Toute monture Immunofluorescence et Quantification de follicule de souris cultivées ovaires
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à quantifier les follicules dans les ovaires de jeunes souris sans sectionnement serial. Selon immunofluorescence de la totalité de l’organe et de tissus de compensation, sectionnant physique est remplacé par sectionnement optique. Cette méthode de préparation des échantillons et visualisation maintient l’intégrité de l’organe et facilite la quantification automatique des cellules spécifiques.
Abstract
Recherche dans le domaine de la biologie de la reproduction chez les mammifères souvent consiste à évaluer l’intégrité globale des ovaires et des testicules. Plus précisément, chez les femelles, l’ovaire remise en forme est souvent évaluée par visualiser et quantifier les follicules et les ovocytes. Parce que l’ovaire est un tissu opaque en trois dimensions, les approches traditionnelles nécessitent laborieusement découper le tissu dans nombreuses coupes sériées afin de visualiser les cellules tout au long de l’organe entier. En outre, parce que la quantification de cette méthode consiste généralement à marquer qu’un sous-ensemble des sections séparées par le diamètre approximatif d’un ovocyte, elle est sujette à l’inexactitude. Un protocole est décrit ici, qui utilise plutôt la compensation tissus organes entiers et immunofluorescence souillant des ovaires de souris pour visualiser les follicules et les ovocytes. Par rapport aux approches plus traditionnelles, ce protocole est avantageux pour la visualisation des cellules à l’intérieur de l’ovaire pour de nombreuses raisons : 1) l’ovaire reste intacte tout au long de la préparation des échantillons et du traitement ; 2) petits ovaires, qui sont difficiles à section, peuvent être examinées avec facilité ; 3) quantification cellulaire est obtenue plus facilement et avec précision ; et 4) l’organe entier imagé.
Introduction
Afin d’étudier la composition cellulaire et les caractéristiques morphologiques des ovaires chez les mammifères, scientifiques reposent souvent sur des expériences in vivo suivies immunohistological coloration des ovaires de paraffine incorporé. Plus récemment cependant, culture d’organes entiers ovaire s’est avéré pour être une alternative efficace pour étudier la fonction ovarienne1,2,3,4 , parce que la technique peut être couplée avec une meilleure visualisation et outils de quantification. Traditionnellement, analyse de la morphologie ovarienne dépend de reconstruire en trois dimensions architecture ovarien de coupes sériées de paraffine incorporé, mais, en plus d’être laborieuse et chronophage, coupes en série tissu paraffine incorporé ne garantie pas de bonne reconstruction de l’orgue, et les sections sont souvent perdues ou mal classées dans le processus.
Outre les défis techniques liés au sectionnement série, il y a des variations dans les méthodes couramment utilisées pour quantifier le nombre de follicules par ovaire5,6. La variabilité méthodologique utilisée actuellement altère la méta-analyse de réserve ovarienne ensemble études5,7. Par exemple, nombre de follicule d’articles de recherche différents peut varier de 10 fois ou plus entre les âges de développement similaires au sein d’une souche spécifique de6. Ces grandes différences dans la quantification du follicule signalées peuvent prêter à confusion et ont entravé la Croix-étude des comparaisons. Expérimentalement, les approches traditionnelles de la quantification de la follicule de coupes sériées sont effectuées par le comptage des follicules d’un nombre prédéfini de sections (par exemple, chaque cinquième, dixième, ou autre article). Variabilité des comtes de follicule à l’aide de cette approche découle non seulement de la périodicité dans quelles sections sont comptées, mais aussi des variations dans l’épaisseur de coupe et une expérience technique dans la génération de coupes sériées5,6. En plus de sa variabilité, un autre inconvénient des coupes de tissu traditionnel est que le sectionnement de petits ovaires d’animaux jeunes est particulièrement difficile et fortement tributaire des tissus orientation8.
Le protocole ci-dessous décrit une technique de culture ovaire systématiquement utilisé1 mais améliore grandement sur la quantification du follicule traditionnel en remplaçant les coupes physiques avec tissu de compensation et sectionnement optique à l’aide de la microscopie confocale8 ,,9. Compensation à l’aide d’immersion de tissu (sans la nécessité d’une perfusion transcrânienne ou électrophorèse) dans un et sorbitol-base d’urée solution (par exemple, ScaleS(0)10) s’est avérée compatible avec l’immunomarquage et autorisés pour la réduction des temps de compensation sans compromettre la profondeur de l’imagerie. Autres méthodes déclarées (p. ex., ScaleA28,10, SeeDB11, Clear12et ClearT212) sont plus consommer de temps ou ne permettent pas une résolution optique approfondie de l’échantillon. Optique de sectionnement est avantageux car il est moins intensive de travail et maintient architecture tridimensionnelle7,8 de l’orgue. Un autre avantage de cette approche est que la préparation des échantillons n’exige pas des réactifs coûteux pour dégager le tissu et peut être effectuée avec une relative facilité.
Plus précisément, le protocole décrit a été optimisé pour les ovaires de souris cultivées à jour après la naissance cinq mais a été mené sur les ovaires allant de jour après la naissance 0 – 10. La méthode utilise un système de culture ovaire dans laquelle le tissu s’attache naturellement à la membrane sur lequel il est cultivé, facilitant la manipulation de l’orgue et la manipulation. Le système de culture décrit peut servir à maintenir explantés ovaires pendant 10 jours et d’évaluer comment les différentes conditions expérimentales peuvent interférer avec l’ovocyte survie13. La procédure de quantification décrite est réalisée en utilisant le paquet Fidji-ImageJ14 de traitement d’image non commerciale et peut être effectuée sur la plupart des ordinateurs personnels. En outre, images utilisées pour la quantification peuvent être largement diffusés pour la communauté scientifique, ce qui permet de meta-analyse future.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude de la reproduction chez les mammifères nécessite à l’aide et à la quantification des cellules spécialisées qui ne sont pas systématiquement se prêtent à la culture cellulaire. Cependant, ex vivo systèmes de culture sont efficaces pour maintenir l’ovaire et le follicule viabilité1,15. Au cours de la culture de l’ovaire, le tissu nécessite une plus grande surface pour l’échange d’éléments nutritifs par diffusion. Par con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Rebecca Williams et Johanna Dela Cruz de l’imagerie de BRC de Cornell et Andrew Recknagel suggestions utiles et assistance technique. Ce travail a été soutenu à des instituts nationaux d’octroi de santé S10-OD018516 (à Cornell Imaging Facility), T32HD057854 à J.C.B. et R01-GM45415 à J.C.S.
Materials
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
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