Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Due metodi per decellularizzazione di tessuti vegetali per applicazioni di ingegneria del tessuto

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57586
Automatic Translation
1, 2, 4, 4, 1, 2,3
1Department of Surgery, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin College of Engineering, 4Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Qui vi presentiamo, e contrasto due protocolli utilizzati per decellularize tessuti vegetali: un approccio basato su detergente e un approccio privo di detersivo. Entrambi i metodi si lasciano alle spalle la matrice extracellulare dei tessuti vegetali utilizzati, che quindi può essere utilizzata come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.

Abstract

Gli innesti autologhi, sintetici e derivati animali attualmente utilizzati come scaffold per la sostituzione del tessuto hanno limitazioni a causa della scarsa disponibilità, scarsa biocompatibilità e costo. Tessuti vegetali hanno caratteristiche favorevoli che li rendono particolarmente adatti per utilizzare come scaffold, quali elevata area superficiale, trasporto d'acqua eccellente e ritenzione, porosità interconnesse, preesistenti reti vascolari e una vasta gamma di meccanica Proprietà. Due metodi di successo di decellularizzazione pianta per applicazioni di ingegneria del tessuto sono descritti qui. Il primo metodo si basa sui bagni detergenti per rimuovere la materia cellulare, che è simile ai metodi stabiliti in precedenza utilizzati per cancellare tessuti di mammiferi. Il secondo è un metodo privo di detersivo, adattato da un protocollo che isola il sistema vascolare foglia e prevede l'utilizzo di una candeggina riscaldata e il bagno di sale per eliminare le foglie e steli. Entrambi i metodi portano a impalcature con proprietà meccaniche comparabili e basso impatto metabolico cellulare, permettendo così all'utente di selezionare il protocollo che meglio si adatta alle loro applicazione prevista.

Introduction

Ingegneria tissutale è emerso nel 1980 per creare tessuto vivente sostituti e, potenzialmente, indirizzo significativo dell'organo e del tessuto carenze1. Una strategia è utilizzato Ponteggi per stimolare e guidare il corpo per rigenerare tessuti o organi mancante. Anche se avanzato fabbricazione approcci quali stampa 3-d hanno prodotto ponteggi con proprietà fisiche uniche, la capacità di produrre impalcature con una vasta gamma di proprietà fisiche e biologiche realizzabili rimane una sfida2 , 3. Inoltre, a causa di una mancanza di una rete vascolare funzionale, queste tecniche sono state limitate a rigenerare tessuti 3-dimensionale. L'uso di decellularizzazione tessuti animali ed umani come scaffold ha aiutato a eludere questo problema4,5,6,7. Tuttavia, costo elevato, lotto variabilità e disponibilità limitata può limitare l'uso molto diffuso di decellularizzazione animale ponteggi8. Ci sono inoltre preoccupazioni circa la potenziale trasmissione di malattie ai pazienti e reazione immunologica per alcuni tessuti di mammiferi decellularizzati9.

Cellulosa, derivata dalla pianta e fonti batteriche, è stato ampiamente utilizzato per generare biomateriali per una vasta gamma di applicazioni nella medicina rigenerativa. Alcuni esempi includono: osso10,11, cartilagine12,13,14 e15di guarigione della ferita. Impalcature che sono composti di cellulosa hanno un ulteriore vantaggio, in quanto sono durevoli e resistenti per essere ripartiti dalle cellule di mammiferi. Questo è dovuto al fatto che le cellule di mammiferi non producono gli enzimi necessari per abbattere le molecole di cellulosa. In confronto, scaffolds impiegando macromolecole della matrice extracellulare, come il collagene, sono prontamente ripartiti16 e potrebbero non essere idonei per applicazioni a lungo termine. Scaffold di collagene può essere stabilizzata tramite cross-linking chimico. Tuttavia, esiste un compromesso a causa della tossicità intrinseca dei linkers che influenzano la biocompatibilità delle impalcature17. Al contrario, cellulosa ha il potenziale per rimanere presenti presso il sito dell'impianto per periodi prolungati di tempo perché è impermeabile alla degradazione enzimatica di cellule di mammifero18,19,20. Questo può essere modificato regolando la velocità di degradazione attraverso il pretrattamento idrolisi e co-consegna di impalcature con cellulasi21. La biocompatibilità di cellulosa pianta-derivati decellularizzati impalcature in vivo è stata dimostrata anche in uno studio condotto su topi22.

Attraverso centinaia di milioni di anni di evoluzione, piante hanno perfezionato la loro struttura e composizione per aumentare l'efficienza di trasporto di fluidi e di ritenzione. Pianta vascolare vasi minimizza la resistenza idraulica di ramificazione in vasi più piccoli, simili al sistema vascolare dei mammiferi secondo legge23 di Murray. Dopo decellularizzazione, complessa rete dell'impianto di vasi e pori interconnessi è mantenuto. Considerando il vasto numero di specie di piante distinte prontamente disponibili, impalcature pianta-derivati hanno il potenziale per superare i limiti di progettazione attualmente interessano impalcature in tessuto ingegneria24,25. Per esempio, Modulevsky et al hanno dimostrato che l'angiogenesi e migrazione cellulare si è verificato quando apple decellularizzati tessuto è stato impiantato sottocute sul retro di un mouse22. Allo stesso modo, Gershlak et al ha mostrato che le cellule endoteliali possono essere coltivate all'interno del vasculature di decellularizzazione foglie24. In un esperimento separato, Gershlak et al sono stati anche in grado di mostrare che cardiomiociti potevano essere coltivati sulla superficie delle foglie e sono stati in grado di contrarre24.

Piante includono anche organizzazione complessa da cellulare alla scala macroscopica, che è difficile da raggiungere anche con le più avanzate tecniche di produzione sviluppate fino ad oggi. Il complesso disegno gerarchico dei tessuti vegetali li rende più forti rispetto alla somma dei loro costituenti26. Piante possiedono una pletora di diverse proprietà meccaniche che vanno dai componenti rigidi e duri come steli, a quelli molto più flessibile e duttile come foglie27. Foglie variano a seconda della specie in termini di dimensioni, forma, rompono la resistenza, il grado di vascolarizzazione e possono portare a diversi gradi di idrofilia. Nel complesso, queste proprietà pianta suggeriscono che piante decellularizzati possono servire come dispositivi medici unici e altamente funzionali, tra cui come impalcature di ingegneria tissutale.

Questo protocollo si concentra su due metodi per decellularize tessuti vegetali, come foglie e steli, per uso come impalcature in ingegneria tissutale. Il primo metodo è una detergente a base di tecnica che utilizza una serie di bagni per rimuovere il DNA e materia cellulare, che è stato adattato da una tecnica ampiamente utilizzata per decellularize dei mammiferi e vegetali tessuti6,22,25 ,28,29,30. Il secondo metodo è privo di detersivo ed è adattato da un protocollo di "scheletrizzazione" generalmente utilizzato per rimuovere i tessuti molli delle foglie31. Lavoro precedente ha mostrato che simmering foglie in una soluzione di candeggina e bicarbonato di sodio ha facilitato la separazione del vasculature dai tessuti molli circostanti31. Questa tecnica può essere citata torna a esperimenti svolti in 17th e 18 secoli delth , come il lavoro di Albertus Seba32 ed Edward Parrish33. Questi esperimenti centrati intorno lasciando la materia vegetale, come foglie e frutta, immersa nell'acqua per lunghi periodi di tempo (settimane o mesi) e permettendo i tessuti più morbidi a distanza decadere naturalmente. Qui l'approccio di "scheletrizzazione" è adattato per utilizzare condizioni più miti, come ad esempio i tempi di incubazione più lunghi a temperature più basse, per rimuovere i residui cellulari e per evitare di alterare significativamente la struttura dei tessuti molli. Per gli esperimenti dettagliati nel presente documento, sono stati utilizzati tre tipi di pianta: Ficus hispida, Pachira aquatica e una specie di Garcinia. Risultati di quantificazione del DNA, prove meccaniche e impatto sull'attività metabolica cellulare da entrambi i metodi sono descritti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. decellularizzazione di tessuto vegetale utilizzando l'approccio basato su detergente

  1. Utilizzare fresche o congelate F. hispida, campioni di foglia. Congelare i campioni freschi inutilizzati in un congelatore a-20 ° C e conservare per uso futuro (fino ad un anno).
    Nota: Uso di staminali o foglia di quasi qualsiasi impianto desiderato. Tempi di conservazione prolungati possono causare danni ai tessuti.
    1. Determinare la dimensione e la forma dei campioni da elaborare sulla base della destinazione d'uso del campione (cioè campioni tagliati a strisce sono adatti per applicazioni di test meccaniche, nel frattempo 8 mm disco campioni sono utili nelle applicazioni multi-pozzetto di coltura ). Tagliare la foglia in dischi di 8 mm con una biopsia nette pugno mentre sommersa sotto temperatura ambiente (20-25 ° C) deionizzata H2O.
      Nota: Questo protocollo può essere usato su steli e foglie intere. Tuttavia, i campioni più piccoli saranno decellularize più velocemente.
    2. Incubare i campioni per 5-10 min a temperatura ambiente (20-25 ° C) deionizzata H2O su un frullato settato a un'impostazione bassa velocità per lavare e/o scioglierli. Utilizzare abbastanza deionizzata H2O affinché che tutti i campioni sono completamente bagnati.
  2. Preparare una soluzione di 10% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS) in deionizzata H2O. posto i campioni in un contenitore adatto (un vetro o plastica piatto è l'ideale) e aggiungere la soluzione di SDS per coprire completamente i campioni. Incubare i campioni per 5 giorni a temperatura ambiente (20-25 ° C) su un shake piastra insieme ad una bassa velocità per evitare di danneggiare i campioni.
    Nota: Non sovraffollamento del contenitore, poiché ciò può rallentare il processo di decellularizzazione e condurre al trattamento irregolare di SDS. Durante questo passaggio, campioni dovrebbero acquisire una tonalità marrone.
    1. Dopo 5 giorni, sostituire la soluzione di SDS con deionizzata H2O. Incubare i campioni per altri 10-15 min sulla piastra di agitare a risciacquare accuratamente qualsiasi soluzione residua di SDS.
  3. Preparare un tensioattivo non ionico di 1% (v/v) in soluzione di candeggina al 10% (v/v). Per fare una soluzione di 500 mL, mescolare 5 mL del tensioattivo non ionico con 50 mL di candeggina poi aggiungere 445 mL di deionizzata H2O. Submerge campioni in soluzione appena preparata.
    Nota: La soluzione di tensioattivo non ionico/candeggina non ha una lunga shelf life, pertanto, deve essere utilizzato entro 48 ore di preparazione.
  4. Sostituire la soluzione di tensioattivo non ionico/candeggina ogni 24 ore fino a quando i campioni sono completamente cancellati (vedere Figura 1A per un confronto visivo). Incubare il campione in acqua deionizzata su una zolla di agitare per 2 min per risciacquare la soluzione in eccesso tensioattivo non ionico/candeggina. Mettere la piastra di agitare a un'impostazione bassa per evitare di danneggiare i campioni.
    Nota: Il tempo necessario per cancellare i campioni utilizzati varia, a seconda del tipo e specie della pianta. La decolorazione completa dei campioni è indicativo di decellularizzazione completo (eseguire la quantificazione del DNA per garantire completa compensazione).
    1. Lyophilize i campioni per conservarli fino a un anno (congelamento con azoto liquido flash è comodo, congelare i campioni a-80 ° C è anche accettabile) e conservarle a temperatura ambiente (20-25 ° C) a bassa umidità.
    2. Ricostituire i campioni in Tris-HCl (10 mM, pH 8.5) utilizza abbastanza ai campioni di cappotto. Sciacquare i campioni 2 - 3 volte in media senza siero delicatamente con una micropipetta prima dell'uso (cioè uso 150-300 µ l per risciacquo, in una piastra ben 24 standard).
      Nota: Tampone Tris-HCl e terreni privi di siero (cioè DMEM, ma qualsiasi cellula fondamentale cultura media può essere sostituito) sono più efficaci nel ridurre l'impatto di attuabilità delle cellule di trattamento con SDS campioni rispetto a quelli trattati con deionizzata H2O da soli.

2. preparazione dei campioni utilizzando l'approccio di decellularizzazione senza detersivo

Nota: I primi passi di questa procedura coincidono con passaggi 1.1-1.1.2 (Vedi sopra).

  1. Preparare una soluzione di sodio bicarbonato (NaHCO3) di 3% (p/v) e candeggiante al 5% (v/v) (NaClO). Riscaldare la soluzione in una cappa a 60-70 ° C per i campioni di foglia F. hispida tagliato in dischi di 8 mm mentre si mescolano su un piatto caldo.
    Nota: Il bicarbonato di sodio può essere sostituito con carbonato di sodio (Na2CO3) o idrossido di sodio (NaOH). La temperatura varia notevolmente (da temperatura ambiente a 90 ° C) e deve essere regolata secondo le proprietà dei campioni utilizzati.
  2. Una volta che la soluzione non raggiunge la temperatura desiderata, immergere i campioni e ridurre la velocità di agitazione per evitare di danneggiarli. Dopo i campioni vengono visibilmente cancellati (vedere Figura 1B per un confronto visivo), rimuovere con cautela dal bagno. Incubare i campioni una volta nel deionizzata di H2O per 1-2 min rimuovere la soluzione di candeggina in eccesso.
    Nota: Il tempo necessario per cancellare i campioni possa variare ampiamente. Ad esempio, prezzemolo tagliato può essere cancellato in 10-15 minuti, mentre più spessi e/o più grandi campioni come intero foglie o steli possono richiedere ore nei bagni ad alta temperatura per cancellare completamente.
  3. Lyophilize i campioni e conservarle a temperatura ambiente (20-25 ° C) a bassa umidità.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Entrambi i metodi hanno reso impalcature adatte alla coltura cellulare e applicazioni di ingegneria tissutale. La figura 1 Mostra il flusso di lavoro generale del processo di decellularizzazione utilizzando una foglia intatta per il metodo basato su detergente e tagliati campioni (8 mm di diametro) per il metodo privo di detersivo. Successo decellularizzazione di Ficus hispida tessuti dopo entrambi i metodi hanno reso chiari e intatti campioni (Figura 1A e 1B). È stato possibile decellularize tessuti di pianta intera (Figura 1A); Tuttavia, i campioni più piccoli sembravano chiaro più velocemente e più efficacemente. Un potenziale problema osservato con l'approccio basato su detergente coinvolto decellularizzazione eterogenei a seguito della prematura rimozione dal bagno di tensioattivo non ionico (Figura 1). Un inconveniente del metodo privo di detersivo è che danni possono verificarsi a causa di incubazione prolungata nella vasca riscaldata (Figura 1).

Le proprietà meccaniche di decellularizzazione ponteggi preparati utilizzando entrambi i metodi sono state studiate usando la prova di trazione monoassiale come è stato fatto in altri studi24,34. Questa prova ha reso il massimo modulo tangente (MTM) (Figura 2A), ceppo al fallimento (SAF) (Figura 2B) e resistenza alla trazione (UTS) (Figura 2) per i campioni di F. hispida e Pachira aquatica . P. aquatica campioni preparati utilizzando entrambi i protocolli decellularizzazione visualizzato proprietà meccaniche simili in tutti e tre dei parametri misurati. I campioni di F. hispida hanno mostrato una tendenza simile in tutti i casi tranne il UTS test. In particolare, campioni preparati utilizzando il protocollo (SDS) detergente a base di ha avuto risultati di UTS medio superiore rispetto a quelli preparati con l'approccio (candeggina) privo di detersivo. Questi risultati dimostrano che i campioni raccolti da diverse specie di piante possono produrre proprietà distinte decellularizzati impalcatura quando preparato tramite i due protocolli di decellularizzazione.

Per misurare la rimozione del DNA, i campioni sono stati liquidati utilizzando dei metodi e loro il DNA di genomic è stato isolato mediante un protocollo precedentemente stabilito35. Entrambi i metodi decellularizzazione (detergente a base di e privo di detersivo) ha fatto diminuire significativamente il contenuto di DNA genomico di campioni da 2,47 ng di DNA/mg (n = 3, s = 0.18) e 2,71 ng di DNA/mg del tessuto (n = 3, s = 1.60) rispettivamente (Figura 2D). Campioni non-decellularized avevano 104.67 ng di DNA/mg del tessuto (n = 3, s = 26.21) (Figura 2D). Importa la sostanza diminuzione nel contenuto di DNA dopo decellularizzazione indicato un'efficace rimozione della cellula vegetale.

L'impatto sull'attuabilità delle cellule dei due metodi di decellularizzazione è stata valutata misurando l'attività metabolica dei fibroblasti cutanei umani (hDF) coltivati per 2 giorni in presenza di decellularizzazione p. aquatica o Garcinia impalcature. hDFs aveva più alta attività metabolica quando coltivate in presenza di ponteggi decellularized tramite il metodo privo di detersivo rispetto a quelli preparati tramite il metodo basato su detergente (Figura 3A). Per garantire la rimozione completa dei reagenti utilizzati durante il decellularizzazione, un'ulteriore serie di esperimenti è stata eseguita in cui i ponteggi preparati sono stati lavati estensivamente prima della coltura delle cellule. Due metodi di lavaggio separati sono stati testati su campioni preparati utilizzando l'approccio basato su detersivo: un lavaggio in tampone Tris-HCl (10 mM, pH 8.5) seguita da un lavaggio in siero Free Media vs 2 lavaggi deionizzata H2O. Entrambi gli approcci utilizzati finale lavaggi con PBS 1X. L'impatto per le cellule di mammiferi successivamente esposti per i ponteggi di decellularizzazione pianta è stata misurata usando l'analisi di attività metabolica stessa come sopra. Tampone Tris-HCl (10 mM, pH 8.5) seguita da supporti liberi del siero ha contribuito a ridurre l'impatto sull'attività metabolica cellulare rispetto ai deionizzata H2O, facendo i campioni trattati con l'approccio basato su detergente paragonabile a campioni dal detersivo-free Metodo (Figura 3B).

Precedentemente è stato indicato che le cellule di mammiferi potrebbero crescere su impalcature preparate utilizzando l'approccio basato su detergente25; di conseguenza, era necessario dimostrare questo su campioni preparati con il metodo precedentemente non testato senza detersivo. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono state seminate su decellularized campioni di foglia F. hispida (dischi da 8 mm) a 20.000 cellule per impalcatura e lasciata per incubare per 24 h. Queste impalcature erano funzionalizzate prima dell'introduzione delle cellule con un coniugato di RGD-dopamina per facilitare aderendo. La figura 4 illustra immagini raccolte da un campione tipico. Un'immagine del campo luminoso è stato raccolto per mostrare la struttura generale di una sezione del campione utilizzato (Figura 4A). I MSCs sono stati macchiati utilizzando calceina ed imaged con un microscopio a fluorescenza (Figura 4B). Le immagini sono state poi sovrapposto (Figura 4) per visualizzare la posizione delle celle crescente sulla superficie della foglia.

Figure 1
Figura 1 . Il flusso di lavoro generale per decellularizzazione di tessuti vegetali. Flusso di lavoro tipico per la decellularizzazione di tessuti vegetali (operazioni di lavaggio e preparatori sono universali); Percorso superiore (A) è per il fondo di detergente a base di metodo (B) per il metodo privo di detersivo. (C) un incompleto/fallito decellularizzazione di una foglia di p. aquatica utilizzando il detergente a base di metodo a causa di prematura rimozione da decellularizzazione di vasca (D) A danneggiato il tensioattivo non ionico/candeggina di una foglia di F. hispida a causa di prolungata incubazione della soluzione di candeggina riscaldata nel metodo privo di detersivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Confronto tra proprietà meccaniche e l'efficacia di decellularizzazione tra metodi. Media ± deviazione standard; l'analisi statistica è stata fatta utilizzando i due campioni test t e p valori elencati dove statisticamente significativa (minore o uguale a 0,05). Confronto di prove meccaniche risultati tra i campioni di F. hispida e p. aquatica (barre blu utilizzati per detergente a base di approccio, rosso per il detersivo-libero e verde per campioni non trattati) (F. hispida detergente a base di n = 4, privo di detersivo n = 2; P. aquatica detergente-base n = 3, privo di detersivo n = 4) deformazione massima tangente Modulus (MTM) (B) (A) al fallimento (SAF) (C) e resistenza alla trazione Ultimate (UTS). (D) A analisi di dsDNA quantificazione è stato eseguito in triplice copia su tre campioni da ogni gruppo: non trattati (fresco, n = 3), il metodo privo di detersivo (candeggina, n = 3) e il metodo basato su detergente (SDS, n = 3), valori di p sono per metodo di decellularizzazione gruppo rispetto al gruppo campione non trattato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Risultati di dosaggio di attività metabolica confrontando impatto tra i due metodi di decellularizzazione. Media ± DS; l'analisi statistica è stata fatta utilizzando il t-test di due campioni e p valori elencati dove statisticamente significativa (minore o uguale a 0,05). Attività metabolica cellulare è stata misurata in presenza di campioni di tessuto di una specie di Garcinia (normalizzata a pozzetti di controllo con nessun campione aggiunto) e p. aquatica per visualizzare un confronto (A) dell'impatto metabolico dei due metodi di decellularizzazione (n = 3 per ogni gruppo) e (B) confronto dell'impatto di attività metabolica utilizzando due metodi di lavaggio detergente a base di protocollo: tampone Tris-HCl (10 mM, pH 8.5) combinato con supporti liberi del siero (n = 4) vs deionizzata H 2 O (n = 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Cellule staminali mesenchimali (MSCs) crescendo sulla superficie di decellularized foglia di Ficus hispida , funzionalizzato con un coniugato di RGD-dopamina. MSCs sono stati coltivati sulle foglie di F. hispida , decellularized dal metodo privo di detersivo e funzionalizzati con un coniugato di RGD-dopamina (500 µm scala bar sono stati aggiunti per riferimento) (A) immagine di campo luminoso di una sezione di decellularizzazione foglia (B ) Immagine di fluorescenza di calceina macchiato MSCs che cresce su foglia superficie unita (C) campo e fluorescenza immagine luminosa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Qui, vengono descritti due metodi per decellularize tessuti vegetali. I risultati presentati qui, accoppiato con i risultati di studi precedenti25, suggeriscono che i protocolli messi avanti siano probabili applicabile ad un ampio spettro di specie vegetali e può essere eseguita su entrambi i gambi e foglie. Queste procedure sono semplici e non richiedono attrezzature specializzate, quindi pianta decellularizzazione può essere effettuata nella maggior parte dei laboratori. È interessante nota che dopo decellularizzazione, i ponteggi devono essere funzionalizzati per facilitare l'adesione delle cellule dei mammiferi. Tecniche di funzionalizzazione diversi per consentire l'adesione di cellule di mammifero e crescita sulla pianta di tessuti sono stati descritti altrove25 e sono non l'argomento del manoscritto attuale.

Il passaggio finale in entrambi i protocolli decellularizzazione presentato qui (Figura 1) è stato fondamentale per il loro successo. Quando uno dei due metodi di esecuzione non sovraffollamento il bagno come questo si tradurrà in una radura irregolare. Questi metodi possono essere applicati all'interi foglie e steli; Tuttavia, questo aumenterà la lunghezza del tempo necessario per eliminarle. Assicurarsi che i campioni sono sommerse interamente per mantenere la radura coerente in tutta l'intero campione. Idealmente, decellularizzazione dovrebbe deselezionare tessuti vegetali della materia più cellulare, riducendo al minimo i danni strutturali. È probabile che il metodo privo di detersivo può essere modificato come necessario per lavorare con esemplari desiderati. Temperature più elevate vasca possono provocare più velocemente di compensazione volte ma possono anche provocare più danni ai campioni se sono sovra-incubate. Temperature più basse possono richiedere tempi di incubazione più lunghi e sarebbero opportuno per campioni più fragili. La concentrazione di candeggina nella soluzione può anche essere modificata per accelerare o decelerare il processo di decellularizzazione. Durante il test i nuovi campioni per l'utilizzo con il metodo privo di detergente, è consigliabile iniziare con una temperatura del bagno di 50-60 ° C con frequenti controlli sullo stato di avanzamento di decellularizzazione (idealmente ogni 15-20 minuti) fino a quando queste vengono cancellate adeguatamente. Questa gamma di temperatura è stato ben tollerata dalla maggior parte delle specie vegetali che sono stati testati durante l'ottimizzazione della tecnica. Al termine, i campioni possono essere ispezionati visivamente e manualmente per garantire non sono stati eccessivamente incubate e danneggiate irreparabilmente come sarebbe indicato da strappi o disintegrazione dopo l'estrazione dal bagno. Campioni preparati utilizzando questo approccio mostrano un minore impatto sulla crescita delle cellule (Vedi Figura 3A) rispetto al detergente a base di approccio con il solo lavaggio in deionizzata H2O. Tuttavia, è consigliabile lavare ulteriormente con Tris-HCl (10 mM, pH 8.5) e media senza siero, soprattutto nelle applicazioni sensibili.

È probabile che il metodo di detergente a base di (SDS) applicabile alla maggior parte delle specie di piante ed è particolarmente utile per la compensazione foglia intera e campioni delicati perché richiede minima agitazione fisica. Come accennato in precedenza, il passo finale è fondamentale per il decellularizzazione di campioni. Campioni con proprietà fisiche distinte possono essere liquidati con regolazione del tempo di incubazione nei bagni tensioattivo non ionico. Uno svantaggio significativo di questo processo è che tessuti decellularizzati potrebbero contenere tracce dei detergenti utilizzati, che successivamente possono influenzare l'attività metabolica cellulare delle cellule di mammiferi. Fasi di lavaggio approfondito si raccomanda, pertanto, prima dell'uso. Qui è stato trovato che campioni lavati con un tampone Tris-HCl (10 mM, pH 8.5) seguita dai media senza siero avevano maggiore vitalità cellulare che quelli lavati con deionizzata H2O prima del loro utilizzo (Figura 3B).

Quando si archiviano campioni non trattati per un utilizzo futuro in uno dei due metodi, è importante a monitorarli per danni assicurare che i ponteggi risultanti non saranno influenzati. Danni possono apparire come lo scolorimento dei tessuti vegetali, nonché di cracking o eccessiva fragilità quando vengono maneggiati. Si raccomanda di monitorare i campioni su base settimanale in modo da utilizzarli prima non sono più utili e devono essere smaltiti. L'insorgenza del danno varia tra tipi di campioni, con i campioni più robusti più spessi dura di più.

In generale, piante tenere molta promessa come una potenziale fonte di biomateriali. Questo è rafforzato dalla loro naturalmente sviluppate strutture intricate e caratteristiche che li aiutino a crescono nella loro ambienti nativi. Successo utilizzazione dei tessuti vegetali come impalcature ingegneria dei tessuti propone un'alternativa economico potenzialmente costose e spesso difficili da progettare, biomateriali. Topografia di superficie di tessuto vegetale, che intrinsecamente varia da una specie a altra, può essere sfruttata anche per diretto spazialmente orientato crescita cellulare25. Ad esempio, uno studio precedente ha dimostrato che le cellule umane rispondono alle topografiche spunti presenti su piante decellularizzati25, così che queste impalcature possono essere utilizzate per la coltura di cellule in modelli altamente organizzata25. Un'altra caratteristica che è desiderabile nell'ingegnerizzazione del tessuto è de novo perfusability. Tessuti vegetali si sono evoluti nel corso di centinaia di milioni di anni per essere estremamente efficiente nel trasporto di fluidi e loro reti vascolari possono essere irrorato in modo efficiente24. Questa proprietà può essere potenzialmente utilizzata per guidare la migrazione cellulare e l'angiogenesi con l'obiettivo finale di creare sostituzione tessuto per applicazioni cliniche. Ciò è sostenuta dai risultati di studi precedenti che hanno dimostrato che i biomateriali con l'elevata area superficiale e porosità interconnesse sono favorevole alla proliferazione cellulare e quando impiantato in vivo, enable migrazione verso l'interno delle cellule dell'ospite in impianto36,37,38,39. L'elevata area superficiale e la porosità interconnessa sono anche il segno distintivo della pianta tessuti40,41,42, quindi pianta-derivati impalcature hanno il potenziale per l'integrazione con i tessuti circostanti in vivo. Inoltre, recenti studi trovato che decellularizzati foglie possono essere irrorati con successo con cellule24 e che quando le cellule umane sono state seminate su tessuti vegetali decellularizzati, hanno conformato al loro spunti topografica25. Quando prese tutti insieme, pianta-derivati impalcature possiedono le caratteristiche necessarie per essere applicato con successo verso applicazioni di ingegneria tissutale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare John Wirth dei giardini Olbrich per gentilmente fornire i campioni utilizzati in questo progetto. Questo lavoro è supportato in parte dal cuore nazionale, polmone e l'Istituto del sangue (R01HL115282 a G.R.G) National Science Foundation (DGE1144804 a J.R.G e G.R.G) e il fondo di Alumni (H.D.L) e Università di Wisconsin Dipartimento di chirurgia. Quest'opera è stata anche sostenuta in parte l'Environmental Protection Agency (grant STAR No. 83573701), il National Institutes of Health (R01HL093282-01A1 e UH3TR000506) e la National Science Foundation (IGERT DGE1144804).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium dodecyl sulfate Sigma Life Science 75746-1KG
Triton X-100 MP Biomedicals, LLC 807426 Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) Clorox Item #: 31009 Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate Acros Organics 217120010 Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch HealthLink 15111-80 Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table Stovall Life Sciences BDRAA115S Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate Fisher Scientific Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker Any Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
DMEM Corning MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay Life Technologies P11496 Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
  2. Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
  3. Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
  4. Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
  5. Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
  6. Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  7. Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
  8. Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
  9. Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
  10. Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
  11. Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
  12. Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
  13. Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
  14. Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
  15. Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
  16. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
  17. Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
  18. Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
  19. Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
  20. Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
  21. Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
  22. Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  23. McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray's law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
  24. Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  25. Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
  26. Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
  27. Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  28. Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
  29. Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  30. Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
  31. Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from: http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html (2017).
  32. Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
  33. Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
  34. Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
  35. Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
  36. Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
  37. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  38. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
  39. Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
  40. Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923 (2003).
  41. Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. Biology of Plants. , 7th edition, (2005).
  42. Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).

Tags

Bioingegneria problema 135 Decellularized ponteggi tessuti vegetali foglie steli ponteggi perfusable decellularizzazione
Due metodi per decellularizzazione di tessuti vegetali per applicazioni di ingegneria del tessuto
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak,… More

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak, J. R., Gaudette, G. R., Le, H. D., Murphy, W. L. Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (135), e57586, doi:10.3791/57586 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter