Summary
המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere Bacillus mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. שיטה זו מקלה על הזיהוי של גנים חיידקיים חשוב מעורב אינטראקציות צמח-חיידק, באופן עקרוני החלים endophytes וצמחים אחרים, עם התאמות קלות.
Abstract
הבקטריה צמח-הקשורים לשחק תפקיד חשוב בקידום הצמיחה ולמניעת מחלות בצמחים. היישום של הצמח הצמיחה וקידום rhizobacteria (PGPR) כסוכני biofertilizers או משולבת הפך חלופה יעילה לשימוש בדשנים קונבנציונלי ו יכולים להגביר את הפרודוקטיביות חיתוך במחיר נמוך. אינטראקציות צמח-חיידק תלויים אותות מופרש הצמח הפונדקאי ואת תגובת לכאן בזמן שנסעתי על ידי חיידקים הקשורים שלהם. עם זאת, המנגנון המולקולרי של חיידקים מועילים כיצד להגיב שלהם הקשורים הצמחי אותות אינם מובנים במלואם. הערכת התגובה transcriptomic של חיידקים השורש exudates היא גישה רב-עוצמה כדי לקבוע את ביטוי גנים חיידקיים ורגולציה בתנאים rhizospheric. ידע כזה יש צורך להבין את המנגנונים שבבסיס מעורב אינטראקציות צמח-חיידק. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ללמוד את התגובה transcriptomic של mycoides נולד ב- EC18, זן מבודד את endosphere תפוחי אדמה, כדי exudates שורש תפוח אדמה. בעזרת הטכנולוגיה תפוקה גבוהה רצף האחרונות, פרוטוקול זה יכול להתבצע תוך מספר שבועות, התוצרת datasets מסיבית. ראשית, אנו אוספים את exudates שורש בתנאים סטריליים, לאחר מכן הם מתווספים mycoides דרב תרבויות. הרנ א מהתרביות האלה היא מבודדת באמצעות שיטה פנול/כלורופורם בשילוב עם ערכת מסחרי ונחשפו בקרת איכות על ידי כלי נגינה אוטומטיות אלקטרופורזה. לאחר רצף, ניתוח נתונים מתבצע באמצעות הצינור T-REx מבוססת-אינטרנט, קבוצה של גנים ביטוי באופן שונה מזוהה. שיטה זו היא כלי שימושי כדי להקל על תגליות חדשות על גנים חיידקיים מעורב אינטראקציות צמח-חיידק.
Introduction
צמחים מאי תפליט עד 20% של פחמן קבוע בעת ההטמעה דרך השורשים של rhizosphere1, כלומר, אזור צר של אדמה בקרבת השורשים. בשל הזמינות מזין גבוה, rhizosphere הוא גידול מתאימים עבור מיקרואורגניזמים מגוונים, כולל צמחים-צמיחה קידום חיידקים. Exudates שורש להכיל מגוון של חומרים אורגניים נדיפים כמו יונים, חומצות אנאורגניות, חמצן ומים. עם זאת, הרוב המכריע של exudates הבסיס נוצר על ידי חומרים אורגניים, אשר ניתן לחלק תרכובות משקל מולקולרי נמוך, משקל מולקולרי גבוה תרכובות. תרכובות משקל מולקולרי נמוך כולל חומצות אמינו, חומצות אורגניות, סוכרים, תרכובות בעל תאים פנוליים, חומצות שומן, ושורה של מטבוליטים משניים. תרכובות משקל מולקולרי גבוה מורכב2,mucilage, חלבונים3. Rhizosphere מיקרואורגניזמים יכולים להשתמש בחלק תרכובות אלו כמקור אנרגיה לצמיחה ופיתוח. Exudates שורש תפקיד חשוב בעיצוב הקהילה rhizobacterial מאז המיוצר במפעל תרכובות של exudates יכולים להשפיע על ההתנהגות של חיידקים rhizosphere-הקשורים על ידי המשפיעים על הביטוי של גנים ספציפיים.
הבנת התגובה חיידקי השורש exudates היא צעד המפתח בפענוח מנגנוני אינטראקציה צמח-חיידק. כמו התגובה חיידקי אינטראקציות צמח-חיידק הוא התוצר של ביטוי גנים דיפרנציאלית, זה ניתן יהיה ללמוד על ידי ניתוח transcriptome. באמצעות שיטה זו, מחקרים קודמים זיהו מספר חשוב גנים המעורבים באינטראקציה צמח-חיידק. ב- Pseudomonas aeruginosa, גנים המעורבים חילוף החומרים, כימוטקסיס וסוג II הפרשת הוצגו להגיב exudates שורש סלק סוכר4. מאוורר ואח. 5 חקר את פרופיל transcriptomic של amyloliquefaciens נולד ב- FZB42 בתגובה exudates שורש תירס. התוצאות שלהם מראים כי של גנים חריפה הנגרמת על ידי exudates השורש, מספר קבוצות מעורבים מסלולים מטבוליים הנוגעים ניצול מזין, כימוטקסיס, תנועתיות ו- 30s ריבוזומלי סינתזה של פפטידים מיקרוביאלית ו- polyketides.
הדיוק של מחקרים אלה מסתמך על האוסף של השורש exudates. למרות מספר שיטות תיארו את האוסף של שורש exudates למטרות שונות, הם דורשים מכשירים מתוחכמים או לא יבוצעו ב תנאים מבוקרים היטב-6,-7,-8. יתר על כן, עיכוב rhizosphere מיקרואורגניזמים יכולים להשפיע על שורש תפליט הרכב על ידי המשפיעים על חדירות קרום התא צמח ופגיעה ברקמות שורש, במיוחד במקרה של קונסורציומים של מיקרואורגניזמים9. כאשר חוקרים התגובה מיקרוביאלי שורש exudates, חשוב להשתמש בתנאים מוגדרים היטב על מנת למנוע שינוי של תרכובות על-ידי מיקרואורגניזמים10. יתר על כן, ה-RNA באיכות גבוהה נדרש עבור ה-RNA-seq המבוסס על מחקרים transcriptome. עם זאת, בעת התמודדות עם זנים שאינם-מודל-בקטריאלי, פרוטוקולים סטנדרטיים או קיטים מסחריים יש בדרך כלל של יעילות נמוכה עקב גורמים לא ידועים או מאפייני צמיחה מיוחד.
הפרוטוקול המתואר כאן אומתה באמצעות mycoides דרב, אשר הוא חיידק גראם חיובי, יוצרי ספורה של שלקרוא Firmicute. . זה נמצא בכל מקום, rhizosphere של מיני צמחים שונים. גידול צמח מספר מאפיינים קידום דווחו על מין זה, לרבות אינדוקציה ההתנגדות שיטתית (ISR) סלק סוכר11, עיכוב של המתלים-off המחלה Pythium מלפפון12, כמו גם חנקן קיבוע חמניות rhizosphere13. עם זאת, המנגנון המולקולרי של ביחסיו עם צמח המארח לא טוב נלמדים.
המטרה של הניסויים המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere דרב mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. בקיצור, הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: ראשית, לאסוף תפוחי אדמה exudates שורש בתנאים סטריליים. לאחר מכן, לחלץ RNA באיכות גבוהה מתאים חיידקיים שטופלו exudates השורש. השלב הסופי הוא ניתוח נתונים תוך שימוש באינטרנט T-REx צינור14. פרוטוקול זה שימש לזיהוי גנים mycoides דרב הצג את משמרת ברמות הביטוי בעת מגע עם שורש-exudates, ובכך עלול לשחק תפקיד חשוב ב אינטראקציות צמח-חיידק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הנבטת תפוחי אדמה בתנאים מעוקר
- יש לשטוף את פני השטח של תפוחי אדמה עם מים סטריליים. לטבול את תפוחי האדמה ב-70% אתנול, ולאחר מכן ב 3% נתרן תת-כלורי, למשך 5 דקות. לשטוף את זה שוב עם מים סטריליים כדי להסיר כל נתרן הנותרים תת-כלורי.
- להכין את החומרים הדרושים הנבטת וגדל פקעות תפוחי אדמה; לחטא את הסירים פלסטיק, engraftment סלים, ורמיקוליט, ומים על ידי autoclaving אותם ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
הערה: ודא כל החומרים המשמשים autoclavable. אחרת, השתמש בשיטות אחרות לחיטוי. - מכניסים את תפוחי האדמה לעקר השטח הסל engraftment, המקום הזה סיר בלוק המכיל ורמיקוליט רטוב.
- לשמור את הסיר בתוך תא האקלים ב 24 מעלות צלזיוס במשך שלושה שבועות. להגדיר אותו על מחזורים של 16 שעות של אור (120 µmol ז-2s-1) ו- 8 שעות החושך. כדי להימנע מציג מיקרוביאלי, להשתמש בתיבת סיבי זכוכית גדול כדי לכסות את הסיר.
2. איסוף תפוחי אדמה שחורה Exudates
- כאשר נצרי נבט, העברת הסל עם תפוחי אדמה שלם לתוך גביע סטיריליים מלא 150 מ ל מים יונים בלוק, עם תפוחי אדמה פקעות ממוקמים מעל פני המים ואת השורשים שקוע במים (ראה איור 1). לשמור שתיל בתא האקלים, להשתמש באותן הגדרות כמו קודם [24 ° C; מחזורי h 16 אור (120 µmol ז-2s-1), 8 שעות החושך].
- ביום השני על, איסוף של מים המכילים את exudates, למלא את. הספל עם מים יונים סטרילי. לבצע הדגימה כל יום עד יום השביעי לאחר העברת שתיל.
- לאחסן כל מדגם בנפרד ב 4 º C. עבור כל דגימה, להפיץ µL 100-לוריא-Bertani (ליברות; 1% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 0.5% NaCl) צלחת אגר כדי לבדוק אם מציג מיקרוביאלי. למחוק את הדגימות מזוהמים.
- לשלב את הדגימות שנאספו של שתיל אחד, לרכז אותם על ידי ליופיליזציה אותם ב-40 ° C עד נפח סופי של 150 מ.
3. גידול חיידקים
- פסים זן mycoides דרב מ-80 מעלות צלזיוס גליצרול מניה על גבי צלחת אגר ליברות, דגירה את הצלחת ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לחסן בינוני נוזלי ליברות עם מושבה בודדת מהצלחת ולהגדיל את התרבות ב חממה חזק ב rpm 200 בן לילה ב 30 º C.
4. טיפול ודגימה של חיידקים
- כדי להשוות בין עקומת גידול של חיידקים שטופלו exudates שורש לפקד שלילי, מכינים סדרת מבחנות המכילות 50 מ של המדיום הנוזלי ליברות. להוסיף 0.5 מ"ל של התרבות חיידקי לילה כל צלוחיות, ולהוסיף או 0%, 5%, 10%, 15% (v/v) שורש תפליט או במים סטריליים יונים המדיום, בהתאמה.
- להשתמש תרבות עם מים יונים במקום exudates שורש פקד. מודדים את צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) כל h 1 לאחר מכן. יוצרות עקומת גדילה ידי הערכים600 OD נגד הזמן.
הערה: ראינו כי 10% exudates הבסיס לא השפיע על צמיחת mycoides דרב (ראה איור 2); יחס זה שימש לניסויים RNA-seq. - לדלל תרבות mycoides דרב לילה עם 90 מיליליטר מראש ומחוממת LB בינוניים עד ה OD הראשונית600 של ~ 0.05 בבקבוקון 300 מ ל. להוסיף 10 מ של exudates הבסיס לתרבות, דגירה זה ב 30 ° C עבור 1 h.
- להשתמש טיפול במים סטריליים יונים 10 מ"ל פקד. איסוף תאים מתרבות על ידי צנטריפוגה ב g x 9,000 למשך 2 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, מיד להקפיא בגדר של חנקן נוזלי ואז לאחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
5. RNA בידוד
הערה: לפני שמתחילים את הבידוד, להכין עבודה, שעליו מונחים, ארונות תקשורת, פיפטות על-ידי ניקוי אותם עם פתרון טיהור RNase (ראה טבלה של חומרים). ללבוש כפפות בכל עת, ודא כי כל צינורות, עצות ופתרונות הם נטולי RNase. תמיד לשמור את הדוגמאות על קרח במידת האפשר.
- להוסיף מים הנדסה גנטית (100 µL של DEPC לכל פתרון 100 מ ל) מ- 0.1% (v/v) diethyl pyrocarbonate (DEPC), מערבבים אותו היטב, ולשמור אותו בטמפרטורת החדר למשך הלילה. אוטוקלב התערובת כדי להשבית את DEPC לאחר טיפול לילה. שימוש זה שטופלו DEPC מים הנדסה גנטית כדי להכין המאגר טה [10 מ מ טריס-HCl (pH = 8); 1 מ"מ EDTA] ו 10% הפתרון מרחביות (w/v).
- להפשיר את כדורי תא על הקרח, להשעות את כל µL 400 מאגר TE (DEPC). להעביר את המתלים לתוך צינורות פקקי בורג 2 מ"ל.
- Premix µL 300 באלכוהול כלורופורם-isoamyl (24:1 v/v) ו- 300 µL של פנול (חומצה פנול, כיתה ה-RNA), ולאפשר את התערובת לעמוד במשך 5 דקות. קח µL 500 השלב העליון אורגני כדי להוסיף התאים resuspended. לאחר מכן להוסיף 50 µL למען חברה דמוקרטית 10% וכ -0.5 גר' חרוזי זכוכית (0.5 מיקרומטר) לתוך הצינור.
- לסגור את הפקק בחוזקה ולמקם את הצינורית מהמגן חרוז-מיל (ראה טבלה של חומרים). ביצוע של s 3 × 45 הדופק המגון עם מרווח 1 דקות על קרח.
- Centrifuge את הדגימות 10 דקות ב 11,000 x g (4 ° C), ולהעביר את השלב העליון צינור חדש.
- להוסיף 500 µL באלכוהול כלורופורם-isoamyl (24:1) השלב העליון מ שלב 5.5, centrifuge את התערובת למשך 5 דקות ב x 11,000 g (4 ° C).
הערה: השלבים הבאים ששונו של הוראת היצרן מסחרי זכוכית סיבים מבוסס מסנן ה-RNA בידוד קיט (ראה טבלה של חומרים). - µL 500 השלב העליון להעביר צינור טריים, להוסיף 2 כרכים (1 מ"ל) של מאגר פירוק/איגוד ולערבב אותו על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
- לשלב את הצינורות מסנן ואוסף (מתוך ערכת בידוד ה-RNA), pipette את התערובת מהשלב 5.7 הצינור מסנן. Centrifuge צינורות 15 s ב- 8,000-g ולהשליך הזרימה דרך.
- להכין 1.5 mL microcentrifuge צינורות עם µL 100 DNase מאגר, 10 µL של DNase ואני µL 5 של מעכב RNase (ראה טבלה של חומרים). הוסף את התמהיל פתרון מוכן מסנן של הצינור מסנן, דגירה זה למשך 20-30 דקות ב- 15-25 מעלות צלזיוס.
- בצע את השלבים כביסה לפי הוראות היצרן. השתמש µL 50 של מאגר • תנאי כדי elute את הרנ א.
- להציל את הרנ א eluted ב-80 מעלות צלזיוס, לשים סרט פרפין פלסטיק מסביבו. במקביל, להעביר כמה microliters של המדגם צינור microcentrifuge 1.5 mL לבצע בדיקת איכות '.
6. בדיקת האיכות RNA ורצף
- בררו את הרנ א ספקטרופוטומטרים microvolume.
הערה: ספיגת יחס-260/280 צריך להיות מעל 1.8, יחסי-260/230 צריך להיות מעל 1.8 לפחות, רצוי מעל 2.0. - הפעל הרנ א מטוהרים בכלי נגינה אלקטרופורזה אוטומטית באמצעות הניתוח RNA להמליץ קיט (ראה טבלה של חומרים); המספר שלמות RNA (RIN) חייב להיות לפחות מעל 7 כדי להמשיך.
- שימוש בסכום כולל של µg 3 של RNA לדגימה ליצירת ספריות עם הכנה ספריה RNA-Seq קיט (ראה טבלה של חומרים) בעקבות ההמלצות של היצרן.
הערה: ההכנות הספרייה היו וסודרו על פלטפורמה רצף תפוקה גבוהה, קריאות לזווג-end נוצרו.
7. נתוני ניתוח באמצעות צינור מבוסס-אינטרנט של T-REx
- ביצוע איכות סינון באמצעות FASTX-ערכת הכלים גירסה 0.0.13 (Phred איכות עשרות > 20). חתוך את קריאות RNA-Seq raw של הרצפים מתאם עם הכלי Trimmomatic.
הערה: כל הבדיקות במורד הזרם התבססו על נתונים נקי עם איכות גבוהה. - הורדת הנתונים הגנום של בקרת האוויר 6462 NCBI mycoides דרב (ההצטרפות NCBI מס: CP009692.1) ולהשתמש בו בתור גנום הפניה למיפוי את קריאות נקי באמצעות Bowtie2/2.2.3.
- שימוש v0.6.1 HTSeq לספור את המספרים קריאות למפות כל הגן, הקריאות לכל kilobase של התעתיק לפי קריאות ממופה מיליון (RPKM) של כל הגנים המבוססת על האורך של הרוזן ג'ין וקורא שמופו אל הגן הזה.
- לניתוח של הנתונים על-ידי הצבר. טי-רקס, היעזר בטבלה RPKM קלט, וכן שלושה קבצים תיאורי: (i) קובץ גורמים כדי לתאר את הניסוי גורמים, (ii) קובץ ניגודים להגדיר אילו גורמים יושוו על ביטוי גנים דיפרנציאלית , וכן (iii) קובץ בכיתה לתיאור קבוצות של גנים של עניין.
הערה: קבצי תיאורית נמצאים בתבנית in.txt. דוגמאות ניתן למצוא באתר האינטרנט של טי-רקס (http://genome2d.molgenrug.nl/). הוראה מפורטת לניתוח נתונים באמצעות T-REx ניתן למצוא בפרסום הקודם על ידי דה יונג. et al. 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צמח-הקשורים מיקרואורגניזמים יכולים להשפיע באופן חיובי על צימוח ובריאות. עם זאת, המנגנון של אינטראקציות מורכבות בין צמחים שלהם אנחנו חיים איתם בסמביוזה חיידקים הם אינה מובנת במלואה. שורש exudates יש תפקיד חשוב בוויסות פעילות rhizobacterial של התנהגות, זה בדרך כלל הוא שמהווה הקולוניזציה מיקרוביאלית של שורשים יוזם עם האטרקציה של חיידקים כדי exudates השורש. מטרת עבודה זו היה לחקור את התגובה transcriptomic של rhizobacterial דרב mycoides כדי exudates שורש תפוח אדמה. כדי ליישם את זה, פקעות תפוחי אדמה היו פני מחוטא, מונבטים ורמיקוליט בלוק. אז exudates שורש נאספו כמוצג באיור1. על מנת לשלול את האפשרות של exudates השורש המשפיעים על התפתחות חיידקים, עד 15% exudates שורש נוספו התרבות דרב mycoides , ללא כל שינוי צמיחה זוהה במהלך זמן מדידה (איור 2). לפיכך, ג'ין השינויים ביטוי במחקר זה לא סביר נגרמו תופעות הקשורות צמיחה.
לאחר אוסף, exudates השורש נוספו התרבות דרב mycoides ביחס של 10% (v/v), חיידקי ה-RNA הכולל היה מבודד כאמור תיאר. הרנ א היה נתון אז כדי בדיקת איכות על ידי כלי נגינה אלקטרופורזה אוטומטיים אשר התוצאות מוצגות באיור3. איור 3A ו- 3B לייצג את הרנ א מבודד mycoides דרב שטופלו exudates השורש, 3C איור ותלת מימד לייצג את הרנ א מבודד את קבוצת הביקורת. כל הדגימות הבקיע ערך רין מעל 9 עם שתי להקות ברור התואם מטוסי אף-16, 23S RNA subunits, הוכחת כי באיכות גבוהה RNA היה מתקבל על ידי פרוטוקול זה.
לאחר הכנת ספריה, התקבלו קריאות סוף-זוג עם פלטפורמה רצף תפוקה גבוהה. קריאות RNA-Seq raw גזוז מן הרצפים מתאם, ממופה נגד רצף הגנום הפניה. הנתונים וכתוצאה מכך, נוצר הטבלה RPKM. הניתוח transcriptome בוצעה עם הצינור טי-רקס. העלילה בעוצמה יחס של כל הגנים באופן שונה ביטוי מוצג באיור4. לעומת פקד, התוספת של תפוחי אדמה שורש exudates המושרה גנים 715 לבוא לידי ביטוי באופן שונה. מאלה, גנים 408 היו upregulated, 307 הגנים היו downregulated15. השינוי היחסי של הגנים עם ביטוי שינו כמה מפורט בטבלה1.
איור 1: תהליך הערכה אסופה של תפוחי אדמה השורש exudates. החומרים אשר השתמשו בהם בלוק, הנביטה מבוצעת בחדר האקלים. רוחצים פקעת תפוח אדמה עם מים מעוקר, את באת בה ב- 2-3% NaOCl עבור 5 דק. באת בה ב- 75% אתנול עבור עוד 5 דק המקום את תפוחי האדמה לתוך סלסלת בלוק והכניס אותו לתוך סיר המכיל ורמיקוליט רטוב. לגדל את תפוחי האדמה בתוך תא האקלים במשך 3-4 שבועות, ולאחר מכן להעביר את הסל עם שתיל תפוחי אדמה כדי גביע. לאסוף את exudates שורש כל יום ולמלא את. הספל עם מים מעוקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: צמיחה העקומה של mycoides דרב עם ריכוזים שונים של תפוחי אדמה השורש exudates. המתח EC18 גדל במדיום LB נוזלי עם התוספת של תפוחי אדמה שורש exudates או סטרילי H2O. OD600 היה נמדד כל h 1 ו להתוות נגד הזמן. כל הקבוצות להציג תבנית גדילה דומה, המציין עד 15% תוספת exudates שורש יש אין אפקטים משמעותיים על צמיחה mycoides דרב . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: RNA בדיקת האיכות על ידי המכשיר אוטומטית אלקטרופורזה. A ו- B מייצגים הרנ א מבודד את mycoides דרב מטופלים עם שורש exudates, C ו- D מייצגים את הרנ א מבודד את קבוצת הביקורת. כל הדגימות RNA הצג שתי להקות ברורים המתאימים 23S, מטוסי אף-16 rRNA, להקה rRNA 5S חלש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: יחס מגרש בעוצמה להמחשת ביטוי גנים דיפרנציאלית של RNA-seq דוגמאות mycoides דרב בתגובה תפוחי אדמה השורש exudates. הדמות נוצר באופן אוטומטי על ידי T-REx. ציר ה-x מייצג את רמת הביטוי של גנים, ציר ה-y ומייצג את השינוי טרנספורמציה-log2 קיפול. הגנים להיות ואת downregulated להיות חיוביים ושליליים log2 יחס ערכי. הנקודות באזור המפוצל מציינים גנים שאינם באופן משמעותי מעל - או תחת-באה לידי ביטוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| ג'ין תג | סטרנד | מקפלים שינוי | ביאור |
| BG05_RS09165 | + | 3.3 | בזרימת multidrug חלבון |
| BG05_RS20930 | + | 25.3 | חלבון ממברנה |
| BG05_RS10935 | + | 23.3 | שלב III הנבגה חלבון לספירה |
| BG05_RS08990 | - | 11.8 | חלבון הנבגה |
| BG05_RS16405 | + | 3.9 | הרגולטור תעתיק משפחתי IclR |
| BG05_RS24905 | - | 3 | טריפטופן סינתאז יחידה משנית אלפא |
| BG05_RS24920 | - | 2.3 | אינדול-3-גליצרול פוספט סינתאז |
| BG05_RS22255 | - | 27 | acetolactate סינתאז |
| BG05_RS22250 | - | 6.5 | חומצה ketol ב reductoisomerase |
| BG05_RS22265 | - | 26.4 | חומצת אמינו מסועפות שרשרת aminotransferase |
| BG05_RS18715 | - | 2.8 | pullulanase |
| BG05_RS18040 | + | -9.1 | נביטה חלבון YpeB |
| BG05_RS16930 | + | -4.2 | סוכר ABC טרנספורטר ATP מחייב חלבון |
| BG05_RS27345 | + | -2.9 | סיפור משפחתי טרנספורטר |
| BG05_RS19555 | - | -3.3 | PTS cellobiose טרנספורטר יחידה משנית IIB |
| BG05_RS24345 | - | -2.7 | putrescine יבואן |
| BG05_RS22525 | - | -12.4 | cardiolipin סינתאז |
| BG05_RS15225 | - | -3.3 | חלבון ממברנה |
| BG05_RS18475 | + | -5.7 | חלבון ממברנה |
| BG05_RS19095 | + | -2.1 | חלבון נביטה |
טבלה 1: רשימת גנים ביטוי באופן שונה של קבוצת שטופלו exudates שורש בהשוואה פקד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אינטראקציות צמח-חיידק יש כבר שיערו להיקבע על-ידי שיווי משקל משומנת בין חיידקים וצמחים. אינטראקציות כאלה הם מורכבים מאוד, קשה ללמוד במערכת טבעית, אשר כוללת מגוון מינים מיקרוביאלי, כגורם העלול קונסורציומים. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוטה ללמוד את חיידקי בתגובה שורש exudates בתנאים מבוקרים היטב. הפרופיל transcriptome של rhizobacteria, בתגובה לחשיפה שורש exudates, מספק מידע מפורט על חיידקי ההסתגלות הגומחה rhizosphere. פרוטוקול אוסף זה שורש exudates אינו מצריך פרוצדורות מסובכות, ציוד מיוחד. אולם, כל הפרוצדורות צריך להתבצע בתנאים סטריליים לחלוטין, פקד עקרות צריך להיות כלול. אנו ממליצים גדל מספר פקעות תפוחי אדמה במקביל ומחיקת מזוהמים אלה. שינויים יכולים להתבצע כדי פרוטוקול זה אם מיני צמחים אחרים הם נחקר. חשוב להשתמש שיטה המתאימה כדי לעקר כל זרעים/פקעות כי הם עשויים להשתנות ב עמידות בפני חומרי חיטוי מוחל.
ברגע exudates הבסיס מתקבלים, RNA איכותי חייב להיות מבודד מתאי חיידקי. ריאגנטים השונות פרוטוקולים סטנדרטיים המבוססים בעיקר על פנול/הכלורופורם או TRIzol שיטה הם זמן רב16. ערכות מסחריות נועדו בעיקר עבור אורגניזמים מודל אבל חלים פחות לאחרים. פרוטוקול בידוד זה RNA המשלב את שיטת פנול/כלורופורם, ערכת בידוד ה-RNA מתגבר על החסרונות של שיטות אלה. יתר על כן, צעד חרוז-מכות נכלל homogenize דרב mycoides תאים בדרך כלל לצבור בתרבות פלנקטוניים. אפשרות ה-DNA זיהום יוסר על ידי דגירה נוספת עם DNase לפני • תנאי. המספר הגבוה של רין מרמז על הבידוד של RNA ללא פגע. לפיכך, פרוטוקול זה הוא במיוחד יעיל לחיסכון בזמן עבור הסביבה זני חיידקים.
לאחר רצפי RNA, ניתוח נתונים מתבצע עם טי-רקס, צינור מבוסס-אינטרנט ניתוח סטטיסטי RNA-seq ג'ין ביטוי נתונים14. הצינור הזה הוא ידידותי למשתמש, במיוחד עבור ביולוגים ללא ידע מקיף ביואינפורמטיקה. קובץ הקלט הוא ש-RNA ביטוי ברמת הנתונים הגולמיים, כגון RPKM, קטעים לכל kilobase לכל מיליון קריאות ממופה (FPKM), ספירות לכל מיליון קריאות ממופה (CPM), או יחידות אחרות של ביטוי גנים. קבצים ערך הביטוי כאלה ג'ין יכול להיווצר על ידי כלים זמינים, כולל SAMtools17, BEDtools18המיתרים-Trex19. כדי להפעיל את הניתוח RNA-seq, נדרשים שלושה קבצי קלט אחרים. קבצים אלה משמשים להגדרת הגורמים המתארים את הניסויים, משכפל את, את ההשוואות בין התנאים ניסיוני שונים, קבוצות הגנים של עניין. כאשר הקבצים קלט מועלות, תהליך ניתוח ייקח רק כמה דקות.
מספר באופן שונה ביטוי הגנים של mycoides נולד ב- EC18, כאשר מטופלים עם שורש exudates, מפורטים בטבלה 1. ביניהם, הביטוי של מספר גנים קידוד חלבונים ממברנה היא שונה. גנים הקשורים הנבגה או תהליך הנביטה מתבטאים באופן שונה. הביטוי של גנים המעורבים הנבגה משנה גם ב- B. subtilis כאשר תרבותי משותף עם אורז שתילים, כי שורש exudates אספקת האנרגיה הדרושה עבור הגידול דינמי של בקטריאלי תאים18. הביטוי של הרגולטורים תעתיק IclR, אשר קשורה ההתנגדות multidrug והשפלות של תרכובות ארומטיות בחיידקים בקרקעות, הוא upregulated. מחיקה IclR מזן rhizobacteria קלבסיאלה pneumoniae הצטמצמה solubilization פוספט מינרלי, בהשוואה של זן פראי-סוג19. מספר גנים הקשורים סינתזה מטבוליזם של חומצות אמינו הם גירוי, בעוד גנים המעורבים בהעברה סוכר כולל נהג PTS cellobiose הם downregulated. הדבר מצביע על זן זה EC18 אולי יש העדפה חומצות אמינו מטבולית מעל סוכרים rhizosphere. הפונקציה של הגנים שינו יכולים להיות עוד יותר למד בחיי עיר על-ידי הפיכת מוטציות נוקאאוט או ביטוי. לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את זיהוי מהיר של מספר רב של גנים חיידקיים חשוב שעשוי להיות מעורב אינטראקציות צמח-חיידק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים יעקב הרבה על הערות מועילות והצעות שלו. אנו מודים גם אן דה יונג לעזרתו בניתוח ביואינפורמטיקה. Yanglei יי ו- Zhibo Li נתמכים על ידי מועצת מלגות סין (CSC). אנו מודים Back2Roots תכנית בתחרות-TTW Perspectief (TKI-AF-15510) לתמיכה הפיננסית שלהם OPK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. eZ., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
