gegen Seins Säugerzellen aufgeschlüsselt sind. Dies ist die Säugetier-Zellen nicht die Enzyme zum Abbau von Zellulose Moleküle notwendig produzieren. Im Vergleich dazu Gerüste mit Makromoleküle aus der extrazellulären Matrix, wie Kollagen produziert, sind16 leicht abgebaut und möglicherweise nicht gut geeignet, um langfristige Anwendungen. Kollagen-Gerüste können durch chemische Vernetzung stabilisiert werden. Allerdings gibt es ein Trade-off wegen der inhärenten Giftigkeit der quervernetzern, die die Biokompatibilität der Gerüste17betreffen. Zellulose hat hingegen das Potenzial an der Implantationsstelle für längere Zeit zu bleiben, denn es ist unempfindlich gegen enzymatischen Abbau von Säugerzellen18,19,20. Dies kann durch tuning die Rate der Zerstörung durch Hydrolyse Vorbehandlung und Co-Delivery von Gerüsten mit Cellulasen21verändert werden. Die Biokompatibilität des decellularized pflanzlicher Zellulose Gerüste in Vivo wurde auch in einer Studie an Mäusen22nachgewiesen.
Durch Hunderte von Millionen von Jahren der Evolution haben Pflanzen verfeinert, ihre Struktur und Zusammensetzung zur Steigerung der Effizienz des flüssigen Transport und Aufbewahrung. Pflanze vaskulären Schiffe minimieren hydraulische Widerstand durch Verzweigung in kleinere Gefäße, ähnlich wie bei den Säugetieren Gefäßsystem nach Murrays Gesetz23. Nach Decellularization wird die Pflanze komplexes Netzwerk von Schiffen und miteinander verbundenen Poren beibehalten. In Anbetracht der Vielzahl von verschiedenen Pflanzenarten zur Verfügung haben pflanzliche Gerüste das Potenzial, derzeit betroffen Gerüste im Tissue engineering24,25Einschränkungen zu überwinden. Modulevsky Et Al. zeigte beispielsweise, dass Angiogenese und Zelle Migration ereignete sich, als decellularized Apfel Gewebe auf der Rückseite von einer Maus22subkutan implantiert wurde. Gershlak Et Al. zeigten ebenso, dass Endothelzellen in das Gefäßsystem der decellularized Blätter24angebaut werden konnte. In einem separaten Experiment Gershlak Et Al. konnten auch zeigen, dass Herzmuskelzellen auf der Oberfläche der Blätter angebaut werden könnte und wurden24abschließen.
Pflanzen sind auch komplexe Organisation von der zellulären, der makroskopischen Skala, die schwierig ist, auch mit den modernsten Herstellungstechniken entwickelt, um Datum zu erreichen. Die komplexe hierarchische Gestaltung der Pflanzengewebe macht sie stärker ist als die Summe ihrer Bestandteile26. Pflanzen besitzen eine Fülle von unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften von starren und harten Komponenten wie Stängel, zu viel flexibler und biegsam wie Blätter27. Blätter variieren je nach Spezies in Bezug auf Größe, Form, Stärke, den Grad der Vaskularisierung, brechen und können unterschiedliche Grade der Hydrophilie tragen. Diese Pflanze Eigenschaften zufolge insgesamt decellularized Pflanzen als einzigartige und höchst funktionelle medizinische Geräte, unter anderem als Gewebezüchtung Gerüste dienen können.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei Methoden, um decellularize Pflanzengewebe, wie z. B. verlässt und herrührt, für den Einsatz als Gerüste in Gewebetechnik. Die erste Methode ist eine Waschmittel-basierte Technik, die verwendet eine Reihe von Bädern, DNA und zelluläre Materie, die aus einer weit verbreiteten Technik decellularize Säugetier-und Gewebe6,22,25 Pflanzen angepaßt worden ist zu entfernen ,28,29,30. Die zweite Methode ist frei von Waschmittel und ist von einem "Skelettierung" Protokoll in der Regel verwendet, um das weiche Gewebe der Blätter31angepasst. Vorherige Arbeiten zeigten, dass Sieden Blätter in einer Chlorid und Natrium Bikarbonat-Lösung Trennung des Gefäßsystems von den umgebenden Weichgewebe-31 erleichtert. Diese Technik kann zurück zu Experimenten in der 17th und18 Jahrhundert, wie die Arbeit von Albertus Seba32 und Edward Parrish33 angeführt werden. Diese Experimente zentriert um verlassen Pflanzenteile, wie Blätter und Früchte, in Wasser getaucht, über einen längeren Zeitraum (Wochen bis Monate) und ermöglicht die weicheren Gewebe natürlich zerfallen. Hier ist der Ansatz "Skelettierung" um milderen Bedingungen, z. B. längere Inkubationszeiten bei niedrigeren Temperaturen zu verwenden, um zelluläre Rückstände zu entfernen und nicht zu erheblich stören die Weichgewebe-Struktur angepasst. Für die detaillierte hierin Experimente dienten drei Anlagentypen: Ficus Hispida, Pachira Aquatica und eine Art von Garcinia. Ergebnisse von DNA-Quantifizierung, mechanische Prüfungen und Auswirkungen auf die zelluläre Stoffwechselaktivität von beiden Methoden werden beschrieben.
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Protocol
1. Decellularization von Pflanzengewebe mit dem Waschmittel-basierten Ansatz
-
Verwenden Sie frische oder gefrorene F. Hispida, Blattproben. Frieren Sie nicht verwendete frische Proben in einem Gefrierschrank-20 ° C und Shop für zukünftigen Gebrauch (bis zu einem Jahr).
Hinweis: Verwenden Sie Stamm oder Blatt Gewebe fast jede gewünschte Pflanze. Längere Lagerzeiten können das Gewebe beschädigen.- Bestimmen die Größe und Form der Proben auf der Grundlage der Probe Verwendungszweck verarbeitet werden (d.h. Proben in Streifen geschnitten eignen sich gut für mechanische Prüfanwendungen, inzwischen 8 mm Scheibe Proben eignen sich Multi-gut Kultivierung Anwendungen ). Schneiden Sie das Blatt in 8-mm-Scheiben mit einer scharfen, sauberen Biopsie Schlag während untergetaucht unter Raumtemperatur (20-25 ° C) entionisiertem H2O.
Hinweis: Dieses Protokoll kann auf ganze Blätter und Stängel verwendet werden. Allerdings werden kleinere Proben schneller decellularize. - Brüten Sie die Proben für 5-10 min bei Raumtemperatur (20-25 ° C) entionisiertem H2O auf einem Shake Platte auf eine niedrige Drehzahl-Einstellung zu waschen und/oder tauen sie aus. Verwenden Sie genug entionisiertem H2O, um sicherzustellen, dass alle Proben gründlich benetzt sind.
- Bestimmen die Größe und Form der Proben auf der Grundlage der Probe Verwendungszweck verarbeitet werden (d.h. Proben in Streifen geschnitten eignen sich gut für mechanische Prüfanwendungen, inzwischen 8 mm Scheibe Proben eignen sich Multi-gut Kultivierung Anwendungen ). Schneiden Sie das Blatt in 8-mm-Scheiben mit einer scharfen, sauberen Biopsie Schlag während untergetaucht unter Raumtemperatur (20-25 ° C) entionisiertem H2O.
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Bereiten Sie eine Lösung von 10 % (w/V) Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) in entionisiertem H2O. Ort die Proben in einem geeigneten Behälter (Glas oder Plastikschale ist ideal) und fügen Sie SDS-Lösung um die Proben vollständig zu bedecken. 5 Tage bei Raumtemperatur (20-25 ° C) inkubieren Sie Proben auf einem Shake Platte auf eine niedrige Drehzahl um Schäden an den Proben.
Hinweis: Überfüllen Sie den Container nicht, da dies die Decellularization verlangsamen und zu ungleichen Behandlung von SDS führen. Bei diesem Schritt sollten Proben einen braunen Farbton erwerben.- Ersetzen Sie nach 5 Tagen die SDS-Lösung mit entionisiertem H2O. Incubate Proben für eine zusätzliche 10-15 min auf der Platte schütteln alle restlichen SDS-Lösung gründlich abwischen.
- Bereiten Sie eine 1 % (V/V) nichtionische Tenside in 10 % (V/V) Bleichmittel-Lösung. Eine 500 mL-Lösung zu machen, mischen 5 mL des nichtionischen Tensids mit 50 mL Bleichmittel dann hinzufügen 445 mL entionisiertem H2O. Submerge Proben in der frisch zubereiteten Lösung.
Hinweis: Der nichtionischen Tenside/Bleichmittel-Lösung muss daher keine lange Haltbarkeit, sollte innerhalb von 48 Stunden der Vorbereitung verwendet werden. -
Die nichtionischen Tenside/Bleichmittel-Lösung alle 24 h zu ersetzen, bis die Proben vollständig gelöscht werden (siehe Abbildung 1A zum visuellen Vergleich). Dann inkubieren Sie die Probe in entionisiertem Wasser auf einem Shake-Teller für 2 min um das überschüssige nichtionisches Tensid/Bleichmittel-Lösung abspülen. Legen Sie die Shake-Platte auf eine niedrige Einstellung, damit die Proben nicht beschädigt.
Hinweis: Der Zeitaufwand für die verwendeten Proben deutlich variiert, je nach Typ und Art der Anlage. Die komplette Verfärbungen der Proben ist bezeichnend für volle Decellularization (führen Sie DNA Quantifizierung um gründliche Lichtung zu gewährleisten).- Lyophilize der Proben bis zu einem Jahr zu speichern (Blitz einfrieren mit flüssigem Stickstoff wird bevorzugt, Einfrieren der Proben bei-80 ° C ist auch in Ordnung) und bei Raumtemperatur (20-25 ° C) in niedriger Luftfeuchtigkeit lagern.
- Rekonstituieren Proben in Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) mit genug, um Mantel Proben. Spülen Sie Proben 2-3 Mal in serumfreien Medien sanft mit einer Mikropipette vor Gebrauch (d. h. Verwendung 150-300 µL pro Spülgang in einem standard 24-well-Platte).
Hinweis: Tris-HCl-Puffer und serumfreie Medien (z. B. DMEM, aber grundlegende Zellkultur, die Medien ersetzt werden können) sind effektiver bei der Senkung der Auswirkungen auf die Zellviabilität SDS behandelt Proben als diejenigen mit entionisiertem H2O allein behandelt.
2. Vorbereitung der Proben mit dem Waschmittel-freie Decellularization-Ansatz
Hinweis: Die ersten Schritte dieses Verfahrens zusammen mit Schritte 1.1-1.1.2 (siehe oben).
- Bereiten Sie einen 5 % (V/V) Bleichmittel (NaClO) und 3 % (w/V) Natriumbicarbonat (Nahco33) Lösung. Wärmen Sie die Lösung in einer Dampfhaube auf 60-70 ° C für F. Hispida Blattproben in 8-mm-Scheiben unter Rühren auf einer heißen Platte schneiden.
Hinweis: Das Natriumbicarbonat kann mit Natriumkarbonat (Na2CO3) oder Natriumhydroxid (NaOH) ersetzt werden. Die gewünschte Temperatur variiert stark (von Raumtemperatur bis 90 ° C) und sollte entsprechend den Eigenschaften der verwendeten Proben angepasst werden. - Sobald die Lösung den gewünschten Temperaturbereich erreicht, Tauchen Sie die Proben und reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit um diese Schäden zu vermeiden. Nachdem die Proben sichtbar gelöscht werden (siehe Abbildung 1 b zum visuellen Vergleich), entfernen Sie vorsichtig aus dem Bad. Inkubieren Sie Proben einmal in entionisiertem H2O für 1-2 min, überschüssige Bleichmittel-Lösung zu entfernen.
Hinweis: Der Zeitaufwand für die Proben klar kann stark variieren. Geschnittene Petersilie kann beispielsweise in 10-15 min, während dickere und/oder größere Proben gelöscht werden, wie z. B. ganze Blätter oder Stiele Stunden, in Hochtemperatur-Bäder dauern können, komplett zu löschen. - Lyophilize der Proben und bei Raumtemperatur (20-25 ° C) in niedriger Luftfeuchtigkeit lagern.
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Representative Results
Beide Methoden ergab Gerüste, die für die Zellkultur und Tissue engineering-Anwendungen geeignet waren. Abbildung 1 zeigt den allgemeinen Workflow über den Decellularization-Prozess mit einer intakten Blatt für die Reinigungsmittel basierende Methode und geschnittenen Proben (8 mm Durchmesser) für die Waschmittel-freie Methode. Erfolgreiche Decellularization des Ficus Hispida Gewebe nach beiden Methoden ergab klare und intakte Proben (Abbildung 1A und 1 b). War es möglich, ganze Pflanzengewebe (Abbildung 1A); decellularize kleinere Proben schien jedoch deutlich schneller und effektiver. Ein mögliches Problem mit dem Waschmittel-basierten Ansatz beobachtet beteiligt heterogenen Decellularization durch vorzeitige Entnahme aus der nichtionischen Tenside Bad (Abbildung 1). Ein Nachteil der Waschmittel-freie Methode ist, dass aufgrund der längeren Inkubationszeit im beheizten Bad (Abbildung 1) Schäden auftreten kann.
Die mechanischen Eigenschaften des decellularized Gerüste mit beiden Methoden zubereitet wurden mit einachsigen Zugversuch, wie in anderen Studien24,34untersucht. Diese Tests ergaben maximale tangentiale Elastizitätsmodul (MTM) (Abbildung 2A), Belastung bei Ausfall (SAF) (Abb. 2 b) und Zugfestigkeit (UTS) (Abbildung 2) F. Hispida und Pachira Aquatica Proben. P. Aquatica Proben mit beiden Protokollen Decellularization ähnliche mechanische Eigenschaften über alle drei gemessenen Parameter angezeigt. Die F. Hispida Proben zeigten einen ähnlichen Verlauf wie in allen Fällen, außer die UTS Prüfung. Proben mit dem Waschmittel-basierte (SDS) Protokoll hatte insbesondere höhere durchschnittliche UTS-Ergebnisse als jene, die mit dem Waschmittel-frei (Bleichmittel) Ansatz. Diese Ergebnisse zeigen, dass Proben aus verschiedenen Pflanzenarten unterschiedliche decellularized Gerüst Eigenschaften, wenn über die beiden Decellularization Protokolle vorbereitet produzieren können.
Zur Messung der Entfernung von DNA wurden Proben mit beiden Methoden und ihre genomische DNA wurde mit einer vorher festgelegten Protokoll35isoliert. Beide Decellularization-Methoden (Waschmittel-basierte und Reinigungsmittel-freie) signifikant verringert die genomische DNA-Gehalt der Proben auf 2,47 ng DNA/mg (n = 3, s = 0,18) und 2,71 ng DNA/mg des Gewebes (n = 3, s = 1,60) bzw. (Abb. 2D). Non-decellularized Proben hatten 104.67 ng DNA/mg des Gewebes (n = 3, s = 26.21) (Abb. 2D). Der erhebliche Rückgang in DNA-Gehalt nach Decellularization eine effektive Entfernung der Pflanzenzelle angegebenen Rolle.
Die Auswirkungen auf die Zellviabilität der beiden Decellularization Methoden wurde durch Messung der Stoffwechselaktivität der menschlichen dermalen Fibroblasten (hDF) für 2 Tage in Anwesenheit von decellularized p. Aquatica oder Garcinia Gerüste kultivierten beurteilt. hDFs hatte höhere Stoffwechselaktivität wenn in Gegenwart von Gerüsten decellularized über die Waschmittel-freie Methode im Vergleich zu denen vorbereitet über die Waschmittel-basierte Methode (Abbildung 3A) kultiviert. Um sicherzustellen, dass die gründliche Beseitigung von während der Decellularization, einen zusätzlichen Satz von Experimenten verwendeten Reagenzien durchgeführt wurde, in dem die vorbereitete Gerüste vor Zellkultur ausgiebig gewaschen wurden. Zwei separate Wäsche Methoden wurden getestet auf Proben mit dem Waschmittel-basierten Ansatz: eine Wäsche in Tris-HCl-Puffer (10 mM, pH 8,5) gefolgt von eine Wäsche in Serum freie Medien vs. 2 Wäschen in entionisiertem H2O. Beide Ansätze verwendet final Waschschritten mit 1 X PBS. Die Auswirkungen auf den Säugetier-Zellen anschließend ausgesetzt, die decellularized Pflanze Gerüste wurde gemessen unter Verwendung des gleichen Stoffwechselaktivität Tests wie oben beschrieben. Tris-HCl-Puffer (10 mM, pH 8,5) gefolgt von Serum freie Medien ermöglichte eine Reduzierung der Auswirkungen auf die zelluläre Stoffwechselaktivität im Vergleich mit entionisiertem H2O, so dass Proben mit den Reinigungsmittel-basierten Ansatz vergleichbar mit Proben aus der Waschmittel-free behandelt Methode (Abb. 3 b).
Es wurde bereits gezeigt, dass Säugerzellen auf Gerüsten, die unter Verwendung der Reinigungsmittel-basierten Ansatz25wachsen könnte; Daher war es notwendig, dies auf Proben von der zuvor ungetestete Waschmittel-freie Methode zu demonstrieren. Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) wurden ausgesät decellularized F. Hispida Blattproben (8-mm-Scheiben) auf 20.000 Zellen pro Gerüst und durfte für 24 h inkubieren. Diese Gerüste wurden vor der Einführung der Zelle mit einem RGD-Dopamin-Konjugat Erleichterung der Einhaltung funktionalisiert. Abbildung 4 zeigt Bilder von einem typischen Beispiel gesammelt. Eine Hellfeld-Bild wurde gesammelt, um zu zeigen, die allgemeine Struktur eines Abschnitts des Beispiels verwendet (Abb. 4A). Die MSCs waren voller Flecken mit Calcein und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Abb. 4 b) abgebildet. Die Bilder wurden dann (Abbildung 4), um den Speicherort der die wachsenden Zellen auf der Oberfläche des Blattes anzuzeigen überlagert.
Abbildung 1 . Die allgemeinen Workflow für Decellularization von Pflanzengewebe. Typischen Workflow für die Decellularization von Pflanzengewebe (Wasch- und vorbereitende Schritte sind universell); (A) oberen Pfad ist für Waschmittel-basierte Methode (B) unten für die Waschmittel-freie Methode. (C) eine unvollständige/Fehler beim Decellularization von einem p. Aquatica -Blatt mit der Waschmittel-basierte Methode durch vorzeitige Entnahme aus der nichtionischen Tenside/Bleiche Bad (D) A beschädigt Decellularization eines Blattes F. hispida aufgrund der längeren Inkubationszeit in der beheizten Bleichmittel-Lösung in der Waschmittel-frei-Methode. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Vergleich der mechanischen Eigenschaften und Wirksamkeit der Decellularization zwischen Methoden. Bedeuten ± SD; statistische Analyse erfolgte anhand der zwei Stichproben t-Test und p Werte aufgeführt, wo statistisch signifikant (kleiner oder gleich 0,05). Vergleich der mechanischen Prüfung ergibt sich zwischen Proben von F. Hispida und p. Aquatica (blaue Balken für Waschmittel basierenden Ansatz, rot für das Waschmittel-freie und grün für unbehandelte Proben verwendet) (F. Hispida Waschmittel-basierte n = 4, Waschmittel-freie n = 2; P. Aquatica Waschmittel-Base n = 3, Waschmittel-freie n = 4) (A) maximale Tangente Modulus (MTM) (B) Belastung bei Ausfall (SAF) (C) und ultimative Zugfestigkeit (UTS). (D) A DsDNA Quantifizierung Assay in dreifacher Ausfertigung auf drei Proben aus jeder Gruppe ausgeführt wurde: unbehandelt (frisch, n = 3), die Waschmittel-freie Methode (Bleichen, n = 3) und die Waschmittel-basierte Methode (SDS, n = 3), p -Werte sind für die Decellularization-Methode Gruppe im Vergleich zu unbehandelten Probe Gruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Stoffwechselaktivität Untersuchungsergebnisse Auswirkungen zwischen den beiden Decellularization Methoden zu vergleichen. Meine ± SD; Statistische Auswertung erfolgte mit dem zwei-Stichproben t-Test und aufgeführten wo statistisch signifikanten p -Werte (kleiner oder gleich 0,05). Zelluläre Stoffwechselaktivität wurde im Beisein von Gewebeproben von p. Aquatica und eine Art von Garcinia (normiert auf Kontroll-Vertiefungen mit keine Probe hinzugefügt) gemessen (A) Vergleich der metabolischen Auswirkungen der beiden anzeigen Decellularization Methoden (n = 3 für jede Gruppe) und (B) Vergleich der Auswirkungen auf die Stoffwechselaktivität mit zwei Methoden in Waschmittel-basiertes Protokoll waschen: Tris-HCl-Puffer (10 mM, pH 8,5) kombiniert mit Serum freie Medien (n = 4) vs. entionisiertem H 2 O (n = 4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) wachsen auf der Oberfläche des decellularized Ficus Hispida Blatt, mit einem RGD-Dopamin-Konjugat funktionalisiert. MSCs wurden auf F. Hispida Blätter angebaut, decellularized durch die Waschmittel-freie Methode und funktionalisiert mit ein RGD-Dopamin-Konjugat (500 µm Maßstab Bars waren für Verweis hinzugefügt) (A) Hellfeld Bild eines Teils der decellularized Blatt (B ) Fluoreszenzbild von Calcein gebeizt MSCs auf Blatt Oberfläche (C) zusammengeführten helles Feld und Fluoreszenz Bild wächst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier sind zwei Methoden, um Pflanzengewebe decellularize beschrieben. Die hier vorgestellten Ergebnisse gepaart mit den Ergebnissen von früheren Studien25, legen nahe, dass die Protokolle streckte dürften für ein breites Spektrum an Pflanzenarten und an Stängeln und Blättern ausgeführt werden kann. Diese Verfahren sind einfach und erfordern keine Spezialausrüstung, so dass die Pflanze Decellularization in den meisten Labors durchgeführt werden kann. Es ist bemerkenswert, dass nach Decellularization, die Gerüste funktionalisiert werden müssen, um Säugetier-Zelle Adhäsion zu erleichtern. An anderer Stelle beschrieben verschiedene Funktionalisierung Techniken ermöglichen Säugetier-Zelle Adhäsion und Wachstum auf pflanzlichen Geweben wurden25 und sind nicht das Thema des aktuellen Manuskripts.
Der letzte Schritt in beide Decellularization Protokolle hier vorgestellten (Abbildung 1) war entscheidend für ihren Erfolg. Wenn beide Methoden ausführen nicht überfüllen das Bad als dies führt eine ungleichmäßige Lichtung. Diese Methoden können auf ganze Blätter und Stängel angewendet werden; Allerdings erhöht das die Länge der Zeit benötigt, um sie zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Proben ganz untergetaucht sind, um die Räumung innerhalb der gesamten Stichprobe konsistent zu halten. Im Idealfall sollte Decellularization Pflanzengewebe der meisten zellulären Angelegenheit klar, bei gleichzeitiger Minimierung der Bauschäden. Es ist wahrscheinlich, dass die Waschmittel-freie Methode geändert werden kann, je nach Bedarf mit gewünschten Exemplare zu arbeiten. Höhere Temperaturen Bad möglicherweise in Zeiten schneller löschen aber auch möglicherweise mehr Schaden zu den Beispielen sind übermäßig inkubierten. Niedrigere Temperaturen erfordern längere Inkubationszeiten und für mehr empfindliche Proben angemessen wäre. Die Konzentration der Bleichmittel in der Lösung kann auch geändert werden, um zu beschleunigen oder verlangsamen des Decellularization-Prozess. Beim testen neue Beispiele für die Verwendung mit Reinigungsmittel-freie Methode, es empfiehlt sich zunächst eine Temperatur von 50-60 ° C mit häufigen Kontrollen über den Fortschritt der Decellularization (im Idealfall alle 15-20 Minuten) bis sie ausreichend geklärt sind. Dieser Temperaturbereich wurde gut vertragen von den meisten der Pflanzenarten, die bei der Optimierung der Technik getestet wurden. Nach der Fertigstellung der Proben können visuell kontrolliert werden und würde manuell um sicherzustellen, dass sie nicht übermäßig inkubiert und irreparabel beschädigt, als durch reißen oder Zerfall nach Entnahme aus dem Bad angegeben werden. Proben mit diesem Ansatz zeigen eine verminderte Wirkung auf das Zellwachstum (siehe Abbildung 3A) als das Waschmittel basierendes Modell mit nur Waschen in entionisiertem H2O. Allerdings empfiehlt es sich, zusätzlich mit Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) waschen und serumfreie Medien, vor allem in sensiblen Anwendungen.
Die Waschmittel-basierte (SDS) Methode ist wahrscheinlich für die meisten Pflanzenarten und eignet sich besonders für das clearing ganze Blatt und empfindlichen Proben, weil es minimale körperliche Erregung erfordert. Wie bereits erwähnt, ist der letzte Schritt für die Decellularization der Proben von entscheidender Bedeutung. Proben mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften können durch Anpassung der Inkubationszeit in den Bädern von nichtionischen Tensiden gelöscht werden. Ein erheblicher Nachteil dieses Verfahrens ist, dass decellularized Gewebe Spuren von dem Waschmittel enthalten können, die anschließend die zelluläre Stoffwechselaktivität der Säugetier-Zellen beeinflussen können. Daher sind gründliche waschen Schritte vor dem Gebrauch empfohlen. Hier wurde festgestellt, dass Proben mit Tris-HCl-Puffer (10 mM, pH 8,5) gefolgt von serumfreie Medien gewaschen höhere Zellviabilität hatten als diejenigen gewaschen mit H2O vor ihrer Verwendung (Abb. 3 b entionisiertem).
Speichern von unbehandelten Proben für die zukünftige Verwendung in beiden Methoden ist es wichtig, überwachen sie für Schäden an sicherzustellen, dass die daraus resultierenden Gerüste nicht beeinträchtigt werden. Schäden kann als Verfärbung von Pflanzengewebe, sowie Rissbildung oder übermäßige Sprödigkeit beim Umgang mit angezeigt. Es empfiehlt sich, die Proben auf einer wöchentlichen Basis, um sie zu nutzen, bevor sie nicht mehr nützlich sind zu überwachen und müssen entsorgt werden. Das Auftreten von Schäden variiert zwischen Probenarten mit dicker robuster Proben länger.
Pflanzen in der Regel versprechen viel als eine potenzielle Quelle für Biomaterialien. Dies wird verstärkt durch ihre natürlich gewachsenen komplizierten Strukturen und Eigenschaften, die ihnen helfen zu wachsen, in ihrer heimischen Umgebung. Erfolgreiche Nutzung von Pflanzengewebe als Tissue engineering Gerüste schlägt eine potenziell preiswerte Alternative zu teuren und oft schwer zu entwerfen, Biomaterialien. Pflanzliches Gewebe Oberflächentopographie, die von Natur aus von einer Spezies zur anderen variiert, kann auch auf direkte räumlich orientierten Zellwachstum25genutzt werden. Zum Beispiel hat eine frühere Studie gezeigt, dass menschliche Zellen auf topographische Hinweise auf decellularized Pflanzen25, so, dass diese Gerüste verwendet werden reagieren, um Zellen in hochorganisierte Muster25Kultur. Ein weiteres Feature, das im Gewebe-Engineering wünschenswert ist de Novo Perfusability. Pflanzengewebe haben sich über Hunderte von Millionen von Jahren äußerst effizient im fließenden Verkehr entwickelt können, und ihre vaskulären Netzwerken effizient PERFUNDIERTEN24. Diese Eigenschaft kann potenziell verwendet werden, um zelluläre Migration und Angiogenese mit dem Ziel der Schaffung Ersatzgewebe für klinische Anwendungen zu führen. Dies wird verstärkt durch die Ergebnisse früherer Studien, die zeigten, dass Biomaterialien mit hoher Oberfläche und vernetzten Porosität förderlich, Zellproliferation und implantiert werden in Vivo, aktivieren Zuwanderung von Wirtszellen in das Implantat36,37,38,39. Die große Oberfläche und die miteinander verbundenen Porosität sind auch das Markenzeichen von pflanzlichen Geweben40,41,42, also pflanzlichen Gerüste haben das Potenzial, mit dem umliegenden Gewebe integrieren in-vivo. Darüber hinaus fanden neuere Studien, dass die decellularized Blätter erfolgreich mit Zellen24 durchblutet werden können, wenn menschliche Zellen auf decellularized Pflanzengewebe ausgesät wurden, sie ihre topographische Hinweise25 entsprachen. Wenn genommen alle zusammen, pflanzliche Gerüste besitzen die erforderlichen Eigenschaften für Tissue engineering-Anwendungen erfolgreich angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchten danken John Wirth von Olbrich Gärten für gnädig liefert die Exemplare, die in diesem Projekt verwendet. Diese Arbeit wird teilweise durch das National Heart, Lung and Blood Institute unterstützt (R01HL115282, G.R.G) National Science Foundation (DGE1144804, J.R.G und G.R.G), und der University of Wisconsin Abteilung für Chirurgie und Alumni Fonds (H.D.L.). Diese Arbeit wurde auch teilweise von der Environmental Protection Agency (STAR Grant Nr. 83573701), die National Institutes of Health (R01HL093282-01A1 und UH3TR000506) und der National Science Foundation (IGERT DGE1144804) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Life Science | 75746-1KG | |
| Triton X-100 | MP Biomedicals, LLC | 807426 | Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up. |
| Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) | Clorox | Item #: 31009 | Standard concentrated bleach. |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 217120010 | Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate. |
| 8 mm Biopunch | HealthLink | 15111-80 | Cuts samples that fit well in 24 well plate |
| Belly Dancer-Shake table | Stovall Life Sciences | BDRAA115S | Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table. |
| Isotemp hot/stir plate | Fisher Scientific | Can use any style/brand of hot/stir plate. | |
| Beaker | Any | Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them. | |
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| DMEM | Corning | MT50003PC | |
| Quant-iT Picogreen dsDNA assay | Life Technologies | P11496 | Can use any dsDNA quantification mehtod on hand. |
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