Summary
यहां हम मौजूद है, और इसके विपरीत दो प्रोटोकॉल decellularize संयंत्र के ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया: एक डिटर्जेंट आधारित दृष्टिकोण और एक डिटर्जेंट मुक्त दृष्टिकोण । दोनों तरीकों संयंत्र के ऊतकों, जो तब ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए पाड़ के रूप में उपयोग किया जा सकता है की extracellular मैट्रिक्स के पीछे छोड़ दें ।
Abstract
ऑटोलॉगस, सिंथेटिक, और पशु वर्तमान में ऊतक प्रतिस्थापन के लिए पाड़ के रूप में इस्तेमाल किया भ्रष्टाचार कम उपलब्धता के कारण सीमाएं हैं, गरीब जैव संगतता, और लागत । संयंत्र के ऊतकों अनुकूल विशेषताएं है कि उंहें विशिष्ट इस तरह के उच्च सतह क्षेत्र, उत्कृष्ट जल परिवहन और प्रतिधारण, परस्पर porosity, मौजूदा संवहनी नेटवर्क, और यांत्रिक की एक विस्तृत श्रृंखला के रूप में मचान के रूप में उपयोग के लिए अनुकूल बनाने के लिए है गुण. ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए संयंत्र decellularization के दो सफल तरीकों यहां वर्णित हैं । पहली विधि डिटर्जेंट स्नान पर आधारित है सेलुलर बात है, जो पहले से स्थापित स्तनधारी ऊतकों को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के समान है को दूर करने के लिए । दूसरा एक डिटर्जेंट-मुक्त एक प्रोटोकॉल है कि पत्ती vasculature अलग से अनुकूलित विधि है और एक गर्म ब्लीच और नमक स्नान के उपयोग के लिए पत्तियों और उपजी स्पष्ट शामिल है । दोनों तरीकों तुलनीय यांत्रिक गुणों और कम सेलुलर चयापचय प्रभाव के साथ मचान उपज, इस प्रकार उपयोगकर्ता प्रोटोकॉल जो बेहतर उनके इच्छित आवेदन सूट का चयन करने के लिए अनुमति देता है ।
Introduction
ऊतक इंजीनियरिंग 1980 के दशक में उभरा ऊतक विकल्प रहने वाले बनाने के लिए, और संभवतः महत्वपूर्ण अंग और ऊतक की कमी का पता1। एक रणनीति मचान का इस्तेमाल किया है उत्तेजित और लापता ऊतकों या अंगों को पुनर्जीवित करने के लिए शरीर गाइड । हालांकि ऐसे 3-डी मुद्रण के रूप में उंनत विनिर्माण दृष्टिकोण अद्वितीय भौतिक गुणों के साथ मचान का उत्पादन किया है, को प्राप्त शारीरिक और जैविक गुणों की एक विविध रेंज के साथ पाड़ निर्माण की क्षमता एक चुनौती है2 , 3. इसके अलावा, एक कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क की कमी के कारण, इन तकनीकों 3 आयामी ऊतकों को पुनः उत्पन्न करने में सीमित किया गया है । विपाड़ों के रूप में विसेलुलर पशु और मानव ऊतकों का उपयोग इस समस्या को दरकिनार करने में सहायता प्राप्त है4,5,6,7. हालांकि, उच्च लागत, बैच के लिए बैच परिवर्तनशीलता, और सीमित उपलब्धता के लिए विनिर्मित पशु पाड़ों8के व्यापक उपयोग की सीमा हो सकती है । वहां भी कर रहे है रोगियों और कुछ सेलुलर स्तनधारी ऊतकों को immunologic प्रतिक्रिया के लिए संभावित रोग संचरण के बारे में चिंताएं9।
फाइबर, संयंत्र और बैक्टीरियल स्रोतों से व्युत्पंन, बड़े पैमाने पर अपक्षयी चिकित्सा में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सामग्री को उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । कुछ उदाहरणों में शामिल हैं: हड्डी10,11, उपास्थि12,13,14 और घाव हीलिंग15. पाड़ कि फाइबर के शामिल है कि वे टिकाऊ और स्तनधारी कोशिकाओं से नीचे टूट जा रहा है प्रतिरोधी रहे है में एक अतिरिक्त लाभ है । यह तथ्य यह है कि स्तनधारी कोशिकाओं को नीचे फाइबर अणुओं को तोड़ने के लिए आवश्यक एंजाइमों का उत्पादन नहीं करने के कारण है । इसकी तुलना में, पाड़ों extracellular मैट्रिक्स से अणुओं का उपयोग कर उत्पादित, ऐसे कोलेजन के रूप में, आसानी से नीचे टूट रहे है16 और अच्छी तरह से दीर्घकालिक अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल नहीं हो सकता है । कोलेजन मचान रासायनिक पार से स्थिर किया जा सकता है जोड़ने । हालांकि, वहां एक व्यापार है पार के अंतर्निहित विषाक्तता के कारण-linkers कि पाड़ों17की अनुकूलता को प्रभावित करते हैं । इसके विपरीत, फाइबर के लिए समय की लंबी अवधि के लिए आरोपण के स्थल पर मौजूद रहने की क्षमता है क्योंकि यह स्तनधारी कोशिकाओं18,19,20द्वारा एंजाइमी क्षरण के लिए अभेद्य है । इस hydrolysis के माध्यम से क्षरण की दर ट्यूनिंग द्वारा बदला जा सकता है और सह cellulases21के साथ पाड़ों के वितरण । vivo में एक सेलुलर संयंत्र व्युत्पंन फाइबर पाड़ के असंगति भी चूहों पर किया22एक अध्ययन में प्रदर्शन किया गया है ।
विकास के वर्षों के लाखों लोगों के सैकड़ों के माध्यम से, पौधों को द्रव परिवहन और प्रतिधारण की दक्षता बढ़ाने के लिए अपनी संरचना और रचना परिष्कृत किया है । संयंत्र संवहनी जहाजों छोटे जहाजों में बंटी द्वारा हाइड्रोलिक प्रतिरोध को कम, स्तनधारी vasculature के लिए इसी तरह के अनुसार है मरे कानून23। decellularization के बाद, संयंत्र के जहाजों के जटिल नेटवर्क और परस्पर pores बनाए रखा है । अलग संयंत्र आसानी से उपलब्ध प्रजातियों की विशाल संख्या को ध्यान में रखते हुए, संयंत्र-पाड़ों को डिजाइन वर्तमान में ऊतक इंजीनियरिंग24,25में पाड़ों को प्रभावित करने की क्षमता पर काबू पाने की संभावना है । उदाहरण के लिए, Modulevsky एट अल. प्रदर्शन किया है कि angiogenesis और सेल प्रवास हुआ जब सेलुलर एप्पल ऊतक एक चूहा22की पीठ पर चमड़े से प्रत्यारोपित की गई । इसी प्रकार, Gershlak एट अल । दिखाया गया है कि endothelial कोशिकाओं के vasculature के भीतर हो सकता है सेलुलर पत्तियों24। एक अलग प्रयोग में, Gershlak एट अल. भी दिखाने के लिए कर रहे थे कि cardiomyocytes पत्तियों की सतह पर उगाया जा सकता है और24अनुबंध करने में सक्षम थे ।
संयंत्र भी सेलुलर से macroscopic पैमाने पर जटिल संगठन है, जो सबसे उंनत विनिर्माण तिथि करने के लिए विकसित तकनीकों के साथ भी प्राप्त करने के लिए मुश्किल है शामिल हैं । संयंत्र के ऊतकों के जटिल पदानुक्रमित डिजाइन उंहें अपने घटक के योग से मजबूत बनाता है26। पौधे ऐसे उपजी के रूप में कठोर और कठिन घटकों से लेकर विभिंन यांत्रिक गुणों के ढेर सारे अधिकारी, इस तरह के रूप में27पत्तियों के रूप में बहुत अधिक लचीला और लचीला वाले । पत्तियां आकार, आकार, तोड़ शक्ति, vascularization की डिग्री के मामले में प्रजातियों के आधार पर बदलती हैं, और hydrophilicity के विभिंन डिग्री ले सकते हैं । कुल मिलाकर, इन पौधों के गुणों का सुझाव है कि सेलुलर संयंत्रों अद्वितीय और उच्च कार्यात्मक ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ के रूप में सहित चिकित्सा उपकरणों, के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
इस प्रोटोकॉल ऊतक इंजीनियरिंग में पाड़ के रूप में उपयोग के लिए, इस तरह के पत्ते और उपजी के रूप में संयंत्र के ऊतकों decellularize करने के लिए दो तरीकों पर केंद्रित है । पहली विधि एक डिटर्जेंट आधारित तकनीक है कि स्नान की एक श्रृंखला का उपयोग करता है के लिए डीएनए और सेलुलर बात है, जो एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक से अनुकूलित किया गया है decellularize स्तनधारी और संयंत्र के ऊतकों को दूर है6,22,25 ,28,29,30. दूसरी विधि डिटर्जेंट मुक्त है और एक "skeletonization" आमतौर पर पत्तियों के कोमल ऊतकों को हटाने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल से अनुकूलित है31। पहले काम से पता चला है कि एक ब्लीच और सोडियम बिकारबोनिट समाधान में उबाल पत्तियों आसपास के नरम ऊतक से vasculature की जुदाई की सुविधा31। इस तकनीक को वापस उद्धृत किया जा सकता है प्रयोग 17वें और 18वीं शताब्दियों में किए गए, ऐसे Albertus सबा३२ और एडवर्ड Parrish३३के काम के रूप में । इन प्रयोगों के पत्ते और फल, समय की विस्तारित अवधि के लिए पानी में डूबे के रूप में संयंत्र बात छोड़ने के आसपास केंद्रित है, (सप्ताह के महीनों के लिए) और नरम ऊतकों दूर स्वाभाविक रूप से क्षय की अनुमति । यहाँ "skeletonization" दृष्टिकोण कम तापमान पर अब गर्मी के समय के रूप में मामूली शर्तों, का उपयोग करने के लिए अनुकूलित है, सेलुलर अवशेषों को हटाने के लिए और काफी नरम ऊतक संरचना को बाधित करने से बचने के लिए. इस के साथ साथ विस्तृत प्रयोगों के लिए, तीन संयंत्र प्रकार का उपयोग किया गया: फाइकस hispida, पचीरा एक्वाटिका और Garciniaकी एक प्रजाति. डीएनए ठहराव, यांत्रिक परीक्षण के परिणाम, और दोनों तरीकों से सेलुलर चयापचय गतिविधि पर प्रभाव वर्णित हैं ।
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Protocol
1. Decellularization संयंत्र ऊतक के डिटर्जेंट आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर
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ताजा या जमे हुए एफ hispida, पत्ती के नमूनों का प्रयोग करें । एक-20 ° c फ्रीजर और भविष्य में उपयोग के लिए स्टोर में अप्रयुक्त ताजा नमूनों फ्रीज (एक वर्ष तक) ।
नोट: लगभग किसी भी वांछित संयंत्र के स्टेम या पत्ती ऊतक का उपयोग करें । विस्तारित भंडारण बार ऊतकों को नुकसान हो सकता है ।- नमूना का इरादा उपयोग के आधार पर संसाधित किया जा करने के लिए नमूनों के आकार और आकार का निर्धारण (यानी स्ट्रिप्स में कटौती नमूनों यांत्रिक परीक्षण अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं, इस बीच 8 मिमी डिस्क नमूने बहु-अच्छी तरह से संवर्धन अनुप्रयोगों में उपयोगी होते हैं ). कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) के तहत जलमग्न जबकि एक तेज, स्वच्छ बायोप्सी पंच के साथ 8 मिमी डिस्क में पत्ती कट.2O.
नोट: इस प्रोटोकॉल पूरी पत्तियों और उपजी पर इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, छोटे नमूनों में तेजी से decellularize होगा । - कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए नमूनों की मशीन (20-25 ° c) एक शेक प्लेट को धोने और/या उन्हें गल करने के लिए एक कम गति स्थापित करने के लिए सेट पर एच2हे । सभी नमूनों को अच्छी तरह से गीला कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त2O H का उपयोग करें ।
- नमूना का इरादा उपयोग के आधार पर संसाधित किया जा करने के लिए नमूनों के आकार और आकार का निर्धारण (यानी स्ट्रिप्स में कटौती नमूनों यांत्रिक परीक्षण अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं, इस बीच 8 मिमी डिस्क नमूने बहु-अच्छी तरह से संवर्धन अनुप्रयोगों में उपयोगी होते हैं ). कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) के तहत जलमग्न जबकि एक तेज, स्वच्छ बायोप्सी पंच के साथ 8 मिमी डिस्क में पत्ती कट.2O.
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10% (डब्ल्यू/v) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) में एक समाधान तैयार करें ज2O । नमूनों को एक उपयुक्त कंटेनर में रखें (एक गिलास या प्लास्टिक डिश आदर्श है) और नमूने को पूरी तरह कवर करने के लिए एसडीएस समाधान जोड़ें । नमूनों को नुकसान को रोकने के लिए एक कम गति के लिए सेट एक शेक प्लेट पर कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर 5 दिनों के लिए नमूनों की मशीन ।
नोट: यह नीचे decellularization प्रक्रिया को धीमा कर सकते है और एसडीएस द्वारा असमान उपचार के लिए नेतृत्व के रूप में कंटेनर भीड़ नहीं है । इस चरण के दौरान, नमूनों में भूरे रंग का हल्ला मोल होना चाहिए ।- 5 दिनों के बाद, एसडीएस के साथ समाधान बदलें H2O । शेक प्लेट पर एक अतिरिक्त 10-15 मिनट के लिए नमूनों को अच्छी तरह से किसी भी अवशिष्ट एसडीएस समाधान से कुल्ला करने के लिए ।
- एक 1% (v/v) गैर ईओण surfactant 10% (v/v) ब्लीच समाधान में तैयार करें । बनाने के लिए एक ५०० मिलीलीटर समाधान, मिश्रण गैर के 5 मिलीलीटर-ईओण surfactant ब्लीच की ५० मिलीलीटर के साथ तो के ४४५ मिलीलीटर में जोड़ने के लिए एच2O. जलमग्न नमूनों में हौसले से तैयार समाधान ।
नोट: गैर ईओण surfactant/ब्लीच समाधान एक लंबी शैल्फ जीवन नहीं है, इसलिए, तैयारी के ४८ ज के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए । -
गैर ईओण surfactant/ब्लीच समाधान हर 24 एच बदलें जब तक नमूनों को पूरी तरह से मंजूरी दे दी है (दृश्य तुलना के लिए चित्र 1a को देखें) । तो 2 मिनट के लिए एक शेक प्लेट पर पानी में नमूने की मशीन बंद कुल्ला अतिरिक्त गैर ईओण surfactant/ब्लीच समाधान । एक कम सेटिंग के लिए शेक प्लेट सेट करने के लिए नमूने हानिकारक को रोकने के ।
नोट: उपयोग किए गए नमूनों को साफ़ करने के लिए आवश्यक समय, पौधे के प्रकार और प्रजातियों के आधार पर भिन्न होता है. नमूनों की पूरी फीका करना पूर्ण decellularization का संकेत है (पूरी तरह से समाशोधन सुनिश्चित करने के लिए डीएनए ठहराव प्रदर्शन) ।- Lyophilize नमूने एक साल के लिए उंहें स्टोर करने के लिए (फ्लैश ठंड तरल नाइट्रोजन का उपयोग करना पसंद है, ठंड नमूनों में-८० डिग्री सेल्सियस भी स्वीकार्य है) और उंहें कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) कम नमी में स्टोर ।
- Tris-HCl में नमूनों का पुनर्गठन (10 मिमी, पीएच ८.५) कोट नमूनों के लिए पर्याप्त का उपयोग कर । नमूने कुल्ला सीरम में 2-3 बार-मुक्त मीडिया धीरे उपयोग करने से पहले एक micropipette का उपयोग (यानी कुल्ला प्रति 150-300 µ एल उपयोग करते हैं, एक मानक 24 अच्छी तरह से थाली में) ।
नोट: Tris-एचसीएल बफर और सीरम मुक्त मीडिया (यानी DMEM, लेकिन किसी भी मूल कोशिका संस्कृति मीडिया प्रतिस्थापित किया जा सकता है) के साथ इलाज के नमूनों की कोशिका व्यवहार्यता के प्रभाव को कम करने में अधिक प्रभावी रहे हैं एसडीएस के साथ उपचारित ज2अकेले हे ।
2. डिटर्जेंट मुक्त Decellularization दृष्टिकोण का उपयोग कर नमूनों की तैयारी
नोट: इस प्रक्रिया के प्रारंभिक चरणों 1.1-1.1.2 कदम के साथ मेल (ऊपर देखें) ।
- 5% (v/v) ब्लीच (NaClO) और 3% (w/v) सोडियम बिकारबोनिट (NaHCO3) समाधान तैयार करें । एक धुएं डाकू में समाधान गर्म करने के लिए 60-70 ° c F. hispida पत्ती के नमूनों के लिए 8 मिमी डिस्क में कटौती करते हुए एक गर्म थाली पर सरगर्मी ।
नोट: सोडियम बिकारबोनिट सोडियम कार्बोनेट (ना2CO3), या सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है । वांछित तापमान बहुत बदलता है (कमरे के तापमान से ९० डिग्री सेल्सियस) और इस्तेमाल किया नमूनों के गुणों के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए. - एक बार समाधान वांछित तापमान सीमा तक पहुँच जाता है, नमूने जलमग्न और उन्हें हानिकारक से बचने के लिए सरगर्मी गति को कम. नमूने के बाद साफ दिख रहे हैं (दृश्य तुलना के लिए चित्र 1b को देखें), स्नान सावधानी से निकालें. अतिरिक्त ब्लीच समाधान को दूर करने के लिए 1-2 मिनट के लिए एक बार
नोट: नमूनों को साफ़ करने के लिए आवश्यक समय व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं. उदाहरण के लिए, काट अजमोद 10-15 मिनट में साफ किया जा सकता है, जबकि मोटा और/या पूरी पत्तियों या उपजी के रूप में बड़े नमूने उच्च तापमान स्नान में घंटे लेने के लिए पूरी तरह से स्पष्ट कर सकते हैं । - Lyophilize के नमूनों को कम आर्द्रता में कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर संग्रहीत करें ।
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Representative Results
दोनों तरीकों पाड़ कि सेल संस्कृति और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त थे झुकेंगे । चित्रा 1 decellularization प्रक्रिया के सामान्य कार्यप्रवाह डिटर्जेंट-आधारित विधि के लिए एक बरकरार पत्ती का उपयोग कर दिखाता है और डिटर्जेंट मुक्त विधि के लिए नमूनों (8 मिमी व्यास) में कटौती. दोनों तरीकों के बाद फाइकस hispida ऊतकों के सफल decellularization स्पष्ट और बरकरार नमूनों (आंकड़ा 1a और 1b) झुकेंगे । यह पूरे संयंत्र के ऊतकों decellularize करने के लिए संभव था (चित्र 1a); हालांकि, छोटे नमूनों को तेजी से और अधिक प्रभावी ढंग से स्पष्ट दिखाई दिया । एक संभावित मुद्दे के साथ मनाया डिटर्जेंट आधारित दृष्टिकोण गैर से समयपूर्व हटाने का एक परिणाम के रूप में विषम decellularization-ईओण surfactant स्नान (चित्रा 1C) शामिल हैं । डिटर्जेंट मुक्त विधि की एक खामी है कि नुकसान गर्म स्नान में लंबे समय तक गर्मी (चित्र 1 d) के कारण हो सकता है ।
दोनों तरीकों का उपयोग कर तैयार किया गया था के यांत्रिक गुणों के uniaxial तन्यता परीक्षण के रूप में अन्य अध्ययन24,३४में किया गया था का उपयोग कर जांच की गई. इस परीक्षण से अधिकतम स्पर्श मापांक (एमटीएम) (चित्र 2a), दबाव में विफलता (SAF) (चित्र2), और F. hispida के लिए अंतिम तन्य शक्ति (यूटीएस) (चित्र 2c) और पचीरा एक्वाटिका नमूनों की पैदावार हुई । दोनों decellularization प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार किए गए एक्वाटिका नमूने मापा मापदंडों के सभी तीन भर में समान यांत्रिक गुणों को प्रदर्शित किया. एफ hispida के नमूनों ने यूटीएस परीक्षण को छोड़कर सभी मामलों में इसी तरह की प्रवृत्ति दिखाई । विशेष रूप से, डिटर्जेंट आधारित (एसडीएस) प्रोटोकॉल का उपयोग तैयार नमूनों डिटर्जेंट मुक्त (ब्लीच) दृष्टिकोण के साथ तैयार उन लोगों की तुलना में अधिक औसत यूटीएस परिणाम था । इन परिणामों से पता चलता है कि नमूनों के विभिंन प्रजातियों के पौधों से एकत्र अलग विपाड़े मचान जब दो decellularization प्रोटोकॉल के माध्यम से तैयार संपत्तियों का उत्पादन हो सकता है ।
डीएनए हटाने के उपाय करने के लिए, नमूने या तो विधि का उपयोग कर मंजूरी दे दी गई और उनके जीनोमिक डीएनए एक पहले से स्थापित प्रोटोकॉल३५का उपयोग अलग था । दोनों decellularization तरीकों (डिटर्जेंट आधारित और डिटर्जेंट मुक्त) काफी जीनोमिक डीएनए सामग्री के नमूनों की कमी हुई २.४७ डीएनए के एनजी/mg (n = 3, s = ०.१८) और २.७१ डीएनए के एनजी/मिलीग्राम (n = 3, एस = १.६०) क्रमशः (चित्रा 2d)) । गैर-सेलुलर नमूने था १०४.६७ डीएनए के एनजी/ऊतक (n = 3, s = २६.२१) (चित्रा 2d) के/ डीएनए सामग्री में पर्याप्त कमी के बाद decellularization संयंत्र सेल मामले की एक प्रभावी हटाने का संकेत दिया ।
दो decellularization तरीकों की कोशिका व्यवहार्यता पर प्रभाव मानव चमड़े का fibroblasts (hDF) के चयापचय गतिविधि को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था 2 दिनों के लिए प्रसंस्कृत पी एक्वाटिका या Garcinia पाड़ों की उपस्थिति में । hDFs उच्च चयापचय गतिविधि था जब मचान की उपस्थिति में प्रसंस्कृत डिटर्जेंट के माध्यम से मुक्त विधि बनाम डिटर्जेंट के माध्यम से तैयार उन-विधि (चित्रा 3ए) आधारित है । decellularization, प्रयोगों का एक अतिरिक्त सेट के दौरान इस्तेमाल किया एजेंट की पूरी तरह से हटाने को सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन किया जिसमें तैयार पाड़ों बड़े पैमाने पर सेल संस्कृति से पहले धोया गया था । दो अलग धोने तरीकों डिटर्जेंट आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर तैयार नमूनों पर परीक्षण किया गया: Tris-एचसीएल बफर (10 मिमी, पीएच ८.५) में एक धोने के द्वारा पीछा किया सीरम नि: शुल्क मीडिया बनाम में एक धोने के बाद 2 में धोया एच2ओ । दोनों दृष्टिकोण 1x पंजाबियों के साथ अंतिम धुलाई कदम का इस्तेमाल किया । स्तनधारी कोशिकाओं को प्रभाव बाद में सेलुलर संयंत्र पाड़ों को उजागर के रूप में ऊपर के रूप में ही चयापचय गतिविधि परख का उपयोग कर मापा गया था । Tris-HCl बफर (10 मिमी, पीएच ८.५) सीरम नि: शुल्क मीडिया के द्वारा पीछा किया सेलुलर चयापचय गतिविधि पर प्रभाव को कम करने के साथ की तुलना में एच2हे, डिटर्जेंट के साथ इलाज के नमूनों के आधार दृष्टिकोण बनाने से डिटर्जेंट से नमूनों के लिए तुलनीय-मुक्त विधि (चित्र बी) ।
यह पहले दिखाया गया है कि स्तनधारी कोशिकाओं मचान पर डिटर्जेंट-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर तैयार हो जाना25; इसलिए, यह पहले untested डिटर्जेंट मुक्त विधि द्वारा तैयार नमूनों पर इस प्रदर्शन के लिए आवश्यक था । Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) सुपाड़ा प्रति २०,००० कोशिकाओं पर और 24 एच के लिए गर्मी की अनुमति दी एफ hispida पत्ती के नमूनों (8 मिमी डिस्क) पर वरीयता प्राप्त किया गया । इन पाड़ों एक RGD-डोपामाइन संयुग्मी पालन की सुविधा के साथ सेल परिचय से पहले कार्यात्मक थे । चित्रा 4 एक ठेठ नमूना से एकत्र छवियों को दिखाता है. एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि के लिए नमूने का इस्तेमाल किया (चित्रा 4a) के एक वर्ग की समग्र संरचना को दिखाने के लिए एकत्र किया गया था । MSCs calcein का उपयोग कर दाग रहे थे और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चित्रा 4B) के साथ imaged । इसके बाद पत्तियों की सतह पर बढ़ते हुए कोशिकाओं के स्थान को प्रदर्शित करने के लिए चित्र (चित्र 4c) मढ़ा गया.
चित्र 1 . पौधों के ऊतकों के decellularization के लिए सामान्य कार्यप्रवाह । संयंत्र के ऊतकों के decellularization के लिए विशिष्ट कार्यप्रवाह (धुलाई और प्रारंभिक कदम सार्वभौमिक हैं); (A) शीर्ष पथ डिटर्जेंट-मुक्त विधि के लिए डिटर्जेंट-आधारित विधि (B) नीचे के लिए है । (ग) गैर-ईओण surfactant/ब्लीच बाथ (D) के एक क्षतिग्रस्त decellularization के कारण डिटर्जेंट-आधारित विधि का उपयोग करते हुए एक एक्वाटिका पत्ती का एक अपूर्ण/decellularization का प्रयोग एक एफ hispida लीफ डिटर्जेंट मुक्त विधि में गरम ब्लीच समाधान में लंबे समय तक गर्मी के कारण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . यांत्रिक गुणों और विधियों के बीच decellularization की प्रभावशीलता की तुलना. ± एसडी मतलब; सांख्यिकीय विश्लेषण दो-नमूना t-परीक्षण और p मान सूचीबद्ध है जहां सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण (०.०५ से कम या बराबर) का उपयोग कर किया गया था । एफ hispida और पी एक्वाटिका के नमूनों के बीच यांत्रिक परीक्षण के परिणामों की तुलना (नीली सलाखों के डिटर्जेंट-आधारित दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया, डिटर्जेंट मुक्त करने के लिए लाल, और अनुपचारित नमूनों के लिए हरी) (F. hispida डिटर्जेंट-आधारित n = 4, डिटर्जेंट-मुक्त n = 2; P. एक्वाटिका डिटर्जेंट-बेस n = 3, डिटर्जेंट-मुक्त n = 4) (A) अधिकतम स्पर्श मापांक (एमटीएम) (B) विफलता पर तनाव (SAF) (C) और अंतिम तन्यता ताकत (यूटीएस). (घ) एक dsDNA ठहराव परख प्रत्येक समूह से तीन नमूनों पर तपसिल में चलाया गया था: अनुपचारित (ताजा, एन = 3), डिटर्जेंट-मुक्त विधि (ब्लीच, एन = 3) और डिटर्जेंट-आधारित विधि (एसडीएस, एन = 3), पी मूल्यों decellularization विधि के लिए कर रहे है अनुपचारित नमूना समूह की तुलना में समूह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 . चयापचय गतिविधि परख दो decellularization तरीकों के बीच प्रभाव की तुलना परिणाम । ± एसडी मतलब; सांख्यिकीय विश्लेषण दो-नमूना t-परीक्षण और p मानों का उपयोग कर किया गया था जहां सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण (०.०५ से कम या बराबर) सूचीबद्ध होता है । सेलुलर चयापचय गतिविधि दोनों पी एक्वाटिका और Garcinia की एक प्रजाति के ऊतक के नमूनों की उपस्थिति में मापा गया था (बिना किसी नमूने के साथ कुओं को नियंत्रित करने के लिए सामान्यीकृत) एक प्रदर्शित करने के लिए (एक) दो के चयापचय प्रभाव की तुलना decellularization तरीके (n = 3 प्रत्येक समूह के लिए) और (B) के प्रभाव की तुलना चयापचय गतिविधि में दो वाशिंग तरीकों का उपयोग कर डिटर्जेंट आधारित प्रोटोकॉल: Tris-HCl बफर (10 मिमी, पीएच ८.५) सीरम नि: शुल्क मीडिया के साथ संयुक्त (n = 4) बनाम । 2 O (n = 4). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) एक RGD-डोपामाइन संयुग्मी के साथ कार्यात्मक, सेलुलर फाइकस hispida पत्ती की सतह पर बढ़ रहा है । MSCs F. hispida पत्तियों पर बड़े हो गए थे, डिटर्जेंट मुक्त विधि द्वारा प्रतिक्रियाशील और एक RGD के साथ कार्यात्मक-डोपामाइन संयुग्मी (५०० µm स्केल सलाखों के संदर्भ के लिए जोड़ा गया था) (एक) के एक खंड के उज्ज्वल क्षेत्र छवि सेलुलर पत्ता (बी ) calcein दाग MSCs की प्रतिदीप्ति छवि पत्ती की सतह (ग) पर बढ़ उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति छवि विलय कर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस के साथ साथ, संयंत्र के ऊतकों को decellularize करने के दो तरीके बताए गए हैं । यहां प्रस्तुत परिणाम, पहले अध्ययन के परिणामों के साथ युग्मित25, सुझाव है कि आगे डाल प्रोटोकॉल प्रजातियों में से एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए लागू होने की संभावना है और दोनों उपजी और पत्तियों पर प्रदर्शन किया जा सकता है । इन प्रक्रियाओं सरल कर रहे हैं और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, तो संयंत्र decellularization सबसे प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है । यह उल्लेखनीय है कि decellularization के बाद, पाड़ों स्तनधारी सेल आसंजन की सुविधा के लिए कार्यात्मक होना चाहिए । अलग functionalization तकनीक स्तनधारी कोशिका आसंजन और संयंत्र के ऊतकों पर विकास को सक्षम करने के लिए कहीं और वर्णित किया गया है25 और वर्तमान पांडुलिपि का विषय नहीं हैं ।
दोनों decellularization प्रोटोकॉल में अंतिम चरण यहां प्रस्तुत (चित्रा 1) उनकी सफलता के लिए महत्वपूर्ण था । जब या तो विधि प्रदर्शन नहीं भीड़ स्नान के रूप में यह एक असमान समाशोधन में परिणाम होगा । इन तरीकों को पूरे पत्ते और उपजी के लिए लागू किया जा सकता है; हालांकि, यह उंहें स्पष्ट करने के लिए आवश्यक समय की लंबाई में वृद्धि होगी । सुनिश्चित करें कि नमूने पूरी तरह से पूरे नमूने के दौरान समाशोधन लगातार रखने के लिए जलमग्न हो जाते हैं । आदर्श रूप में, decellularization सबसे सेलुलर बात के संयंत्र के ऊतकों को स्पष्ट करना चाहिए, जबकि संरचनात्मक क्षति को कम करने । यह संभावना है कि डिटर्जेंट मुक्त विधि संशोधित किया जा सकता है के रूप में वांछित नमूनों के साथ काम करने की जरूरत है । उच्च स्नान तापमान तेजी से समाशोधन समय में परिणाम हो सकता है, लेकिन यह भी नमूनों को अधिक नुकसान में परिणाम अगर वे खत्म हो सकता है-मशीन । कम तापमान लंबे समय तक गर्मी की आवश्यकता हो सकती है और अधिक नाजुक नमूनों के लिए उपयुक्त होगा । decellularization प्रक्रिया में तेजी लाने या धीमा करने के लिए समाधान में ब्लीच की एकाग्रता को भी बदला जा सकता है. जब डिटर्जेंट मुक्त विधि के साथ प्रयोग के लिए नए नमूनों का परीक्षण, यह decellularization की प्रगति पर लगातार जांच के साथ 50-60 ° c के स्नान तापमान के साथ शुरू करने की सिफारिश की है (आदर्श हर 15-20 मिनट) जब तक वे पर्याप्त रूप से मंजूरी दे दी है । इस तापमान रेंज अच्छी तरह से संयंत्र प्रजातियों कि तकनीक के अनुकूलन के दौरान परीक्षण किया गया था की सबसे द्वारा सहन किया गया था । पूरा होने पर, नमूनों का निरीक्षण किया जा सकता है नेत्रहीन और मैंयुअल रूप से सुनिश्चित करने के लिए वे खत्म नहीं किया गया है और मशीन क्षतिग्रस्त irreparably के रूप में स्नान से हटाने पर फाड़ या विघटन से संकेत दिया जाएगा । इस दृष्टिकोण का उपयोग कर तैयार किए गए नमूने सेल वृद्धि पर एक कम प्रभाव दिखाने के लिए ( 3 चित्राको देखें) डिटर्जेंट से आधारित दृष्टिकोण केवल में धोने के साथ हालांकि, यह Tris-एचसीएल (10 मिमी, पीएच ८.५) और विशेष रूप से संवेदनशील अनुप्रयोगों में सीरम मुक्त मीडिया के साथ साथ धोने के लिए सिफारिश की है ।
डिटर्जेंट आधारित (एसडीएस) विधि की संभावना सबसे संयंत्र प्रजातियों के लिए लागू है और पूरी पत्ती और नाजुक नमूनों समाशोधन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि यह ंयूनतम शारीरिक आंदोलन की आवश्यकता है । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, अंतिम चरण नमूनों की decellularization के लिए महत्वपूर्ण है । अलग भौतिक संपत्तियों के साथ नमूनों गैर ईओण surfactant स्नान में मशीन समय का समायोजन करके मंजूरी दे दी जा सकती है । इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण दोष यह है कि सेलुलर ऊतकों का इस्तेमाल किया डिटर्जेंट के निशान शामिल हो सकते हैं, जो बाद में स्तनधारी कोशिकाओं के सेलुलर चयापचय गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए, उपयोग करने से पहले गहन वाश चरण अनुशंसित हैं । यहाँ यह पाया गया कि नमूनों Tris-एचसीएल बफर (10 मिमी, पीएच ८.५) के साथ धोया सीरम मुक्त मीडिया के बाद उनके उपयोग से पहले2से धोया ज से उन लोगों की तुलना में उच्च कोशिका व्यवहार्यता था (आंकड़ा 3 बी).
जब या तो विधि में भविष्य के उपयोग के लिए अनुपचारित नमूनों भंडारण, यह उंहें नुकसान के लिए निगरानी करने के लिए सुनिश्चित करें कि जिसके परिणामस्वरूप पाड़ प्रभावित नहीं होगा महत्वपूर्ण है । नुकसान संयंत्र के ऊतकों के रंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से खुर या अत्यधिक भंगुरता जब संभाला के रूप में प्रकट कर सकते हैं । यह एक साप्ताहिक आधार पर नमूनों पर नजर रखने की सिफारिश की है ताकि उन्हें उपयोग करने से पहले वे अब उपयोगी होते हैं और के निपटान की जरूरत है । नुकसान की शुरुआत नमूना प्रकार के बीच बदलता है, मोटा अधिक मजबूत लंबे समय तक टिकाऊ नमूनों के साथ ।
सामांय में, पौधों को एक संभावित स्रोत के रूप में अधिक से अधिक वादा करता है । यह उनके स्वाभाविक रूप से विकसित जटिल संरचनाओं और विशेषताओं है कि मदद से उन्हें अपने पैतृक वातावरण में बढ़ने से मजबूत है । ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ों के रूप में संयंत्र के ऊतकों का सफल उपयोग महंगा करने के लिए एक संभावित सस्ते विकल्प का प्रस्ताव है, और अक्सर डिजाइन करने के लिए मुश्किल है, । संयंत्र के ऊतकों की सतह स्थलाकृति, जो स्वाभाविक एक प्रजाति से दूसरे में बदलता है, को भी विशेष रूप से उंमुख सेलुलर विकास25प्रत्यक्ष दोहन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि मानव कोशिकाओं को25विस्थलाकृतिक पौधों पर मौजूद cues का जवाब है, इस प्रकार इन पाड़ों अत्यधिक संगठित पैटर्न25में संस्कृति कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक और विशेषता है कि ऊतक इंजीनियरिंग में वांछनीय है de नोवो perfusability है । संयंत्र के ऊतकों को लाखों साल के सैकड़ों से अधिक विकसित किया है द्रव परिवहन में अत्यंत कुशल हो, और उनके संवहनी नेटवर्क कुशलतापूर्वक24perfused जा सकता है । इस संपत्ति संभवतः नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए प्रतिस्थापन ऊतक बनाने के अंतिम लक्ष्य के साथ सेलुलर प्रवास और angiogenesis गाइड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह पिछले अध्ययनों कि प्रदर्शन किया है कि उच्च सतह क्षेत्र और परस्पर porosity के साथ भौतिक कोशिका प्रसार के लिए अनुकूल है और जब vivo मेंप्रत्यारोपित, मेजबान कोशिकाओं के आवक माइग्रेशन सक्षम के निष्कर्षों से मजबूत है प्रत्यारोपण में३६,३७,३८,३९. उच्च सतह क्षेत्र और परस्पर porosity भी संयंत्र के ऊतकों की पहचान कर रहे हैं४०,४१,४२, इस प्रकार संयंत्र प्राप्त पाड़ आसपास के ऊतकों के साथ एकीकृत करने के लिए संभावित है vivo में। इसके अलावा, हाल ही में अध्ययन में पाया गया कि सेलुलर पत्ते सफलतापूर्वक कोशिकाओं के साथ perfused जा सकता है24 और है कि जब मानव कोशिकाओं को विरूपण संयंत्र के ऊतकों पर वरीयता प्राप्त थे, वे उनके स्थलाकृतिक cues25के अनुरूप । जब सभी एक साथ ले लिया, संयंत्र के मचान आवश्यक गुण के अधिकारी को सफलतापूर्वक ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की ओर लागू किया जाएगा ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम कृपा से इस परियोजना में प्रयुक्त नमूनों की आपूर्ति के लिए Olbrich गार्डन के जॉन Wirth शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े, और रक्त संस्थान (R01HL115282 G.R.G.) द्वारा भाग में समर्थित है नेशनल साइंस फाउंडेशन (DGE1144804 से जे. आर. जी और G.R.G.), और यूनिवर्सिटी ऑफ विस्कॉंसिन सर्जरी एंड भूतपूर्व छात्र कोष (H.D.L.) । यह काम भी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (स्टार ग्रांट no. ८३५७३७०१), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R01HL093282-01A1 और UH3TR000506), और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IGERT DGE1144804) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Life Science | 75746-1KG | |
| Triton X-100 | MP Biomedicals, LLC | 807426 | Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up. |
| Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) | Clorox | Item #: 31009 | Standard concentrated bleach. |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 217120010 | Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate. |
| 8 mm Biopunch | HealthLink | 15111-80 | Cuts samples that fit well in 24 well plate |
| Belly Dancer-Shake table | Stovall Life Sciences | BDRAA115S | Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table. |
| Isotemp hot/stir plate | Fisher Scientific | Can use any style/brand of hot/stir plate. | |
| Beaker | Any | Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them. | |
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| DMEM | Corning | MT50003PC | |
| Quant-iT Picogreen dsDNA assay | Life Technologies | P11496 | Can use any dsDNA quantification mehtod on hand. |
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