Summary
Målet med protokollen præsenteres her er at studere transkriptom svar på endosphere-isolerede Bacillus mycoides kartoffel root ekssudater. Denne metode fremmer identifikation af vigtige bakteriel gener involveret i plante-mikrobe interaktioner og er i princippet gælder for andre endofytter og planter, med mindre justeringer.
Abstract
Gavnlige plante-forbundet bakterier spille en vigtig rolle i at fremme vækst og forebyggelse af sygdomme i planter. Anvendelse af plante vækstfremmende rhizobacteria (PGPR) som biofertilizers eller biocontrol agenter er blevet et effektivt alternativ til brugen af konventionel gødning og kan øge høstudbyttet til en lav pris. Plante-mikrobe interaktioner afhænge vært plante-udskilles signaler og en reaktion hereon af deres tilknyttede bakterier. Men de molekylære mekanismer af hvordan gavnlige bakterier reagerer på deres tilknyttede plantebaserede signaler ikke er fuldt forstået. Vurdering af transkriptom svar af bakterier til roden ekssudater er en kraftfuld tilgang til at bestemme den bakterielle genekspression og forordning rhizospheric vilkår. Denne viden er nødvendig for at forstå de underliggende mekanismer involveret i plante-mikrobe interaktioner. Dette papir beskriver en detaljeret protokol for at studere transkriptom svar af B. mycoides EF18, en stamme isoleret fra endosphere kartoffel til kartoffel root ekssudater. Med hjælp fra de seneste høj overførselshastighed sekventering teknologi, kan denne protokol udføres i flere uger og producere massive datasæt. Først, vi samle root ekssudater under sterile forhold, hvorefter de er føjet til B. mycoides kulturer. RNA fra disse kulturer er isoleret ved hjælp af en fenol/chloroform metode kombineret med en kommerciel kit og underkastes kvalitetskontrol af et automatiseret elektroforese instrument. Efter sekvensering, dataanalyse er udført med web-baseret T-REx pipeline og en gruppe af varierende udtrykte gener er identificeret. Denne metode er et nyttigt værktøj til at lette nye opdagelser på de bakterielle gener involveret i plante-mikrobe interaktioner.
Introduction
Planter kan ekssudat op til 20% af kulstoffet fast under fotosyntesen gennem rødderne ind i rhizosfære1, dvs., den smalle zone af jorden i nærheden af rødderne. På grund af den højere næringsstoftilgængelighed er rhizosfære et velegnet levested for forskellige mikroorganismer, herunder plantevækst fremme bakterier. Roden ekssudater indeholder en række uorganiske forbindelser som ioner, uorganiske syrer, ilt og vand. Men størstedelen af roden ekssudater er dannet af organiske materialer, som kan opdeles i lavmolekylære forbindelser og høj molekylvægt forbindelser. De lavmolekylære forbindelser omfatter aminosyrer, organiske syrer, sukker, phenolforbindelser, fedtsyrer og en bred vifte af sekundære metabolitter. Høj molekylvægt forbindelser består af planteslim og proteiner2,3. Rhizosfære mikroorganismer kan bruge nogle af disse forbindelser som energikilde for vækst og udvikling. Roden ekssudater spiller en vigtig rolle i udformningen af Fællesskabets rhizobacterial da de anlæg-produceret forbindelser i ekssudater kan påvirke funktionsmåden for rhizosfære-associerede bakterier ved at påvirke udtryk af specifikke gener.
Forstå den bakterielle reaktion på rod ekssudater er et vigtigt skridt i afkodning plante-mikrobe interaktion mekanismer. Som den bakterielle svar på plante-mikrobe interaktioner er produktet af differential genekspression, kan det blive undersøgt af transkriptom analyse. Brug denne metode, identificeret tidligere undersøgelser flere vigtige gener involveret i plante-mikrobe interaktioner. I Pseudomonas aeruginosa, blev gener involveret i stofskiftet, chemotaxis og type II sekretion vist til at reagere på sukkerroer root ekssudater4. Fan mfl. 5 studerede transkriptom profilering af B. amyloliquefaciens FZB42 svar på majs root ekssudater. Deres resultater viser, at flere grupper af de gener, stærkt foranlediget af roden ekssudater, er involveret i stofskifteveje vedrørende næringsstofudnyttelse, chemotaxis, motilitet og ikke-ribosomale syntese af antimikrobielle peptider og polyketider.
Nøjagtigheden af disse undersøgelser bygger på indsamling af roden ekssudater. Selv om flere metoder har beskrevet samling af roden ekssudater til forskellige formål, de enten kræver avancerede instrumenter eller udføres ikke i velkontrollerede betingelser6,7,8. Desuden rhizosfære-hæmmende mikroorganismer kan påvirke root ekssudat sammensætning ved at påvirke plante celle membran permeabilitet og beskadige root væv, især i tilfælde af konsortier af mikroorganismer9. Når undersøger den mikrobielle reaktion på rod ekssudater, er det vigtigt at bruge veldefinerede betingelser for at undgå ændring af forbindelser med andre mikroorganismer10. Derudover kræves høj kvalitet RNA til RNA-seq baseret transkriptom undersøgelser. Men når der beskæftiger sig med ikke-model-bakterielle stammer, standardprotokoller eller kommercielle kits normalt har en lav effektivitet på grund af ukendte faktorer eller særlige vækstegenskaber.
Protokollen beskrevet her blev kontrolleret ved hjælp af B. mycoides, som er en gram-positive, spore-dannende bakterie af Firmicute phylum. Det er allestedsnærværende i rhizosfære af forskellige plantearter. Flere anlæg vækst fremme egenskaber er blevet rapporteret for denne art, herunder induktion af systematiske modstand (ISR) i sukkerroer11, hæmning af dæmpning-off patogenet Pythium for agurk12, samt kvælstof fiksering i solsikke rhizosfære13. Men, dens interaktion med en vært plante molekylære mekanismer er ikke godt undersøgt.
Formålet med forsøgene præsenteres her er at studere transkriptom svar på endosphere-isolerede B. mycoides kartoffel root ekssudater. Kort sagt, protokollen består af følgende trin: først, indsamle kartoffel root ekssudater under sterile forhold. Udtræk høj kvalitet RNA fra bakterieceller behandlet med root ekssudater. Det sidste trin er dataanalyse ved hjælp af web-baseret T-REx pipeline14. Denne protokol blev brugt til at identificere B. mycoides gener, der viser et skift i udtryk niveauer ved kontakt med root-ekssudater og dermed kan spille en vigtig rolle i plante-mikrobe interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. spire kartoffel i steriliseret betingelser
- Skyl kartofler overfladen med sterilt vand. Bade kartoffel i 70% ethanol og derefter i 3% natriumhypochlorit, i 5 min. Skyl det igen med sterilt vand for at fjerne enhver resterende natriumhypochlorit.
- Forberede de materialer, der kræves for spirende og voksende kartoffelknolde; sterilisere plastikpotter, engraftment kurve, vermiculit, og vand ved autoklavering dem ved 121 ° C i 20 min.
Bemærk: Sikre, at alle anvendte materialer autoklaverbart. Ellers bruge andre sterilisering metoder. - Sætte den overflade-steriliseret kartoffel i engraftment kurv, og placere denne i en autoklaveres pot indeholdende våde vermiculit.
- Holde gryden i et klima kammer på 24 ° C i tre uger. Sæt den på cyklusser af 16 h af lys (120 µmol m-2s-1) og 8 h af mørket. For at undgå mikrobiel kontaminering, skal du bruge en stor glas fiber boks til at dække puljen.
2. indsamling af kartoffel Root ekssudater
- Når skud spire, overførsel fyldt kurven med de hele kartofler i en steriliseret bægerglas med 150 mL autoklaveres ionbyttet vand, med kartoffel knolde placeret lige over vandoverfladen og rødder nedsænket i vandet (Se figur 1). Holde sætteplante i salen, klima, og brug samme indstillinger som før [24 ° C; cyklusser af 16 h af lys (120 µmol m-2s-1), 8 h mørkets].
- Fra den anden dag, indsamle vand indeholdende ekssudater og genopfylde bægerglasset med steril deioniseret vand. Udføre prøveudtagning hver dag indtil den syvende dag efter overførsel sætteplante.
- Gemme hver prøve separat ved 4 ° C. For hver prøve, sprede 100 µL på en Luria-Bertani (LB; 1% trypton, 0,5% gærekstrakt, 0,5% NaCl) agar plade til at kontrollere for mikrobielle forureninger. Kassér de forurenede prøver.
- Kombinere de indsamlede prøver af en sætteplante, og koncentrere dem ved frysetørring dem på 40 ° C til en endelige mængden af 150 mL.
3. voksende bakterier
- Streak en B. mycoides stamme fra en-80 ° C glycerol bestand på en LB-agar plade, og Inkuber plade ved 30 ° C natten over.
- Podes en LB flydende medium med en enkelt koloni fra pladen, og dyrke kulturen i en rystende inkubator ved 200 rpm natten over ved 30 ° C.
4. behandling og udtagning af bakterier
- Hvis du vil sammenligne vækstkurven af bakterier behandlet med root ekssudater til en negativ kontrol, forberede en serie af beholdere indeholdende 50 mL af LB flydende medium. 0,5 mL overnight bakteriekulturen tilsættes til alle kolber, og tilføje enten 0%, 5%, 10% eller 15% (v/v) roden ekssudat eller sterilt ionbyttet vand til medium, henholdsvis.
- Anvende en kultur med deioniseret vand i stedet for root ekssudater som kontrol. Måle den optisk tæthed på 600 nm (OD600) hver 1 h bagefter. Generere en vækstkurve ved at plotte OD600 værdierne kontra tid.
Bemærk: Vi så, at 10% af rod ekssudater ikke påvirke væksten af B. mycoides (Se figur 2); Dette forhold blev brugt til RNA-seq eksperimenter. - Fortynde en overnight B. mycoides kultur med 90 mL pre varmede LB medium til den indledende OD600 af ~ 0,05 i en 300 mL kolbe. Der tilsættes 10 mL af roden ekssudater til kultur og inkuberes ved 30 ° C i 1 time.
- Bruge en 10 mL sterilt deioniseret vandbehandling som et kontrolelement. Indsamle celler fra kulturen ved centrifugering ved 9.000 x g i 2 min. ved 4 ° C. Supernatanten, og straks fryser pellet i flydende kvælstof, så Opbevar den ved-80 ° C indtil brug.
5. RNA isolering
Bemærk: Før du starter isolationen, forberede workbench, stativer og pipetter ved at rense dem med en RNase dekontaminering løsning (Se Tabel af materialer). Bære handsker på alle tid, og sørg for, at alle rør, tips og løsninger er RNase-fri. Altid opbevare prøver på is, når det er muligt.
- Tilsættes 0,1% (v/v) i diethylether pyrocarbonate (DEPC) til ultrarent vand (100 µL af DEPC pr. 100 mL opløsning), bland det godt, og holde det ved rumtemperatur natten over. Autoklave blanding til at inaktivere DEPC efter natten behandling. Brug denne DEPC-behandlet ultrarent vand til at tilberede TE buffer [10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA] og en 10% SDS (w/v) opløsning.
- Tø celle pellets på isen og suspendere hver i 400 µL af TE (DEPC) buffer. Overføre suspensioner til 2 mL skruelåg rør.
- Premix 300 µL chloroform-isoamyl alkohol (24:1 v/v) og 300 µL af phenol (syre phenol, RNA grade), og lad blandingen stå i 5 min. Tage 500 µL af den organiske øverste fase at tilføje til de resuspenderede celler. Derefter tilsættes 50 µL af 10% SDS og 0,5 g af glasperler (0,5 µm) ind i røret.
- Luk hætten fast og placere røret i en perle-mill homogeniseringsapparat (Se Tabel af materialer). Udføre en 3 × 45 s puls homogenisering med et interval på 1 min på is.
- Centrifugeres prøver i 10 min på 11.000 x g (4 ° C), og overfør den øverste fase til en ny tube.
- Tilsættes 500 µL chloroform-isoamyl alkohol (24:1) at den øverste fase fra trin 5.5 og centrifugeres blandingen i 5 min på 11.000 x g (4 ° C).
Bemærk: Følgende trin blev ændret fra producentens instruktion af en kommerciel glas fiber filter-baserede RNA isolering kit (Se Tabel af materialer). - Overføre 500 µL af den øverste fase til en frisk tube, tilføje 2 bind (1 mL) af en lysis/binding buffer og bland det af pipettering op og ned.
- Kombiner filter og indsamling rør (fra RNA isolering kit) og afpipetteres blanding fra trin 5.7 til filter tube. Centrifugeres rør til 15 s på 8.000 x g og kassér gennemstrømnings-.
- Forberede 1,5 mL microcentrifuge rør med 100 µL af DNase buffer, 10 µL af DNase jeg, og 5 µL af en RNase inhibitor (Se Tabel af materialer). Tilføje fremstillet opløsning mix på filteret filter røret, og Inkuber det i 20-30 min. ved 15-25 ° C.
- Udfør trinene vask efter fabrikantens anvisninger. Bruge 50 µL af en eluering buffer for at eluere RNA.
- Gemme den eluted RNA ved-80 ° C, og sætte en plastik paraffin film udenom. På samme tid, skal du overføre et par microliters af prøven til et 1,5 mL microcentrifuge rør til at udføre en kvalitetskontrol.
6. RNA kvalitetskontrol og sekventering
- Spørg RNA Spektrofotometer microvolume.
Bemærk: Absorbans nøgletal på 260/280 skal være over 1,8, og nøgletal på 260/230 skal være over mindst 1,8, helst over 2,0. - Kør den oprensede RNA i en automatiseret elektroforese instrument bruger anbefale RNA analyse kit (Se Tabel af materialer); RNA integritet nummer (RIN) skal være mindst over 7 til at fortsætte.
- Bruge et samlet beløb på 3 µg af RNA pr. prøve til at generere biblioteker med en RNA-Seq bibliotek forberedelse kit (Se Tabel af materialer) efter fabrikantens anvisninger.
Bemærk: Bibliotek forberedelserne blev sekventeret på en høj overførselshastighed sekventering platform og parret ende læser blev genereret.
7. dataanalyse ved hjælp af Web-baseret Pipeline T-REx
- Udføre en kvalitet filtrering ved hjælp af FASTX-Toolkit version 0.0.13 (Jytte kvalitetsresultater > 20). Trim de rå RNA-Seq læsninger fra adapter sekvenser med værktøjet Trimmomatic.
Bemærk: Alle de efterfølgende analyser blev baseret på ren data med høj kvalitet. - Download B. mycoides ATCC 6462 NCBI genom database (NCBI tiltrædelse No.: CP009692.1) og bruge det som en reference genom for kortlægning af de rene læsninger ved hjælp af Bowtie2/2.2.3.
- Brug HTSeq v0.6.1 til at tælle læser numrene tilknyttet hvert gen og læser per kilobase af udskrift pr. million tilknyttede læser (RPKM) i hvert gen baseret på længden af genet og læser Greven knyttet til dette gen.
- Til analyse af data af T-REx pipeline, bruge tabellen RPKM som input, samt tre beskrivende filer: (i) en faktorer fil til at beskrive eksperimentet i faktorer, (ii) en kontraster fil til at definere, hvilke faktorer vil blive sammenlignet for differential genekspression , og (iii) en klasse-fil til at beskrive grupper af gener af interesse.
Bemærk: De beskrivende filer er in.txt format. Eksempler kan findes på websiden af T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). En detaljeret instruktion til dataanalyse ved hjælp af T-REx kan findes i en tidligere publikation af de Jong et al. 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plante-forbundet mikroorganismer kan positivt påvirke planternes vækst og sundhed. Men mekanismerne i det komplekse samspil mellem planter og deres mikrobielle symbionter er ikke fuldt forstået. Roden ekssudater spiller en vigtig rolle i reguleringen af rhizobacterial aktivitet og adfærd, og det er generelt postuleret at mikrobiel kolonisering af rødder, starter med tiltrækning af mikrober til roden ekssudater. Formålet med dette arbejde var at undersøge transkriptom svar af rhizobacterial B. mycoides til kartoffel root ekssudater. For at opfylde dette, var kartoffelknolde overflade steriliseret og spiret i autoklaveres vermiculit. Derefter blev rod ekssudater indsamlet som vist i figur 1. For at udelukke muligheden for root ekssudater påvirker bakterievækst, op til 15% af roden ekssudater blev føjet til B. mycoides kultur, og ingen ændring i vækst, der blev fundet under den måling tid (figur 2). Således var gen expression ændringer observeret i denne undersøgelse ikke sandsynligt forårsaget af vækst-relaterede effekter.
Efter samling, roden ekssudater blev føjet til B. mycoides kultur i forholdet 10% (v/v), og den bakterielle total RNA blev isoleret som tidligere beskrevet. RNA blev derefter underkastes en kvalitetskontrol af automatiserede elektroforese instrument som resultaterne er vist i figur 3. Figur 3A og 3B repræsenterer RNA isoleret fra B. mycoides behandlet med root ekssudater, og figur 3 c og 3D repræsenterer RNA isoleret fra kontrolgruppen. Alle prøver scorede en RIN værdi over 9 med to klare bands svarende til 16S og 23S RNA underenheder, demonstrerer, at høj kvalitet RNA blev opnået ved denne protokol.
Efter bibliotek forberedelse, blev par-ende læser opnået med en høj overførselshastighed sekventering platform. De rå RNA-Seq læser blev trimmet fra adapter sekvenser og kortlagt mod reference genomet sekvens. Af de resulterende data blev tabellen RPKM genereret. Transkriptom analyse blev udført med T-REx-rørledningen. Forholdet mellem intensitet plot af alle varierende udtrykte gener er vist i figur 4. Sammenlignet med en kontrol induceret tilsætning af kartoffel root ekssudater 715 gener skal udtrykkes varierende. Af dem, 408 gener var upregulated og 307 gener var downregulated15. Den relative ændring af nogle af generne med ændrede udtryk er angivet i tabel 1.
Figur 1: proces ordningen for indsamling af kartoffel root ekssudater. De anvendte materialer er autoklaveres og spiring er udført i et klima kammer. Vaske kartoffel knolde med steriliseret vand, og bad det i 2-3% NaOCl for 5 min. bad det i 75% ethanol til en anden 5 min. sted kartoflen i en autoklaveres kurv og sætte det i en gryde med våde vermiculit. Dyrke kartofler i et klima kammer for 3-4 uger, og derefter overføre kurv med kartoffel sætteplante til et bægerglas. Indsamle root ekssudater hver dag og genopfylde bægerglasset med steriliseret vand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vækstkurven af B. mycoides med forskellige koncentrationer af kartoffel root ekssudater. Stamme EF18 blev dyrket i en lage LB med tilsætning af kartoffel root ekssudater eller sterile H2O. OD600 blev målt hver 1 h og afsættes mod tiden. Alle grupper viser en lignende vækstmønster, der angiver, at op til 15% af roden ekssudater tilføjelse har ingen væsentlig indvirkning på B. mycoides vækst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: RNA kvalitetskontrol af automatiserede elektroforese instrument. A og B repræsenterer RNA isoleret fra B. mycoides behandlet med root ekssudater og C og D repræsenterer RNA isoleret fra kontrolgruppen. Alle RNA prøver viser to klare bands svarende til 23S og 16S rRNA og en svag 5S rRNA band. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: forholdet intensitet plot til at visualisere differential genekspression RNA-seq prøver af B. mycoides svar på kartoffel root ekssudater. Tallet er automatisk genereret af T-REx. X-aksen repræsenterer gen expression niveau, og y-aksen repræsenterer log2-omdannet fold ændringen. Generne at være op- og downregulated har positive og negative log2 ratio værdier. Prikker i området stribet angive gener, der ikke er signifikant over - eller under-udtryk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Gen tag | Strand | Fold ændring | Anmærkning |
| BG05_RS09165 | + | 3.3 | multidrug efflux protein |
| BG05_RS20930 | + | 25,3 | membran protein |
| BG05_RS10935 | + | 23.3 | fase III sporulering protein annonce |
| BG05_RS08990 | - | 11.8 | sporulering protein |
| BG05_RS16405 | + | 3.9 | IclR familie transcriptional regulator |
| BG05_RS24905 | - | 3 | tryptofan syntase subunit alpha |
| BG05_RS24920 | - | 2.3 | indol-3-glycerol phosphat synthetase |
| BG05_RS22255 | - | 27 | acetolactatsyntase syntase |
| BG05_RS22250 | - | 6.5 | ketol-syre reductoisomerase |
| BG05_RS22265 | - | 26.4 | forgrenede amino syre aminotransferase |
| BG05_RS18715 | - | 2.8 | pullulanase |
| BG05_RS18040 | + | -9.1 | spiring protein YpeB |
| BG05_RS16930 | + | -4.2 | sukker ABC transporter ATP-bindende protein |
| BG05_RS27345 | + | -2.9 | Stasi transporter |
| BG05_RS19555 | - | -3.3 | PTS cellobiose transporter subunit IIB |
| BG05_RS24345 | - | -2.7 | putrescine importør |
| BG05_RS22525 | - | -12.4 | cardiolipin syntase |
| BG05_RS15225 | - | -3.3 | membran protein |
| BG05_RS18475 | + | -5.7 | membran protein |
| BG05_RS19095 | + | -2.1 | spiring protein |
Tabel 1: Liste over varierende udtrykte gener af en rod ekssudater-behandlede gruppe sammenlignet med en kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plante-mikrobe interaktioner er blevet hypotese at være bestemt af en fint afstemt balance mellem bakterier og planter. Sådanne interaktioner er meget komplekse og vanskelige at studere i et naturligt system, som omfatter forskellige mikrobielle arter, potentielt handler som konsortier. Dette papir beskriver en forenklet protokol for at studere den bakterielle reaktion på rod ekssudater under velkontrollerede omstændigheder. Transkriptom profil af rhizobacteria ved udsættelse for root ekssudater, giver detaljerede oplysninger om bakteriel tilpasning til rhizosfære niche. Denne rod ekssudater samling protokol kræver ikke komplicerede procedurer og specialudstyr. Men alle procedurer skal gennemføres under strengt sterile forhold og en sterilitet kontrol skal medtages. Vi anbefaler vokser flere kartoffelknolde parallelt og kassere forurenet dem. Kan foretages ændringer i denne protokol, hvis andre plantearter er ved at blive undersøgt. Det er vigtigt at bruge en passende metode til at sterilisere nogen frø/knolde, fordi de kan variere i tolerance over for desinfektionsmidler anvendes.
Når roden ekssudater er opnået, skal høj kvalitet RNA være isoleret fra de bakterieceller. Forskellige reagenser og standardprotokoller, der primært er baseret på fenol/chloroform eller TRIzol metode er tidskrævende16. De kommercielle kits er primært designet til modelorganismer men gælder mindre for andre. Protokollens RNA isolering, der kombinerer metoden fenol/kloroform og en RNA isolering kit overvinder ulemperne ved disse metoder. Desuden er en perle-slå skridt medtaget for at homogenisere B. mycoides celler, der typisk samlet i de planktoniske kultur. Potentielle DNA forurening er fjernet ved en ekstra inkubering med DNase før eluering. Høj RIN antallet indebærer isolering af intakt RNA. Denne protokol er således især effektive og tidsbesparende for miljømæssige bakteriestammer.
Efter RNA sekventering, dataanalyse er udført med T-REx, en web-baseret statistiske analyse pipeline til RNA-seq gen expression data14. Denne rørledning er brugervenlig, især for biologer uden omfattende Bioinformatik viden. Inputfilen er RNA udtryk niveau rådata, såsom RPKM, fragmenter pr. kilobase pr. million tilknyttede læser (FPKM), tæller pr. million tilknyttede læser (CPM) eller andre gen expression enheder. Sådanne gen expression værdi filer kan være genereret af tilgængelige værktøjer herunder SAMtools17, BEDtools18, og NGS-Trex19. For at køre RNA-seq analyse, er tre andre input filer nødvendige. Disse filer bruges til at definere de faktorer, der beskriver eksperimenterne og replikater, sammenligninger mellem de forskellige forsøgsbetingelser, og grupper af gener af interesse. Når input-filer er uploadet, tager analyse-processen kun et par minutter.
Flere varierende udtrykte gener af B. mycoides EF18, når de behandles med root ekssudater, er angivet i tabel 1. Blandt dem, er udtryk for flere gener kodning Membranproteiner ændret. Gener relateret til sporulering eller spiringsproces udtrykkes varierende. Udtryk af gener involveret i sporulering også ændringer i B. subtilis når Co kulturperler med risplanter, fordi roden ekssudater levere energi, der kræves for den dynamiske vækst af bakterielle celler18. Udtryk for IclR transcriptional regulator, der er relateret til multidrug resistance og nedbrydning af aromatiske forbindelser i jord bakterier, er upregulated. IclR sletning stamme af rhizobacteria Klebsiella pneumoniae er faldet mineralsk fosfat oploesning, sammenlignet med vildtype stamme19. Flere gener relateret til aminosyrer metabolismen og syntese stimuleres, mens gener involveret i sukker transport herunder en cellobiose PTS transporter er downregulated. Dette tyder på, at stamme EF18 kan have en metabolisk præference for aminosyrer over sukker i rhizosfære. Funktionen af de ændrede gener kan være yderligere undersøgt i situ ved at gøre knockout eller overekspression mutanter. I Resumé, protokollen beskrevet her giver mulighed for en hurtig identifikation af et stort antal potentielt vigtige bakteriel gener involveret i plante-mikrobe interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Jakob Viel for hans nyttige kommentarer og forslag. Vi takker også Anne de Jong for hans hjælp i bioinformatik analyse. Yanglei Yi og Zhibo Li understøttes af Kina stipendium Rådet (CSC). Vi takker NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) for deres finansielle støtte til OPK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. eZ., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
