Summary
L'obiettivo del protocollo presentato qui è quello di studiare la risposta di trascrittomica di endosphere-isolato Bacillus mycoides di essudati di patata. Questo metodo facilita l'identificazione di importanti geni batterici coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi ed è in linea di principio applicabile ad altri endofiti e piante, con piccoli aggiustamenti.
Abstract
Batteri benefici associati pianta giocano un ruolo importante nel promuovere la crescita e prevenire la malattia in piante. L'applicazione della pianta dipromozione rhizobacteria (PGPR) come agenti di biocontrollo e concime biologico è diventato una valida alternativa all'uso di fertilizzanti convenzionali e può aumentare la produttività delle colture a basso costo. Interazioni piante-microrganismi dipendono da segnali di pianta-secreto di host e una reazione hereon dai loro batteri associati. Tuttavia, i meccanismi molecolari di batteri benefici come rispondono a loro associati pianta-derivati segnali completamente non sono capiti. Valutazione della risposta di trascrittomica di batteri di essudati radicali è un approccio potente per determinare l'espressione di gene batterico e regolamento alle condizioni rizosferici. Tale conoscenza è necessaria comprendere i meccanismi coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per studiare la risposta di trascrittomica di b. mycoides EC18, uno sforzo isolato dalla endosphere di patata, di essudati di patata. Con l'aiuto di recente tecnologia di sequenziamento ad alta velocità, questo protocollo può essere eseguito in diverse settimane e produrre grandi set di dati. In primo luogo, che raccogliamo gli essudati in condizioni sterili, dopo di che vengono aggiunti al b. mycoides culture. il RNA da queste culture è isolato usando un metodo di fenolo/cloroformio, combinato con un kit commerciale e sottoposti a controllo di qualità di uno strumento automatizzato di elettroforesi. Dopo l'ordinamento, l'analisi dei dati viene eseguita con la pipeline di T-REx basata sul web e viene identificato un gruppo di geni differenzialmente espressi. Questo metodo è uno strumento utile per facilitare nuove scoperte sui geni batterici coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi.
Introduction
Piante possono essudato fino al 20% del carbonio fissato durante la fotosintesi attraverso le radici nella rizosfera1, vale a dire, la zona stretta del terreno vicino alle radici. A causa di una maggiore disponibilità dei nutrienti, la rizosfera è un habitat adatto per diversi microrganismi, inclusi batteri promuovere crescita di pianta. Gli essudati contengono una gamma di composti inorganici come ioni, acidi inorganici, ossigeno e acqua. Tuttavia, la maggior parte degli essudati radice è formata da materiali organici, che possono essere suddivisi in composti a basso peso molecolare e ad alto peso molecolare, composti. I composti a basso peso molecolare includono gli aminoacidi, acidi organici, zuccheri, composti fenolici, acidi grassi e una matrice di metaboliti secondari. I composti ad alto peso molecolare costituiti da mucillagini e proteine2,3. Microrganismi della rizosfera possono utilizzare alcuni di questi composti come fonte di energia per la crescita e lo sviluppo. Gli essudati giocano un ruolo importante nel plasmare la comunità di rizobatterica, poiché i composti pianta-prodotta in essudati possono influenzare il comportamento dei batteri associati rizosfera, influenzando l'espressione di specifici geni.
Comprensione della risposta batterica alla essudati è un passo fondamentale nel decifrare i meccanismi di interazione pianta-microbo. Come la risposta batterica alle interazioni piante-microrganismi è il prodotto dell'espressione genica, possono essere studiato mediante analisi del trascrittoma. Utilizzando questo metodo, gli studi precedenti identificati diversi importanti geni coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi. In Pseudomonas aeruginosa, geni coinvolti nel metabolismo, chemiotassi e tipo di secrezione di II sono stati indicati per rispondere a barbabietola da zucchero radice essudati4. Ventilatore et al. 5 ha studiato la profilazione di trascrittomica di b. amyloliquefaciens FZB42 in risposta a mais essudati. I risultati ottenuti mostrano che, dei geni fortemente indotti dagli essudati, diversi gruppi sono coinvolti nelle vie metaboliche relative all'utilizzazione dei nutrienti, chemiotassi, motilità e non-ribosomal sintesi di peptidi antimicrobici e polichetidi.
La precisione di questi studi si basa sulla raccolta di essudati radicali. Anche se diversi metodi sono descritti la raccolta di essudati radicali per scopi diversi, richiedono strumenti sofisticati o non vengono eseguiti in condizioni ben controllate6,7,8. Inoltre, inibendo la rizosfera microrganismi possono influenzare composizione principale dell'essudato che interessano le permeabilità della membrana cellulare di pianta e danneggiare i tessuti della radice, particolarmente nel caso di consorzi di microrganismi9. Quando si esamina la risposta microbica di essudati radicali, è importante utilizzare condizioni ben definite al fine di evitare l'alterazione dei composti da altri microrganismi10. Inoltre, RNA di alta qualità è necessario per RNA-seq basati su studi di trascrittoma. Tuttavia, quando si tratta di ceppi non modello-batteriche, i protocolli standard o kit commerciali di solito hanno una bassa efficienza a causa di fattori sconosciuti o proprietà speciale di crescita.
Il protocollo descritto qui è stato verificato utilizzando b. mycoides, che è un batterio gram-positivo, sporigeni del phylum Firmicute. È onnipresente nella rizosfera di varie specie vegetali. Diverse proprietà di promuovere crescita pianta sono state segnalate per questa specie, tra cui l'induzione di resistenza sistematica (ISR) nella barbabietola da zucchero11, inibizione del attenuante-fuori patogeno Pythium per cetriolo12, così come azoto fissazione del girasole rizosfera13. Tuttavia, i meccanismi molecolari della sua interazione con una pianta ospite non sono ben studiati.
L'obiettivo degli esperimenti presentati qui è quello di studiare la risposta di trascrittomica di endosphere-isolato b. mycoides di essudati di patata. In breve, il protocollo prevede i passaggi seguenti: in primo luogo, raccogliere essudati di patata in condizioni sterili. Quindi, estrarre RNA di alta qualità da cellule batteriche trattate con essudati. Il passo finale è l'analisi dei dati utilizzando il web-based T-REx pipeline14. Questo protocollo è stato usato per identificare i geni di b. mycoides che mostrano un cambiamento nei livelli di espressione al contatto con essudati radicali- e quindi potrebbero giocare un ruolo importante nelle interazioni piante-microrganismi.
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Protocol
1. patate in condizioni sterili di germinazione
- Sciacquare la superficie di patate con acqua sterile. Fare il bagno la patata in etanolo al 70% e poi in 3% di ipoclorito di sodio, per 5 minuti ciascuno. Risciacquare con acqua sterile per rimuovere qualsiasi residuo di ipoclorito di sodio.
- Preparare i materiali necessari per germinare e crescere di tuberi di patata; sterilizzare i vasi di plastica, cesti di attecchimento, vermiculite e acqua in autoclave a 121 ° C per 20 min.
Nota: Assicurarsi che tutti i materiali utilizzati sono autoclavabili. In caso contrario, utilizzare altri metodi di sterilizzazione. - Mettere la patata di superficie-sterilizzato nel cesto attecchimento e questo posto in una pentola in autoclave con vermiculite umida.
- Mantenere il piatto in una camera climatica a 24 ° C per tre settimane. Impostarlo su cicli di 16 h di luce (120 µmol m-2s-1) e 8 ore di buio. Per evitare contaminazioni microbiche, è possibile utilizzare una casella di fibra di vetro di grandi dimensioni per coprire la pentola.
2. raccolta di essudati di patate
- Quando i germogli germoglio, trasferimento il cestello con la patata intera in un becher sterilizzato riempito con 150 mL di acqua deionizzata in autoclave, con la patata tuberi posizionati appena sopra la superficie dell'acqua e le radici immerse nell'acqua (Vedi Figura 1). Tenere la piantina della camera climatica e utilizzare le stesse impostazioni come prima [24 ° C; cicli di 16 h di luce (120 µmol m-2s-1), 8 h delle tenebre].
- Dal secondo giorno, raccogliere l'acqua contenente gli essudati e riempire il becher con acqua deionizzata sterile. Eseguire il campionamento ogni giorno fino al settimo giorno dopo il trasferimento il semenzale.
- Conservare ogni campione separatamente a 4 ° C. Per ogni campione, diffondere 100 µ l su una Luria-Bertani (LB; tryptone di 1%, 0,5% di Estratto di lievito, 0.5% NaCl) piastra di agar per verificare contaminazioni microbiche. Scartare i campioni contaminati.
- Combinare i campioni raccolti di una piantina e concentrarle di liofilizzazione li a-40 ° C ad un volume finale di 150 mL.
3. aumento dei batteri
- Inoculare un ceppo di b. mycoides da uno stock di glicerolo di-80 ° C su una piastra di agar LB ed incubare la piastra a 30 ° C durante la notte.
- Inoculare un terreno liquido LB con una singola Colonia dalla piastra e far crescere la cultura in un incubatore d'agitazione a 200 giri/min durante la notte a 30 ° C.
4. trattamento e campionamento dei batteri
- Per confrontare la curva di crescita dei batteri trattati con essudati radicali di un controllo negativo, preparare una serie di recipienti contenenti 50 mL di terreno liquido LB. Aggiungere 0,5 mL di coltura batterica durante la notte per tutte le beute e aggiungere 0%, 5%, 10%, o essudato radice 15% (v/v) o acqua deionizzata sterile al medium, rispettivamente.
- Utilizzare una lingua con acqua deionizzata invece di essudati radicali come controllo. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) ogni 1h in seguito. Generare una curva di crescita tracciando i valori di600 OD rispetto al tempo.
Nota: Abbiamo visto che il 10% degli essudati radice non ha influito la crescita di b. mycoides (Vedi Figura 2); Questo rapporto è stato usato per esperimenti di RNA-seq. - Diluire una cultura b. mycoides pernottamento con 90 mL di pre-riscaldato LB medium per l'iniziale OD600 di ~ 0.05 in un matraccio da 300 mL. Aggiungere 10 mL di essudati radicali alla cultura e incubare a 30 ° C per 1 h.
- Utilizzare un trattamento di 10 mL di acqua deionizzata sterile come un controllo. Raccogliere le cellule dalla coltura mediante centrifugazione a 9.000 x g per 2 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e immediatamente congelare il pellet in azoto liquido, quindi conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.
5. isolamento di RNA
Nota: Prima di iniziare l'isolamento, preparare il banco da lavoro, scaffali e pipette di pulirli con una soluzione di decontaminazione di RNAsi (Vedi Tabella materiali). Indossare guanti in ogni momento e assicurarsi che tutti i tubi, suggerimenti e soluzioni sono RNAsi-libera. Tenere sempre i campioni su ghiaccio quando possibile.
- Aggiungere 0,1% (v/v) di pirocarbonato dietilico (DEPC) per acqua ultrapura (100 µ l di DEPC per 100 mL di soluzione), mescolare bene e tenerlo a temperatura ambiente durante la notte. Sterilizzare in autoclave la miscela per inattivare il DEPC dopo trattamento durante la notte. Utilizzare questa acqua ultrapura trattata con DEPC per preparare il buffer di TE [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] e una soluzione di 10% SDS (w/v).
- Scongelare il pellet cellulare sul ghiaccio e sospendere ciascuno in 400 µ l di tampone di TE (DEPC). Trasferire le sospensioni in provette 2 mL tappo a vite.
- Premix 300 µ l di cloroformio-alcool isoamilico (24:1 v/v) e 300 µ l di fenolo (acido fenolo, grado di RNA) e lasciar riposare per 5 min. Prendere 500 µ l di fase organica superiore per aggiungere a cellule del sedimento. Quindi aggiungere 50 µ l di 10% SDS e 0,5 g di perle di vetro (0,5 µm) nella provetta.
- Chiudere saldamente il tappo e inserire il tubo in un omogeneizzatore del branello-mulino (Vedi Tabella materiali). Eseguire un'omogeneizzazione di impulso di s 3 × 45 con un intervallo di 1 min sul ghiaccio.
- Centrifugare i campioni per 10 min a 11.000 x g (4 ° C) e trasferire la fase superiore in una nuova provetta.
- Aggiungere 500 µ l di cloroformio-alcool isoamilico (24:1) per la fase superiore dal passaggio 5.5 e centrifugare la miscela per 5 min a 11.000 x g (4 ° C).
Nota: I passaggi seguenti sono stati modificati da istruzioni del fabbricante, di un isolamento di RNA basati sui filtri di vetro commerciale fibra kit (Vedi Tabella materiali). - Trasferire 500 µ l della fase superiore in una nuova provetta, aggiungere 2 volumi (1 mL) di un buffer di lisi/associazione e mescolare pipettando su e giù.
- Combinare i tubi filtro e raccolta (dal kit di isolamento del RNA) e dispensare la miscela dal punto 5.7 al tubo filtro. Centrifugare le provette per 15 s a 8.000 x g e scartare il flusso continuo.
- Preparare 1,5 mL microcentrifuga con 100 µ l di tampone di DNasi, 10 µ l di dnasi I e 5 µ l di un inibitore di RNAsi (Vedi Tabella materiali). Aggiungere il mix di soluzione preparata sul filtro del tubo filtro e incubare per 20-30 minuti a 15-25 ° C.
- Eseguire la procedura di lavaggio secondo le istruzioni del fabbricante. Utilizzare 50 µ l di un tampone di eluizione per eluire il RNA.
- Salvare il RNA eluito a-80 ° C e mettere una pellicola di plastica paraffina intorno ad esso. Allo stesso tempo, è possibile trasferire pochi microlitri di campione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per eseguire un controllo di qualità.
6. sequenziamento e controllo di qualità RNA
- Verifica il RNA con uno spettrofotometro di microvolume.
Nota: Il rapporto di assorbanza a 260/280 dovrebbe essere sopra 1.8, e rapporti a 260/230 dovrebbero essere sopra almeno 1.8, preferibilmente sopra 2.0. - Esegui il RNA purificato in uno strumento di elettroforesi automatizzata utilizzando l'analisi del RNA di raccomandare kit (Vedi Tabella materiali); il numero di integrità di RNA (RIN) deve essere almeno superiore a 7 per procedere.
- Utilizzare un importo complessivo di 3 µ g di RNA per campione per generare librerie con una preparazione di RNA-Seq libreria kit (Vedi Tabella materiali) seguendo le raccomandazioni del produttore.
Nota: Le preparazioni di libreria sono state sequenziate su una piattaforma di sequenziamento ad alta produttività e fine accoppiato letture sono state generate.
7. analisi dei dati utilizzando il Web-Based Pipeline T-REx
- Eseguire un filtro di qualità usando il FASTX-Toolkit versione 0.0.13 (Phred punteggi di qualità di > 20). Tagliare le letture di RNA-Seq crude delle sequenze di adattatore con lo strumento Trimmomatic.
Nota: Tutte le analisi a valle erano basate su dati puliti con alta qualità. - Scaricare il database di genoma di b. mycoides ATCC 6462 NCBI (adesione NCBI Nr.: CP009692.1) e usarlo come un genoma di riferimento per il mapping la pulito letture utilizzando Bowtie2/2.2.3.
- Uso HTSeq v0.6.1 per contare il numero di letture mappato ogni gene e le letture al kilobase di trascrizione per letture mappate milioni (RPKM) di ciascun gene basato sulla lunghezza del gene e letture conteggio mappato a questo gene.
- Per l'analisi dei dati tramite la pipeline di T-REx, utilizzare la tabella RPKM come input, nonché tre file descrittivi: (i) un fascicolo di fattori per descrivere l'esperimento in fattori, (ii) un fascicolo di contrasti per definire quali fattori saranno confrontati per espressione genica differenziale e (iii) un file di classe per descrivere gruppi di geni di interesse.
Nota: I file descrittivi sono formato in. txt. Esempi possono essere trovati sul sito del T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Istruzioni precise per l'analisi dei dati utilizzando il T-REx può essere trovato in una precedente pubblicazione di de Jong et al. 14.
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Representative Results
Pianta-collegato microrganismi possono influenzare positivamente la crescita delle piante e la salute. Tuttavia, i meccanismi delle complesse interazioni tra piante e loro simbionti microbici non sono completamente capiti. Essudati giocano un ruolo importante nella regolazione del comportamento e dell'attività rizobatterica, e generalmente è postulato che la colonizzazione microbica delle radici si avvia con l'attrazione di microbi di essudati radicali. Lo scopo di questo lavoro era di studiare la risposta di trascrittomica di rizobatterica b. mycoides di essudati di patata. Per soddisfare questo, tuberi di patata erano superficie sterilizzato e germinato nella vermiculite in autoclave. Quindi gli essudati sono stati raccolti come mostrato in Figura 1. Al fine di escludere la possibilità degli essudati radicali che interessano la crescita batterica, fino al 15% degli essudati radice sono stati aggiunti alla cultura b. mycoides , e nessun cambiamento in crescita è stato rilevato durante il tempo di misurazione (Figura 2). Così, i cambiamenti di espressione genica osservati in questo studio non sono stati probabilmente causati da effetti in relazione con la crescita.
Dopo la raccolta, gli essudati sono stati aggiunti alla cultura b. mycoides ad un rapporto di 10% (v/v) e il RNA totale batterico è stato isolato come descritto in precedenza. il RNA è stato quindi sottoposto ad un controllo di qualità di uno strumento automatizzato di elettroforesi di cui i risultati sono mostrati nella Figura 3. Figura 3A e 3B rappresentano il RNA isolato da b. mycoides trattati con gli essudati e Figura 3 e 3D rappresentano il RNA isolato dal gruppo di controllo. Tutti i campioni ha ottenuto un valore RIN sopra 9 con due bande chiare corrispondente per le subunità di RNA 16S e 23S, dimostrando che il RNA di alta qualità è stato ottenuto dal presente protocollo.
Dopo la preparazione di biblioteca, coppia-fine letture sono state ottenute con una piattaforma di sequenziamento ad alte prestazioni. Le letture di RNA-Seq crude erano tagliate dalle sequenze di adattatore e mappate contro la sequenza del genoma di riferimento. Dei dati ottenuti, è stata generata nella tabella RPKM. L'analisi del trascrittoma è stato effettuato con la pipeline di T-REx. La trama di intensità di rapporto di tutti i geni differenzialmente espressi è illustrata nella Figura 4. Rispetto a un controllo, l'aggiunta di essudati di patata ha indotto 715 geni a essere differenzialmente espressi. Di quelli, 408 geni sono stati aumentati e 307 geni erano downregulated15. La variazione relativa di alcuni dei geni con espressione alterata è elencata nella tabella 1.
Figura 1: schema di processo della raccolta di essudati radicali patata. I materiali utilizzati sono sterilizzati in autoclave e la germinazione avviene in una camera climatica. Lavare il tubero di patata con acqua sterilizzata e vasca da bagno a 2-3% NaOCl per 5 min. bagno in etanolo di 75% per 5 min, un altro posto la patata in un cesto in autoclave e metterlo in una pentola contenente vermiculite umida. Coltivare la patata in una camera climatica per 3-4 settimane e quindi trasferire il cestino con la piantina di patate in un becher. Raccogliere gli essudati radicali ogni giorno e riempire il becher con acqua sterilizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La curva di crescita di b. mycoides con differenti concentrazioni di essudati di patata. Il ceppo EC18 è stato coltivato in un terreno liquido LB con l'aggiunta di essudati di patate o sterile H2O. OD600 è stato misurato ogni 1h e funzione del tempo. Tutti i gruppi mostrano un simile modello di crescita, che indica che fino a 15% dall'aggiunta di essudati radice non ha effetti rilevanti sulla crescita di b. mycoides . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: controllo di qualità di RNA dallo strumento automatizzato di elettroforesi. A e B rappresentano il RNA isolato da b. mycoides trattati con essudati, C e D rappresentare il RNA isolato dal gruppo di controllo. Tutti i campioni di RNA mostrano due bande chiare corrispondente 23S rRNA 16S e una band di rRNA 5S debole. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: trama di intensità di rapporto per la visualizzazione di espressione genica differenziale dei campioni di RNA-seq di b. mycoides in risposta a essudati radicali patata. La figura viene generata automaticamente da T-REx. L'asse x rappresenta il livello di espressione genica e l'asse y rappresenta la variazione piega log2-trasformate. I geni, up - e downregulated hanno valori di rapporto log2 positivi e negativi. I punti nella zona a righe indicano geni che non sono significativamente sopra - o sotto-espresso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tag di gene | Strand | Piegare il cambiamento | Annotazione |
| BG05_RS09165 | + | 3.3 | proteina di efflusso |
| BG05_RS20930 | + | 25,3 | proteina di membrana |
| BG05_RS10935 | + | 23,3 | fase la proteina sporulazione III AD |
| BG05_RS08990 | - | 11,8 | proteina di sporulazione |
| BG05_RS16405 | + | 3.9 | IclR famiglia regolatore trascrizionale |
| BG05_RS24905 | - | 3 | Alfa subunità di triptofano sintasi |
| BG05_RS24920 | - | 2.3 | indolo-3-glicerolo fosfato sintasi |
| BG05_RS22255 | - | 27 | acetolattato sintasi |
| BG05_RS22250 | - | 6.5 | chetoacido reductoisomerase |
| BG05_RS22265 | - | 26,4 | amminotransferasi dell'aminoacido a catena ramificata |
| BG05_RS18715 | - | 2.8 | pullulanase |
| BG05_RS18040 | + | -9,1 | proteina di germinazione YpeB |
| BG05_RS16930 | + | -4.2 | proteina di trifosfato di adenosina-legante del trasportatore di ABC di zucchero |
| BG05_RS27345 | + | -2,9 | Trasportatore MFS |
| BG05_RS19555 | - | -3,3 | Subunità PTS cellobiosio transporter IIB |
| BG05_RS24345 | - | -2,7 | importatore di putrescina |
| BG05_RS22525 | - | -12,4 | cardiolipina sintasi |
| BG05_RS15225 | - | -3,3 | proteina di membrana |
| BG05_RS18475 | + | -5,7 | proteina di membrana |
| BG05_RS19095 | + | -2.1 | proteina di germinazione |
Tabella 1: Elenco dei geni differenzialmente espressi di un gruppo di essudati-trattato di radice in paragone ad un controllo.
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Discussion
Interazioni piante-microrganismi sono stati supposti per essere determinato da un equilibrio finemente sintonizzato tra batteri e piante. Tali interazioni sono molto complesse e difficili da studiare in un sistema naturale, che comprende diverse specie microbiche, potenzialmente funge da consorzi. Questo articolo descrive un protocollo semplificato per studiare la risposta batterica di essudati in condizioni ben controllate. Il profilo di trascrittoma di rizobatteri, sopra l'esposizione di essudati radicali, fornisce informazioni dettagliate su adattamento dei batteri alla nicchia di rizosfera. Questo protocollo di raccolta essudati radice non richiede attrezzature specializzate e procedure complicate. Tuttavia, tutte le procedure devono essere effettuate in condizioni rigorosamente sterili e un controllo di sterilità deve essere incluso. Si consiglia di crescita diversi tuberi di patata in parallelo e scartando quelli contaminati. Potranno subire modifiche al presente protocollo se altre specie di piante sono in fase di studio. È importante utilizzare un metodo appropriato per sterilizzare qualsiasi semi/tuberi perché possono variare nella tolleranza per i disinfettanti applicato.
Una volta ottenuti gli essudati, RNA di alta qualità deve essere isolato da cellule batteriche. Vari reagenti e protocolli standard che si basano principalmente sul fenolo/cloroformio o TRIzol metodo sono lunghe16. Kit commerciali sono progettati principalmente per organismi di modello, ma sono meno applicabili agli altri. Questo protocollo di isolamento del RNA che combina il metodo fenolo/cloroformio e un kit di isolamento del RNA sormonta gli svantaggi di questi metodi. Inoltre, un passo di tallone-pestaggio è incluso per omogeneizzare le cellule di b. mycoides che aggregano in genere nella cultura planctonico. Potenziale contaminazione di DNA viene rimosso da un'incubazione supplementare con DNase prima eluizione. L'elevato numero RIN implica l'isolamento di RNA intatto. Così, questo protocollo è particolarmente efficiente e risparmio di tempo per ceppi batterici ambientali.
Dopo il sequenziamento di RNA, analisi dei dati viene eseguita con T-REx, una pipeline di analisi statistica basata su web per RNA-seq gene espressione dati14. Questa pipeline è facile da usare, soprattutto per i biologi senza bioinformatica vasta conoscenza. Il file di input è che RNA espressione livelli dati grezzi, quali RPKM, frammenti al kilobase per letture mappate milioni (FPKM), conteggi per letture mappate milioni (CPM), o altre unità di espressione genica. Tali file di valore di espressione genica possono essere generati dagli strumenti disponibili tra cui SAMtools17, BEDtools18e19di NGS-Trex. Per eseguire l'analisi di RNA-seq, sono necessari tre altri file di input. Questi file vengono utilizzati per definire i fattori che descrivono gli esperimenti e le repliche, i confronti tra le varie condizioni sperimentali e i gruppi di geni di interesse. Quando vengono caricati i file di input, il processo di analisi ci vorranno solo un paio di minuti.
Parecchi geni differenzialmente espressi di b. mycoides EC18, quando trattati con essudati radicali, sono elencati nella tabella 1. Tra questi, l'espressione di diversi geni che codificano per le proteine di membrana è alterato. Geni correlati per la sporulazione o processo di germinazione sono differenzialmente espressi. L'espressione di geni coinvolti nella sporulazione cambia anche in b. subtilis quando co-coltivate con piantine di riso, perché essudati forniscano l'energia necessaria per la crescita dinamica di batterico cellule18. L'espressione del regolatore trascrizionale IclR, che è legato alla resistenza del multidrug e la degradazione di composti aromatici in batteri del suolo, è aumentata. Il ceppo di eliminazione IclR di rizobatteri Klebsiella pneumoniae è diminuita la solubilizzazione del fosfato minerale, confrontata con il selvaggio-tipo ceppo19. Diversi geni correlati alla sintesi e nel metabolismo di aminoacidi sono stimolati, mentre sono geni coinvolti nel trasporto di zucchero, compreso un trasportatore PTS cellobiosio downregulated. Ciò suggerisce quel ceppo EC18 può avere una preferenza metabolica per gli amminoacidi sopra gli zuccheri nella rizosfera. La funzione dei geni alterati può essere ulteriormente studiati in situ facendo mutanti knockout o sovraespressione. In sintesi, il protocollo qui descritto consente una rapida identificazione di un gran numero di geni batterici potenzialmente importanti coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo Jakob Viel per i suoi utili commenti e suggerimenti. Ringraziamo anche Anne de Jong per il suo aiuto nell'analisi bioinformatica. Yanglei Yi e Zhibo Li sono supportati dal Consiglio di borsa di studio Cina (CSC). Ringraziamo NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) per il loro sostegno finanziario all'OPK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
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