Summary
Identificação de variantes genéticas contribuindo para doenças humanas complexas nos permite identificar novos mecanismos. Aqui, vamos demonstrar uma abordagem de genotipagem multiplex de genes candidatos ou análise de percurso de gene que maximiza a cobertura de baixo custo e é passível de estudos de coorte-baseado.
Abstract
Doenças complexas são muitas vezes sustentadas por múltiplas variantes genéticas comuns que contribuem para a suscetibilidade a doenças. Aqui, descrevemos uma abordagem de polimorfismo (SNP) de nucleotídeo único marca econômica usando um ensaio de genotipagem multiplexado com espectrometria de massa, para investigar associações de caminho do gene em coortes clínicas. Vamos investigar o locus de candidato de alergia alimentar Interleukin13 (IL13) como um exemplo. Este método eficiente maximiza a cobertura, tirando proveito do desequilíbrio de ligação partilhada (LD) dentro de uma região. Selecionado LD SNPs então destinam-se em um ensaio multiplexado, permitindo até 40 SNPs diferentes a serem analisados simultaneamente, aumentando a rentabilidade. Reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada para amplificar os loci de alvo, seguido pela extensão de nucleotídeo único, e os amplicons são então medidos usando a laser assistida por matriz dessorção/ionização-tempo flight(MALDI-TOF) espectrometria de massa. A saída bruta é analisada com o genótipo de chamar o software, usando as definições de controle de qualidade estritas e cortes, e genótipos de alta probabilidade são determinados e saídos para análise de dados.
Introduction
Em doenças humanas complexas, variantes genéticas contribuem para a suscetibilidade a doenças e quantificar essas variantes pode ser úteis para a patogênese da compreensão, identificação de grupos de pacientes de alto risco e tratamento respondentes. Na verdade, a promessa da medicina de precisão é dependente utilizando Informação Genômica para identificar subgrupos de pacientes1. Infelizmente, dentro do espaço de biologia doença complexa, onde os fenótipos de doença são sustentados por heterogeneidade genética substancial, baixa penetrância e expressividade variável, coorte tamanho requisitos para abordagens de todo o genoma identificar romance os candidatos são frequentemente prohibitively grande2. Alternativamente, uma abordagem de gene alvo candidato começa com uma hipótese um priori sobre genes/percursos específicos na etiologia de doença3. Ferramentas de análise de percurso são comumente usadas para investigar a fisiopatologia de um loci alvo identificado, gerando numerosas vias de candidato a ser explorado. Demonstramos aqui uma abordagem de genotipagem multiplexada, permitindo a investigação de dezenas a centenas de SNPs com um ensaio, adequado para estudos de coorte humana4. Esta abordagem é relativamente elevado através de colocar, permitindo que centenas de milhares de amostras de DNA para ser genótipo para estudos de nova descoberta e investigação de percursos específicos. Os métodos descritos aqui são úteis para identificar alelos de risco e suas associações com características clínicas de forma relativamente rápida e barata. Esta plataforma tem sido altamente vantajosa para triagem e diagnóstico fins5,6e, mais recentemente, para infecção microbiana7 e papilomavírus humano8.
Este protocolo começa com a seleção de um conjunto de genes para investigação, i. e., as regiões de destino, geralmente determinadas por meio de pesquisa de literatura, ou um priori hipóteses para o envolvimento no processo de doença; ou talvez selecionado para replicação como as principais associações de um estudo de associação de genoma-largo (GWA) descoberta. Do conjunto de genes, o pesquisador irá selecionar uma lista refinada da marca SNPs. Ou seja, o desequilíbrio de ligação (LD), ou correlação, entre variantes na região é usado para identificar um representante 'marca SNP' para um grupo de SNPs em alta LD, conhecido como um haplótipo. O LD alta da região significa que os SNPs são herdadas muitas vezes juntos tal que a genotipagem um SNP é suficiente para representar a variação em todos os SNPs no haplótipo. Como alternativa, se a seguir uma lista definitiva de SNPs de muitas regiões, por exemplo., replicação para um estudo da GWA, este processo pode ser desnecessário. Para genotipagem multiplexada, um ensaio deve então ser projetado em torno dessas metas tais que os primers de amplificação são de massa diferindo dos primers extensão e espectros de massa de produtos para produzir interpretável. Esses parâmetros são facilmente implementados por uma ferramenta de design de ensaio de genotipagem multiplexado. Os primers para diante e reversos deste projeto serão usados para direcionar os marcadores de interesse e amplificar a sequência que contém o SNP. Os primers de extensão anexar diretamente proximal para os SNPs e é adicionada a uma base única, massa-modificado, 'terminator' complementar para o SNP. A base de terminator impede extensão do DNA. A massa-modificação da base permite que fragmentos, diferenciando-se por uma base única para ser detectado por espectrometria de massa. A placa contendo a química de genotipagem é então aplicada a um chip para medição em uma plataforma de espectrometria de massa. Após a aplicação de controlos de qualidade adequados para as chamadas de genotipagem cru detectadas pelo sistema, os dados podem ser exportados e utilizados para a análise estatística para testar a associação com fenótipos de doença.
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Protocol
O material genético utilizado neste documento eticamente foi aprovado para uso pelo escritório para crianças HREC (humano pesquisa Comitê de ética) (CDF/07/492), o departamento de HREC serviços humanos (10/07) e Hospital (RCH das crianças Royal) HREC (27047).
1. projetar o ensaio multiplexado
- Prepare uma lista SNP para design de ensaio.
- Entrada da região de destino para a função de marcador de Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Use o LD (correlação, r2) entre SNPs, abrangendo a região de destino para gerar uma lista de SNPs, que fornece uma cobertura completa da região desejada com o menor número de variantes necessárias. Gerar uma lista de SNPs, de tal forma que todos os alelos para ser capturados são correlacionados acima de um limite definido pelo usuário (ex., r2 ≥0.8).
- Identificação de sequências adequadas para as primeiras demão para diante, inverso e extensão
- Insira a lista gerada de SNPs na ferramenta de desenho de ensaio de escolha.
Nota: As seguintes instruções se aplicam para a ferramenta de projeto de ensaio utilizada para gerar os resultados representativos, conforme especificado na Tabela de materiais. - Uma vez que a ferramenta de projeto de ensaio foi lançada, selecione Novo Design de genotipagem. Digite um nome para o projeto de ensaio no campo Nome do projeto .
- Fornece a lista SNP gerada na etapa 1.1.1 clicando no botão rotulado Editar entrada de texto com as instruções rs ou FASTA à esquerda do botão.
Nota: SNPs podem ser inseridos como uma lista de texto de referência (rs) SNP IDs ou enviados no formato FASTA, ou o formato de arquivo de grupo de SNP utilizado pela ferramenta. Para fazer upload de arquivos nesses formatos, selecione o botão de Upload de arquivos . Limite superior de variantes que podem ser projetados em um único ensaio, denominado 'bem', é 40 SNPs. É possível especificar SNPs que são uma prioridade para o projeto antes de iniciar a execução; estas irão ser desenhadas primeiro. SNPs do controle podem ser especificados: por exemplo, um ensaio para detectar o sexo no caso de amostra mistura ups ou um controle para determinar esse modelo suficiente foi adicionado se trabalhando com qualidade baixa ou pobre DNA. No entanto, deve notar-se que usar o controle e a prioridade de SNPs pode reduzir o número de SNPs que pode ser projetado em um único bem. - No menu predefinição , selecione a opção alta multiplexação iPLEX Preset . No menu do organismo , selecione o organismo do qual deriva o DNA ser genótipo. Para os resultados representativos apresentados aqui, isso era humano.
Nota: Mouse e organismos bovinos também são compatíveis com a ferramenta. Um pode também selecionar outros se trabalhando com um organismo alternativo como planta ou micróbio; no entanto, as etapas automatizadas para encontrar SNPs proximais e áreas de cartilha ideal não estará disponíveis devido à ausência de um genoma de referência. - No menu banco de dados , selecione a compilação mais recente do genoma, ou uma compilação alternativa, se necessário, no menu de química . Selecione o iPLEX e Nível Multiplex no campo, insira o maior nível de multiplexação: 40. Agora, selecione Iniciar Executar. "Etapa 1" da ferramenta irá começar.
Nota: Durante a etapa 1, a ferramenta recupera e formata as sequências do SNP. Aqui, erros podem incluir formatação do arquivo FASTA no qual caso o arquivo FASTA deve ser verificado e reformatado conforme necessário. Outro erro é SNP rs números que foram mesclados com outro número de rs, em que caso o número de rs deve ser pesquisado em um banco de dados do SNP como dbSNP do NCBI para identificar o novo número de rs do SNP. Sequências em torno do SNP são pesquisadas para qualquer conhecidos SNPs proximais que poderiam interferir com o projeto da primeira demão. Potenciais locais de primeira demão do PCR são comparados com o genoma para evitar a amplificação não-específica, devido a vários hits no genoma. - Aguarde a conclusão do "Passo 2" da ferramenta de projeto no qual serão identificados SNPs proximais.
Nota: Se utilizar um organismo que não é suportado por esta etapa, anote as sequências com SNPs proximais na anotação de IUPAC se esta informação estiver disponível. Raramente há erros durante esta etapa; no entanto, os erros podem ocorrer se o organismo de referência errada ou genoma foi selecionado, ou sequências de cDNA foram inscritas em vez de DNA genômico. Para otimizar a etapa 2, em Configurações avançadas, é possível filtrar com base em uma população se trabalhar dentro de uma população específica de SNPs. SNPs raros também podem ser filtrados, excluindo aqueles com uma frequência inferior a 1%. Finalmente, SNPs que não têm um status de validado ou não ter informação da população também podem ser excluídos, se desejado. - Aguarde a conclusão das regiões "Passo 3" da ferramenta de design que identifica o ideal da primeira demão. Se preferir locais cartilha foram identificadas, ou se trabalhar com um organismo diferente, manualmente entrada locais da primeira demão, anotando a sequência de entrada (os arquivos do grupo SNP) com as regiões de cartilha preferencial em letras maiusculas e o resto da sequência em baixa caso, selecione Preservar caso o menu de configurações avançadas para esta etapa.
Nota: Erros para as etapas 2 e 3 podem incluir: (1) SNP proximal A bloquear o design de um primer com a solução sendo a máscara com uma base não-modelo e encomendar um oligo com uma base universal como Isonine ou, desenha duas primeiras demão, um com cada um dos alelos da proxim Al SNP, ou, projeto uma cartilha com o alelo comum apenas. (2) um outro erro comum é a falha para identificar um site exclusivo para o primer com a solução sendo modificar o comprimento do amplicon a fim de identificar um único site. A ferramenta usada para este papel, o padrão é 80-120 bp. Isto pode ser alterado do bp 60-400 no diálogo Configurações avançadas sob as configurações de comprimento Amplicon em "3. Identificar áreas de Primer ideal"e também sob a aba do Amplicon "4. Projeto ensaios." Certifique-se de que ambos são alterados. No entanto, deve notar-se que aumentar o comprimento do amplicon quando usando degradadas de DNA não é recomendado. - Aguardar a conclusão da etapa de concepção do ensaio (ferramenta de "etapa 4" do projeto), aqui a ferramenta visa proporcionar separação ideal passe entre os primers de extensão e os alelos de todos os SNPs em projetos de multiplexado. Depois que essa etapa for concluída, exporte o arquivo de Oligo ordem, que é formatado para fácil encomendar através de um oligo ordenando o fornecedor de escolha.
Nota: Primeiras demão de amplificação (para a frente (F) e marcha à ré (R)) são projetadas para produzir um tamanho ideal amplicons de 80 a 120 bp. O primer de amplificação massa deve diferir do que o primer de extensão e seu produto para evitar resultados conflitantes no espectro de massa e para o desempenho geral do PCR. O primer de extensão deve ser de 15 a 30 nucleótidos longos (4.500-9.000 Da), projetados de modo que a extremidade 3' irá anexar diretamente adjacente ao local do polimorfismo. Todas essas configurações são definidas automaticamente na ferramenta usada para gerar os resultados representativos.
- Insira a lista gerada de SNPs na ferramenta de desenho de ensaio de escolha.
- Exportar o desenho de primers escolhidos ferramenta e ordem de um provedor de oligómero: 25 nmol de cada um dos primers PCR (frente e verso) e 100 nmol de cada um dos primers extensão. Consulte a tabela 1 para os primers utilizados para gerar os resultados representativos.
2. genotipagem (1-2 dias)
- Prepare cartilhas de amplificação.
- Se as primeiras demão liofilizadas foram ordenadas, reconstitua com água molecular da classe. Use uma concentração de 100 μM/μL de primers para diante e reversos e 500 μM/μL para extensão.
- Piscina para diante e reversos primeiras demão para cada ensaio multiplexada em uma mistura de ações da primeira demão, contendo cada cartilha numa concentração de 0,5 mM.
Nota: por exemplo, uma piscina de 400 μL primer para 400 reações:
2 μL de cada primer, na concentração de 100 μM/μL, é necessária para o pool de ações da primeira demão. Para um ensaio de 30-plex com 60 primers para diante e reversos, um total de 120 μL de primer seria necessário (a piscina cartilha concentrado). Água de grau molecular 280 μL seria então adicionado ao fazer um volume final de 400 μL de primer mix.
- Amplificação utilizando a reação em cadeia de polimerase (PCR)
- Faça uma mistura de mestre para o PCR contendo 100 nM da mistura da primeira demão detalhados acima, 500 μM de dNTPs, 2 mM de MgCl2e 0,5 U de uma enzima DNA polimerase. 1 U é necessária para maior que 26-plex ensaios. Consulte a tabela 2.
- Adicione 4 μL desta mistura para cada poço da placa de PCR 384-poço, juntamente com 1 μL de DNA genômico na concentração de 5-10 ng/μL.
Nota: os controles de qualidade também devem ser incluídos na chapa, como um controle de não-modelo e um controlo positivo que anteriormente realizada bem com o ensaio (durante uma execução de teste). Se executando várias placas, amostras de DNA de múltiplos das outras placas, por exemplo., em triplicado, deve ser executado como controlos técnicos variabilidade inter plate. - Centrifugue a placa a 200 x g por 1 min em temperatura ambiente com uma tampa da placa de forma a assegurar que todo o líquido contido no fundo dos poços da placa.
- Executar o PCR com as seguintes condições de thermocycler: incubação de 4 min a 94 ° C para ativar a DNA polimerase; 45 ciclos dos seguintes (desnaturação a 94 ° C, durante 20 s, recozendo a 56 ° C por 30 s e extensão a 72 ° C por 1 min) e em seguida uma extensão final a 72 ° C por 3 min. Indique ao programa PCR na tabela 3.
- Realize a eletroforese em gel de agarose para garantir que a amplificação do DNA é bem sucedida. Use 1 µ l de produto PCR (com 3 µ l de tampão de carregamento) em um gel de agarose 2% (p/v), feito pela mistura de pó de agarose e tampão Tris borato EDTA (TBE) de 0,5% e executada por 45 min em 100 V.
- Etapa de purificação de fosfatase alcalina (SAP) de camarão
Nota: Este passo é usado para remover a região censo-designada de nucleotídeos. A enzima SAP cliva grupos fosfato para impedir primer em excesso e não incorporada dNTPs interferindo na reação de extensão programados.- Fazer um mestre mistura contendo 1,7 unidades/μL da enzima fosfatase alcalina camarão (SAP), buffer de SAP x 10 e completar o volume com água molecular da série. Consulte a tabela 4.
- Adicionar 2 μL de recém-feitos acima SAP master mix para cada poço da placa, já contendo 5 μL da reação de PCR. Centrifugue brevemente e retornar ao thermocycler a 37 ° C por 40 min e, em seguida, a 85 ° C por 5 min para inativação da enzima. Consulte a tabela 5.
- Reação de extensão do primer
Nota: A concentração dos primers extensão no mix extensão da primeira demão deve ser ajustada pelo tamanho (Linear Primer ajuste – LPA). Isto é porque há uma relação inversa no pico de intensidade (sobre os espectros de massa) e produto em massa. Ajuste da concentração da primeira demão de extensão corrige para esta relação produzir picos de intensidades iguais. Ajustado primers usados para gerar o representante resultados são fornecidos em tabelas 6 e 7. Os volumes fornecidos são para gerar 1,5 mL de mistura de extensão da primeira demão.- Calcular os fatores de diluição para cada primeira demão usando um algoritmo de gradiente, disponível a partir do Agena Biosciences ('Linear Primer ajuste'), que ajusta para a massa e a concentração da primeira demão e o número total de primers na reação multiplexada (veja Tabelas 6 & 7). Introduza a massa UEP para cada primeira demão no campo UEP_MASS da folha ajuste Linear de Primer.
Nota: A concentração em massa ajustada para a primeira demão será calculada automaticamente na célula com o texto do cabeçalho "Alvo reação concentração (µM)." O volume de primer para ser adicionado ao pool primário ser imprimirá na célula sob o cabeçalho e rodapé "Primer Volume do estoque a ser adicionado ao Pool (µ l)." O volume de água a ser adicionado ao pool de cartilha para compensar as concentrações calculadas é saído para a célula ao lado do texto "Volume da enciclopédia do PCR da classe RNase H2O para ser adicionado Primer piscina (µ l)". - Tomar o volume de cada primer, conforme especificado no arquivo de ajuste Linear de Primer e compõem um pool da primeira demão. Adicione o volume de água calculado pelo algoritmo para diluir a piscina da primeira demão, conforme determinado na etapa 2.4.1.
Nota: Se o método de algoritmo do gradiente não estiver disponível, um outro método é dividir os primers em massa baixa e alta massa e adicionar o dobro da concentração dos primers em massa altas em relação ao grupo de baixo massa. Grupos de três ou quatro podem ser exigidos para um ensaio de alta-plex (ou seja, mais de 19 SNPs). No entanto, esse método não renderá como taxas de chamada ideal como o método de algoritmo do gradiente. - Monte o mix de extensão mestre. Para o ensaio de plex baixa (1-18 plex), adicione 0,2 µ l de tampão, 0,1 μL de mistura de terminação, 0.94 μL da mistura da primeira demão LPA ajustado e 0.0205 μL de enzima (preparada no gelo). Para o ensaio de plex alta (19-36 plex), adicione dupla concentração de mistura de terminação e enzima (terminação mistura 0,2 µ l e iPLEX μL de enzima 0,041). Consulte a tabela 8.
- Adicione 2 μL da mistura mestre extensão reação à placa da reação anterior, agora trazendo o volume total de 9 μL por poço. Centrifugue brevemente e coloque no thermocycler: 94 ° C para uma incubação inicial 30 s, 40 ciclos de 1 x 94 ° C por 5 s com 5 x (52 ° C por 5 s, seguido de 80 ° C durante 5 s) e depois de 72 ° C por 3 min. consulte a tabela 9.
- Calcular os fatores de diluição para cada primeira demão usando um algoritmo de gradiente, disponível a partir do Agena Biosciences ('Linear Primer ajuste'), que ajusta para a massa e a concentração da primeira demão e o número total de primers na reação multiplexada (veja Tabelas 6 & 7). Introduza a massa UEP para cada primeira demão no campo UEP_MASS da folha ajuste Linear de Primer.
- Resina de purificação.
Nota: Sais de excesso agora podem ser removidos da reação com o uso de resina.- Adicione 16 μL de água desionizada aos poços da placa obtida, trazendo o volume na placa até 25 μL.
- Aplique a resina, geralmente de 6 mg de placa de resina covinha (adquirida separadamente), uniformemente para o prato todo. Deixe a resina secar na placa resina dimple por 20 min em temperatura ambiente antes de aplicar para a placa de reação. Após a adição da resina, girar a placa por 5 min à temperatura ambiente à mão ou com um misturador de suspensão a uma velocidade lenta (ex., 7,5 rpm).
Nota: Antes de carregar o analito de genotipagem para o chip de genotipagem, amostras e o layout de ensaio devem ser inseridos a interface do software. Isto pode ser conseguido usando o arquivo de resumo do projeto da ferramenta de desenho de ensaio.
- Medição em uma plataforma de espectrometria de massa.
- Centrifugue a placa a 3.200 x g por 5 min evitar a aplicação de resina para o chip de espectros de massa.
- Carregar o layout da placa de amostras para interface de software do sistema antes do executar.
Nota: Passo 2.6.3 só deve ser realizado por pessoal treinado. - Aplica a mistura de analito genotipagem da placa para o chip de genotipagem com um sistema de distribuição. Em seguida, carrega o chip no sistema de MALDI-TOF para gerar os espectros de massa da mistura da substância, que pode então ser interpretada com a ajuda da interface do software da plataforma.
Nota: O sistema gera os espectros de massa direcionando pulsos de luz UV em cada 'almofada', correspondente a um único poço da placa de genotipagem, do chip de espectros de massa. Este pulso resulta na ionização do analito e dessorção. Estas ionizado DNA moléculas são então impelidas para o topo do tubo de vácuo por um campo eletrostático de alta voltagem, separar íons mais leves, que viajam mais rápido e alcançar o detector em primeiro lugar, desde os íons mais pesados. O "tempo de voo" destes analitos é registrado pelo sistema, do qual a massa de cada fragmento de DNA pode ser determinada e, assim, a base de nucleotídeos presente no SNP pode ser inferida.
3. genotipagem dados
Nota: controle de qualidade e interpretação dos dados não são o foco deste trabalho de metodologia. No entanto, a seguir brevemente abrangerá interpretação de espectros de massa.
- Inspeção manual e controle de qualidade de espectros de massa.
Nota: Os espectros de massa cruas são gerados pelo sistema e analisados com o software, conforme listado na Tabela de materiais. Uma mistura gaussiana método de clustering é aplicada a essa saída para fazer chamadas de genotipagem probabilística.- Abra o software de análise. Selecione Typer Analyzer. No menu arquivo , selecione Abrir poços de arquivo e selecione o arquivo xml com os dados do espectro gerados na etapa 2.6.3. O nome do chip para a corrida deve ser visível, selecione-o e um painel de "semáforo" da placa de 384-bem será exibido com uma lista dos SNPs no selecionado bem. A partir daqui, selecione Chamar Cluster parcelas para exibir um gráfico de dispersão de pontos de dados para cada SNP.
Nota: É recomendável que um resultado de 'nenhuma chamada' ser objecto de SNPs de baixa intensidade. No software usado para os resultados representativos, sugere-se um cluster magnitude Cut-off de 5, que é maior do que padrão, rigoroso controle de qualidade. Essa configuração pode ser ajustada no campo de Magnitude Cutoff sob parâmetros no painel de Clusters de processamento de Post . Selecione a guia ferramentas para executar uma análise de cluster Autocluster . - Execute inspeção manual de genótipo chamadas, examinando as parcelas cartesiano no painel de processamento de Post. No painel de ensaio, selecione o SNP de interesse e clique na aba Post-Processing Clusters , uma trama de cluster com cluster de genótipo será visível com IDs de amostra e genótipos correspondentes para o SNP.
- Examinar os clusters de chamada genótipo e avaliar quão bem cada chamada individual de clusters com as outras chamadas para o SNP. O software fornece algumas linhas de fronteira sobre a trama para cada genótipo de orientação; Ver exemplo de um complô de aglomerado de chamadas de genótipo de um IL13 SNP (Figura 1). Se a chamada não cluster firmemente com outras chamadas e senta-se claramente fora de um cluster, ou se tem muito baixa intensidade, botão direito do mouse o datapoint e selecione Chamar de mudança para defini-lo manualmente para não chamar.
- Para garantir que dados de genotipagem de alta qualidade são usados para análise a jusante, exclua SNPs e indivíduos com taxas de chamada abaixo de um limite QC, por exemplo, 90%. Uma vez que foram feitas as adaptações adequadas para os dados de chamada, exporte os dados para aplicações estatísticas. O software usado para gerar os resultados representativos (listados na Tabela de materiais) isso é conseguido com a seleção de Dados de placa do menu Exibir e selecionar Salvar como.
- Abra o software de análise. Selecione Typer Analyzer. No menu arquivo , selecione Abrir poços de arquivo e selecione o arquivo xml com os dados do espectro gerados na etapa 2.6.3. O nome do chip para a corrida deve ser visível, selecione-o e um painel de "semáforo" da placa de 384-bem será exibido com uma lista dos SNPs no selecionado bem. A partir daqui, selecione Chamar Cluster parcelas para exibir um gráfico de dispersão de pontos de dados para cada SNP.
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Representative Results
Com o protocolo descrito acima, nós genótipo marca SNPs em todo o gene imune Th2 IL13 em uma coorte de alimentos alergia casos e controles9. Nós aplicamos análise de regressão logística, ajustado pela ascendência e outras covariáveis potenciais testar se as variantes genéticas dentro da região de interesse aumentaram o risco de alergias alimentares. Tabela 10 9 mostra que uma variante rs1295686 está associado com alergias alimentares desafio comprovada e confirmamos que esta associação em uma coorte de replicação usando o mesmo multiplexado abordagem de genotipagem. Uma meta-análise dos resultados das duas coortes forneceu fortes evidências da Associação de IL13 com FA (quadro 11)9. Nós geneticamente inferida e ajustado para a ascendência na análise usando um ascendência informativo SNP marcador painel, adaptado de um painel publicado10. Nós genótipo multiplexado o painel usando o mesmo ensaio de abordagem.
A variante associada, rs1295686, anteriormente foi identificada como um risco de asma loci11 e associada com outros parâmetros imunológicos alérgica12, sugerindo que pode ser um locus de risco de doença alérgica geral. Os próximos passos seria realizar estudos adicionais, tais como análise de expressão diferencial, mapeando interações físicas com um método de captura de cromatina, multa de mapeamento da região, e análise de haplótipo, PIN aponte a variante funcional e caracterizar a biologia por trás da Associação observada com alergias alimentares.
Figura 1: trama cartesiana de cluster para o SNP IL13 rs1295686. Clusters de amarelos representam chamadas de genótipo homozigoto para o alelo A, azul para o alelo G e verde para chamadas de heterozigotas. As chamadas de genótipo alguns que não em cluster com ambos os homozigotos ou heterozigotos espectros de massa foram definidas como "sem ligação".
Tabela 1: Sequências de Primer usadas para gerar os resultados representativos para IL13. A coluna de nome contém o ID do SNP, o número bem (como mencionado anteriormente, o número de "bem" refere-se a ID do ensaio multiplexado) e o tipo de primer (F para avançar, R para reverter e UEP para o primer de extensão). As próximas colunas contêm a sequência da primeira demão, o tamanho da primeira demão e o tipo de purificação. Deve notar-se que SPINK5 e um painel de marcadores informativos ascendência (AIM) eram genótipo usando o mesmo ensaio, embora estes resultados não são discutidos com os apresentado resultados representativos. SNPs terminando em _CEU e _CHB consulte SNPs objectivo para os europeus do norte de Utah e o chinês de Han em populações de Beijin, China do projeto 1000 genomas respectivamente. Clique aqui para baixar este arquivo.
| Master Mix | Plex baixa (SNPs ≤26) | Plex alta (> 26 SNP) | |||
| Reagente | Conc. de 5 µ l | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| Água (água deionizada) | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| Buffer de | 1 × (2 mM MgCl2) | 0,5 | 100 | 0,5 | 100 |
| MgCl2 | 2 mM | 0.4 | 80 | 0.4 | 80 |
| dNTPs | 500 ΜM | 0.1 | 20 | 0.1 | 20 |
| Primeira demão mistura * * | 100 nM | 1 | 200 * * | 1 | 200 * * |
| Taq polimerase | 0,5 U / 1 U | 0.1 | 20 | 0.2 | 40 |
| Total | 4 Μ l | 800 Μ l | 4 Μ l | 800 Μ l | |
| * * Já diluído com desionizada H20 conforme detalhado em 2.1.2 | |||||
Tabela 2: os reagentes e as concentrações necessárias para fazer a primeira demão do PCR amplificação mix. Os volumes de mestre mistura são dadas para 200 reações porque 400 (suficiente para cobrir uma placa de 384) não vai caber em um tubo de 1,5 µ l e, portanto, 2 x 200 deve ser feita em tubos separados. Volumes especificados sob Plex baixa devem ser usados se o ensaio multiplexado "bem" contém menor ou igual a 26 SNPs, se maior que 26 SNPs estão no uso bem o Plex elevado volumes.
| Condições de thermocycler |
| 94 ° C por 4 min |
| 45 ciclos de (94 ° C 20 s, 56 ° C 30 s, 72 ° C 1 min) |
| 72 ° C por 3 min |
| Espera de 4 ° C |
Tabela 3: Condições de Thermocycler para a amplificação do PCR.
| Master Mix | × 1 | × 410 |
| Água (água deionizada) | 1.53 | 627.3 |
| buffer de 10 × | 0.17 | 69,7 |
| Enzima SAP (1,7 U / µ l) | 0.3 | 123 |
| Total | 2 Μ l | 820 Μ l |
Quadro 4: os reagentes e concentrações para a mistura de mestre para a reação de SAP. Mestre mistura volumes são dadas para 410 reações cobrir uma placa com uma margem de erro de pipetagem de 384.
| Condições de thermocycler |
| 37 ° C por 40 min |
| 85 ° C por 5 min |
| Espera de 4 ° C |
Tabela 5: Thermocycler condições requeridas para a reação de SAP.
| # | Primers de extensão | Concentração de estoque original (µM) | Misc. | UEP_ MASSA | Concentração de reação de alvo (µM) | Concentração de piscina EXT Primer (µM) | Primer de estoque volume a ser adicionado ao Pool (µ l) |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0,560 | 5,36 | 16.09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | 5.76 | 17.29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0,648 | 6,21 | 18,62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0.690 | 6,61 | 19,82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0,707 | 6,77 | 20,30 | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6,93 | 20.80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7: 30h | 21.91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0.788 | 7,55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7,89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0.839 | 8,03 | 24,10 | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0.855 | 8.18 | 24.55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0,888 | 8,50 | 25.51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0.908 | 8,69 | 26,08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8.83 | 26,50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0.943 | 9,03 | 27,08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27.43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0.973 | 9.32 | 27,95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0.998 | 9,56 | 28.68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1,000 | 9,57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9,72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1.028 | 9.84 | 29.53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30,38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10,35 | 31,06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1.098 | 10.51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10,71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10.72 | 32.15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1,135 | 10.87 | 32.60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10,97 | 32.92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33.66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1.194 | 11.43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1.215 | 11.64 | 34.91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1,223 | 11,71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1.232 | 11,80 | 35.39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1.240 | 11.87 | 35.62 | |
| Volume de PCR grau Rnase livre H2O para ser adicionado Primer piscina (µ l) | 561.78 | ||||||
Quadro 6: as primeiras demão bem 1 ajustado usado para gerar os resultados representativos. Uma tabela de primers extensão ajustado pelo tamanho, incluindo a concentração alvo, a quantidade utilizada na piscina da primeira demão e concentração final para cada primeira demão na piscina cartilha para 1 bem. O volume de água necessário para perfazer o volume final é fornecido na parte inferior da tabela. O volume total da piscina cartilha era 1,5 mL.
| # | Primers de extensão | Concentração de estoque original (µM) | Misc. | UEP_ MASSA | Concentração de reação de alvo (µM) | Concentração de piscina EXT Primer (µM) | Primer de estoque volume a ser adicionado ao Pool (µ l) |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5.63 | 16,89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0,681 | 6,52 | 19,57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6.83 | 20.48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7.05 | 21.16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22.30 | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0.860 | 8.23 | 24.70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0,884 | 8.46 | 25,39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0.908 | 8,69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0.942 | 9,02 | 27.05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0.974 | 9,33 | 27.98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1,003 | 9.61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1.016 | 9,72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9.85 | 29.55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9.94 | 29.81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10.32 | 30.97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10.45 | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1.096 | 10,49 | 31,47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10,73 | 32.18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1,158 | 11.09 | 33.26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1,167 | 11,17 | 33.52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11,51 | 34,54 | |
| Volume de PCR grau Rnase livre H2O para ser adicionado Primer piscina (µ l) | 899.42 | ||||||
Tabela 7: bem 2 primeiras demão ajustadas usadas para gerar resultados representativos. Uma tabela de primers extensão ajustado pelo tamanho, incluindo a concentração alvo, a quantidade utilizada na piscina da primeira demão e concentração final para cada primeira demão na piscina para 2 bem da primeira demão. O volume de água necessário para perfazer o volume final é fornecido na parte inferior da tabela. O volume total da piscina cartilha era 1,5 mL.
| Master Mix | Plex baixa (1-18) | Plex alta (19-36) | ||
| Reagente | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| Água (água deionizada) | 0.7395 | 303.195 | 0,619 | 253.79 |
| Buffer de | 0.2 | 82 | 0.2 | 82 |
| Mistura de rescisão | 0.1 | 41 | 0.2 | 82 |
| Mistura de cartilha (LPA ajustado) | 0.94 | 385.4 | 0.94 | 385.4 |
| iPLEX enzima * | 0.0205 | 8.405 | 0,041 | 16.81 |
| Total | 2 Μ l | 820 Μ l | 2 Μ l | 820 Μ l |
Quadro 8: reagentes e concentrações para a reação de extensão master mix. Neste caso os volumes para baixo-Plex reações devem ser usados se há 18 ou menos SNPs no poço. Para SNPs 19 ou mais usar os volumes de reações de alta Plex. Isto é diferente para os requisitos de SNP do baixo-plex e alta-plex da amplificação do PCR master mix detalhada na tabela 2.
| Condições de thermocycler |
| 94 ° C por 30 s |
| 40 ciclos de (94 ° C 5 s, (5 ciclos de 52 ° C 5 s, 80 ° C 5 s)) |
| 72 ° C por 3 min |
| Espera de 4 ° C |
Tabela 9: Thermocycler condições para a reação de extensão
| Alimento alérgico casos controles alérgica de vs não-alimentares | |||||
| SNP | A1 | P | OU | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0,003 | 1,75 | 1.2 | 2.53 |
| rs2243297 | A | 0.13 | 2.1 | 0.8 | 5,51 |
| rs1295687 | G | 0,19 | 1.63 | 0,78 | 3,41 |
| rs2243211 | A | 0.22 | 1.45 | 0.8 | 2,64 |
| rs1295683 | T | 0.25 | 1.32 | 0,82 | 2.13 |
| rs2243248 | G | 0,51 | 1.21 | 0,69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0,51 | 1.19 | 0.7 | 2.02 |
| rs1800925 | T | 0.6 | 1.11 | 0.75 | 1.63 |
| rs3091307 | G | 0.62 | 1.1 | 0.75 | 1.6 |
Tabela 10: Variante rs1295686 do IL13 locus está associado com alergias alimentares desafio comprovada. Análise de regressão logística, ajustado pela ascendência, sexo e presença de eczema atópico, revelou que essa variante rs1295686 é associado com desafio comprovada alergia alimentar a coorte de descoberta (n = 367 casos e controles não-alérgicos 156). A coluna SNP lista os marcadores sendo examinados, a coluna A1 lista o alelo menor, usado como o alelo de referência para o teste de associação. A coluna P lista os P-valores a partir da análise de regressão, a coluna OR lista os rácios de probabilidades correspondente e L95 e U95 são os limites inferior e superiores do intervalo de confiança de 95% a partir da análise. Dados reproduziram de Ashely et al, 20179.
| R. análise de replicação: alimento alérgico casos controles alérgica de vs não-alimentares | B. Meta-análise – descoberta e replicação | ||||||||||
| SNP | A1 | OU | L95 | U95 | P | P | REACIONAMENTO | OU | OR(R) | Q | Eu |
| rs1295686 | A | 1.37 | 1,03 | 1.82 | 0,03 | 0,0005 | 0,0006 | 1.5 | 1.5 | 0.31 | 3.32 |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0,68 | 1.78 | 0.7 | 0.3 | 0.3 | 1.24 | 1.24 | 0,38 | 0 |
Quadro 11: Replicação em uma população independente confirma a associação entre IL13 rs1295686 variante e alergias alimentares desafio comprovada. Regressão logística, corrigida para componentes principais de ascendência, sexo e eczema atópico, numa população independente (n = 203 casos de alergia alimentar e 330 controles não-alérgicos) confirmou a associação entre a variante rs1295686 e alergias alimentares. Meta-análise foi então realizado, fornecendo o mais alto nível de evidência para uma associação entre o SNP e os resultados, com pouca evidência da heterogeneidade tamanhos em vigor entre as duas populações neste SNP. Aqui as colunas estão conforme a tabela 10, com reacionamento adicionais e valores OR(R) para a meta-análise de efeitos aleatórios modelo vs o modelo de efeitos fixos (P e ou). Q e eu somos o P-valor para o teste de Cochrane e o índice, respectivamente, ambos são medidas da heterogeneidade em tamanhos de efeito entre os estudos. Dados reproduziram de Ashely et al, 20179.
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Discussion
Aqui, demonstramos o método de genotipagem multiplexada utilizando espectrometria de massa. Os resultados representativos foram gerados usando PCR emparelhado com espectrometria de massa4 com química de ensaio listados na Tabela de materiais13MALDI-TOF. Com esta plataforma, geramos um total de 11.295 genótipos em 1.255 indivíduos para 9 SNPs dentro 40 h no laboratório.
Podemos ilustrar a utilidade da técnica em atender hipóteses genéticas por gerar e analisar dados SNP para o gene candidato IL13 numa descoberta clínica coorte phenotyped para alergias alimentares e com replicação independente. A plataforma é relativamente robusta para diminuir a qualidade do DNA e requer mínima matérias-primas, uma entrada de apenas 10 ng. Passos críticos no protocolo incluem o seguinte: Solucionando problemas de cuidado do processo de concepção do ensaio para garantir a máxima inclusão de SNP em ensaios os multiplexada, amplificação bem-sucedida das regiões alvo durante a amplificação do PCR, single de sucesso extensão de nucleotídeos durante a reação de extensão e o carregamento do layout da placa de ensaio e a amostra para o software de análise para que o software atribuir com precisão os dados de espectros de massa.
Como mencionado anteriormente, a ferramenta de projeto de ensaio é compatível com o uso do mouse e polimorfismos de bovinos, além para humanos. Para outros organismos tais como micróbio ou planta, "outros" podem ser selecionado no menu de "Organismo". No entanto, as etapas automatizadas para encontrar SNPs proximais e identificar áreas de cartilha ideal não estará disponíveis.
Durante o processo de design, se um SNP proximal está bloqueando a identificação de uma área ideal da primeira demão, um pode remover o SNP do projeto e selecione outro em LD alta (por exemplo, r2 = 1), ou optar por duas primeiras demão, um com a referência de design alelo do SNP e outra com o alelo alternativo, projetando uma primeira demão com o alelo comum ou mascarando o SNP com uma base universal (por exemplo, inosina). Se houver um problema com a identificação de um site exclusivo para o primer, um pode alterar as configurações de comprimento do amplicon para encontrar um local único. A configuração padrão é 80-120 bp, mas isto pode ser modificado da bp 60-400. No entanto, deve notar-se que se trabalhar com DNA degradado (por exemplo, do tecido FFPE), não é o ideal para aumentar o comprimento do amplicon.
Erros durante a etapa de concepção do ensaio da ferramenta podem incluir prendendor alta ou dímero da primeira demão potencial. Ambas as configurações podem ser relaxadas para tentar um hospede os desenhos. No entanto, é recomendável que os limites não estão relaxados abaixo de 0,8; Comece com 0,9 para ver se essa configuração é suficiente para resgatar os SNPs e reduzir para 0,8 somente se necessário. Nas configurações avançadas, é possível alterar o número de iterações de projeto (até 10) sob a guia Multiplex "4. Ensaios de design", bem como os critérios de seleção melhores iteração para Multiplex média maior ou Menor número rejeita por baixo Plex. Aumentando o número de iterações de projeto pode ser vantajoso, porque a ferramenta levará o SNP primeiro na ordem em que foram fornecidas e projetaremos um ensaio. Em seguida, ele testa se o SNP próxima é compatível para o mesmo ensaio multiplex. Assim, a ordem da matéria SNPs. Com múltiplas iterações opção selecionada, o software irá randomizar a ordem de SNPs e tente outras iterações. Isto pode aumentar o número de SNPs capazes de ser projetado para cada multiplex ou pode diminuir o número de SNP rejeita. No entanto, também virá com um custo de tempo, já que a ferramenta de design levará muito mais tempo nesta etapa.
Multiplexado genotipagem é uma abordagem rápida e acessível para investigação dos loci de interesse. O método é simplificado e permite a execução de aproximadamente 760 amostras de até 40-plex SNPs em 10 horas, permitindo que dezenas de milhares de genótipos a serem gerados em menos de um dia14. Os espectros de massa podem ser facilmente analisados com ferramentas fornecidas pela plataforma.
Algumas restrições para a plataforma incluem uma perda estimada de 5-10% de SNPs que irá falhar o processo de concepção do ensaio. Às vezes, isso pode ser corrigido pela seleção de uma marca alternativa ou proxy SNP. O banco de dados SNP anotação do Instituto Broad e Proxy Search (SNAP) é uma dessas ferramentas que facilita a identificação de proxy SNPs15. Outra limitação do sistema é que é uma plataforma de destino e, portanto, não permite a extensa descoberta de romance, como alcançado com abordagens de todo o genoma. Além disso, como a abordagem usa proxies marca-SNP para maximizar a cobertura de genes, estudos de mapeamento de multa, posteriormente, podem ser necessária para determinar a precisa variante causal.
Multiplexado genotipagem é ainda uma plataforma útil para o interrogatório de SNPs doença associada identificados em abordagens de estudo GWA ou hipótese conduzido exploração de gene candidato e caminho. Futuras aplicações para a plataforma são susceptíveis de ser novos usos para diagnóstico e triagem em campos como o cancro e virologia clínica. Em geral multiplexada genotipagem com espectrometria de massa é um método de médio-taxa de transferência rápido, econômico e confiável para loci de candidato de genotipagem.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores têm sem agradecimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
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