Hele Mount Immunofluorescence og hårsekken kvantifisering av kultivert musen eggstokkene
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å kvantifisere follikler i kulturperler eggstokkene unge mus uten føljetong snitting. Bruke hele organ immunofluorescence og vev clearing, erstattes fysisk snitting med optisk snitting. Denne metoden for eksempel Creation og visualisering opprettholder orgel integritet og muliggjør automatisert kvantifisering av bestemte celler.
Abstract
Forskning innen pattedyr reproduktive biologi innebærer ofte evaluere den globale tilstanden eggstokker og testikler. Spesielt i kvinner, er ovarian fitness ofte vurdert av visualisere og kvantifisere follicles og oocytes. Eggstokken er en ugjennomsiktig tredimensjonale vev, krever tradisjonelle tilnærminger møysommelig kutting vevet i mange føljetong seksjoner for å visualisere celler gjennom hele orgel. Videre, fordi kvantifisering av denne metoden innebærer vanligvis scoring bare et delsett av delene med omtrentlig diameteren på en oocyte, det er utsatt for feil. Her er en protokoll beskrevet som utnytter stedet hele organ tissue clearing og immunofluorescence flekker av musen eggstokkene å visualisere follicles og oocytes. I forhold til mer tradisjonelle tilnærminger, denne protokollen er fordelaktig for å visualisere celler i eggstokken av mange grunner: 1) eggstokken forblir intakt hele prøven forberedelse og behandling. 2) liten eggstokkene, som er vanskelig å delen, kan undersøkes med letthet; 3) mobilnettet kvantifisering er lettere og nøyaktig oppnådd; og 4) hele orgel fotografert.
Introduction
For å studere mobilnettet sammensetning og morfologiske funksjoner i pattedyr eggstokkene, avhengige forskere ofte i vivo eksperimenter etterfulgt av immunohistological farging av parafin innebygd eggstokkene. Mer nylig skjønt, hel eggstokk orgel kultur har vist seg for å være et effektivt alternativ til å studere eggstokkfunksjonen1,2,3,4 fordi teknikken kan kombineres med bedre visualisering og kvantifisering verktøy. Tradisjonelt avhenger analyse av eggstokkene morfologi gjenoppbygging tredimensjonale ovarian arkitektur fra innebygd føljetong parafinsnitt, men er arbeidskrevende og tidkrevende, serielt snitting parafin innebygd vev ikke garanti riktig gjenoppbygging av orgelet, og deler ofte blir borte eller mis bestilt i prosessen.
I tillegg de tekniske utfordringene knyttet til serielle skjæring, finnes det også variasjoner i metodene som rutinemessig brukes å kvantifisere hårsekken tall per eggstokk5,6. Metodologiske variasjon brukt svekker meta-analyse av eggstokkene reserve over studier5,7. For eksempel kan hårsekken tall fra forskjellige forskningsartikler variere fra 10 ganger eller mer alderen lignende utviklingsmessige innenfor en bestemt belastning6. Disse store forskjellene i rapporterte hårsekken kvantifisering kan føre til forvirring og har hindret kryss-studie sammenligninger. Eksperimentelt, tradisjonelle tilnærminger til hårsekken kvantifisering fra føljetong deler utføres ved å telle follicles av et forhåndsdefinert antall snitt (f.eks hver femte, tiende, eller andre delen). Variasjon i hårsekken teller bruker denne tilnærmingen oppstår ikke bare fra periodisitet i hvilke deler telles, men også fra variasjoner i snittykkelse og teknisk erfaring generere føljetong punkt5,6. I tillegg til sin variasjon er en annen ulempe av tradisjonelle vev snitting at inndeling av små eggstokkene fra ung dyrene er spesielt utfordrende og svært avhengig av vev retning8.
Protokollen nedenfor beskriver en rutinemessig brukes eggstokk kultur teknikk1 men forbedrer på tradisjonelle hårsekken kvantifisering ved å erstatte fysiske snitting med vev clearing og optisk snitting ved bruk av AC confocal mikroskopi8 ,9. Fjerne bruker vev nedsenking (uten behovet for Transkraniell perfusjon eller geleelektroforese) i en urea og sorbitol-løsning (f.eks ScaleS(0)10) vist seg kompatibel med immunostaining og tillatt for reduksjon av clearing tid uten at dybdeskarphet bildebehandling. Andre rapporterte metoder (f.eksScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12og ClearT212) er enten mer tidkrevende eller tillater ikke grundig optisk oppløsning av utvalget. Optisk snitting er en fordel fordi det er mindre arbeidsintensiv og opprettholder den organ tredimensjonale arkitektur7,8. En annen fordel med denne tilnærmingen er at forberedelse av prøvene krever ikke dyrt reagenser fjerne vevet og kan gjennomføres med relativ letthet.
Spesielt protokollen beskrevet er optimalisert for kulturperler musen eggstokkene på postnatal dag fem, men har blitt utført på eggstokkene fra postnatal dag 0 – 10. Metoden gjør bruk av en eggstokk kultur-systemet som vevet naturlig festes til membranen som er det kultivert, tilrettelegging orgel håndtering og manipulasjon. Kultur systemet beskrevet kan brukes til å vedlikeholde explanted eggstokkene opptil 10 dager og for å vurdere hvordan ulike eksperimentelle forhold kan forstyrre oocyte overlevelse13. Kvantifisering fremgangsmåten ved hjelp av ikke-kommersielle bildebehandlingen pakken FIJI-ImageJ14 og kan gjennomføres på de fleste datamaskiner. Videre kan bilder brukes for kvantifisering gjøres tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet, og dermed gir for fremtidige meta-analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiet av pattedyr reproduksjon krever bruker og kvantifisere spesialiserte celler som ikke er rutinemessig mottakelig for cellekultur. Men er ex vivo kultur systemer effektiv på å opprettholde eggstokk og follicle levedyktighet1,15. Under eggstokk kultur krever vevet et større areal for utveksling av næringsstoffer gjennom spredning. Derfor 5 – dagers gammel mus eggstokkene er ideelle i størrelse og form for orgel kultur. Denne protokollen ble opt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Rebecca Williams og Johanna Dela Cruz fra Cornell BRC Imaging og Andrew Recknagel for forslag og teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet til National Institutes of Health grant S10-OD018516 (til Cornell Imaging anlegg), T32HD057854 til J.C.B. og R01-GM45415 til J.C.S.
Materials
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
- O’Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts – not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, (2017).
