Summary
Målet med protokollen presenteres her er å studere transcriptomic svaret av endosphere-isolert Bacillus mycoides potet root eksudater. Denne metoden muliggjør identifikasjon av viktige bakteriell gener involvert i anlegget-mikrobe interaksjoner og er i prinsippet gjelder for andre endophytes og planter, med mindre justeringer.
Abstract
Fordelaktig plante-assosiert bakterier spiller en viktig rolle i å fremme vekst og forebygge sykdom på planter. Bruk av plante vekst-fremme rhizobacteria (PGPR) som biofertilizers eller biocontrol har blitt et effektivt alternativ til bruk av konvensjonelle gjødsel og kan øke avling produktivitet til lave kostnader. Plante-mikrobe interaksjoner er avhengig av verten anlegget-utskilles signaler og en reaksjon heretter av deres tilknyttede bakterier. Imidlertid reagerer molekylære mekanismer av hvordan gunstige bakterier på deres tilhørende plante-avledet signaler ikke er fullt ut forstått. Vurdere transcriptomic svaret av bakterier root eksudater er en effektiv tilnærming til å finne bakteriell genuttrykk og regulering under rhizospheric forhold. Slik kunnskap er nødvendig for å forstå de underliggende mekanismene som er involvert i anlegget-mikrobe interaksjoner. Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for å studere transcriptomic svar B. mycoides EC18, en stamme isolert fra potet-endosphere til potet root eksudater. Med hjelp av siste høy gjennomstrømming sekvensering teknologi, kan denne protokollen utføres i flere uker og produsere massive datasett. Først samle vi root eksudater under sterile forhold, etter som de legges til B. mycoides kulturer. RNA fra disse kulturene er isolert med en fenol/kloroform metode kombinert med en kommersiell kit og utsatt for kvalitetskontroll av et automatisert geleelektroforese instrument. Etter sekvensering, dataanalyse utføres med webbaserte T-REx rørledningen og en gruppe av ulikt uttrykt gener er identifisert. Denne metoden er et nyttig verktøy for å lette nye funn på bakteriell gener involvert i anlegget-mikrobe interaksjoner.
Introduction
Planter kan sårvæske opptil 20% av karbon fast under fotosyntese gjennom røttene til rhizosphere1, dvs, smale sonen av jord i nærheten av røttene. Høyere næringsstoffer tilgjengeligheten er rhizosphere en passende beboelse for mangfoldig mikroorganismer, inkludert plantevekst fremme bakterier. Root-eksudater inneholder en rekke uorganiske forbindelser som ioner, uorganisk syrer, oksygen og vann. Men dannes fleste root eksudater av organisk materiale som kan deles inn i lav molekylvekt forbindelser og høy molekylvekt forbindelser. Lav molekylvekt forbindelser inkluderer aminosyrer, organiske syrer, sukker, Fenoliske forbindelser, fettsyrer og en rekke andre metabolitter. Høy molekylvekt forbindelsene består mucilage og proteiner2,3. Rhizosphere mikroorganismer kan bruke noen av disse forbindelsene som energikilde for vekst og utvikling. Root eksudater spiller en viktig rolle i utformingen av rhizobacterial samfunnet siden de plante-produsert forbindelsene i eksudater kan påvirke atferden til rhizosphere-assosiert bakterier ved å påvirke uttrykket av bestemte gener.
Forstå bakteriell svaret root eksudater er et viktig skritt i tyde plante-mikrobe samhandling mekanismer. Bakteriell svaret å plante-mikrobe samhandling er produktet av differensial genuttrykk, kan det bli undersøkt av transcriptome analyse. Bruker denne metoden, identifisert tidligere studier flere viktige gener involvert i anlegget-mikrobe interaksjoner. I Pseudomonas aeruginosa, ble gener involvert i stoffskiftet, chemotaxis og type II sekresjon vist å svare på sukkerroer rot eksudater4. Fan et al. 5 studerte transcriptomic profilering av B. amyloliquefaciens FZB42 svar på mais root eksudater. Resultatene viser at av genene sterkt indusert av root eksudater, flere grupper er involvert i metabolske veier knyttet til næringsstoffer utnyttelse, chemotaxis, motilitet og ikke-ribosomal syntese av antimikrobielle peptider og polyketides.
Nøyaktigheten av disse studiene er avhengig av samlingen av root eksudater. Selv om flere metoder har beskrevet samlingen av root eksudater for ulike formål, de krever avanserte instrument eller utføres ikke i godt kontrollerte forhold6,7,8. Videre rhizosphere begrenser mikroorganismer kan påvirke rot sårvæske komposisjon ved å påvirke plante celle membran permeabilitet og skade rot vev, spesielt når det gjelder konsortier av mikroorganismer9. Når undersøke mikrobiell svaret root eksudater, er det viktig å bruke veldefinerte forhold for å unngå endring av forbindelser med andre mikroorganismer10. Videre er høykvalitets RNA nødvendig for RNA-seq basert transcriptome studier. Men når du arbeider med ikke-modell-bakteriell stammer, har standardprotokoller eller kommersielle kits vanligvis en lav effektivitet på grunn av ukjente faktorer eller spesielle vekst egenskaper.
Protokollen beskrevet her ble bekreftet bruker B. mycoides, som er en gram-positive, spore-forming bakterie av Firmicute-rekken. Det er allestedsnærværende i rhizosphere av forskjellige plantearter. Flere anlegg veksten fremme egenskaper er rapportert for denne arten, inkludert induksjon systematisk motstand (ISR) i sukkerroer11, hemming av demping av patogen Pythium for agurk12, samt nitrogen fiksering i solsikke rhizosphere13. Imidlertid er molekylære mekanismer av dets interaksjon med næringsplante ikke godt studert.
Målet med eksperimenter presenteres her er å studere transcriptomic svaret av endosphere-isolert B. mycoides potet root eksudater. Kort sagt, protokollen består av følgende trinn: først samle potet root eksudater under sterile forhold. Deretter pakker du ut høykvalitets RNA fra bakterieceller behandlet med root eksudater. Det siste trinnet er dataanalyse ved hjelp av den webbaserte T-REx rørledning14. Denne protokollen ble brukt til å identifisere B. mycoides gener som viser et skifte i uttrykket nivåer ved kontakt med root-eksudater og dermed kan spille en viktig rolle i plante-mikrobe interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. spirende potet i steriliserte forhold
- Skyll potet overflaten med sterilt vann. Bade potet 70% etanol og deretter 3% natriumhypokloritt, i 5 min. Skyll den igjen med sterilt vann for å fjerne eventuelle gjenværende natriumhypokloritt.
- Forberede materialer som trengs for spirende og voksende potet knoller; sterilisere plast Potter, engraftment kurver, vermikulitt, og vann med autoklavering dem ved 121 ° C i 20 min.
Merk: Kontroller at alle er autoclavable. Ellers bruk andre sterilisering metoder. - Overflate-steriliseres potet inn engraftment kurven, og sette dette i en autoklaveres pott som inneholder våt vermikulitt.
- Hold potten i et klima kammer på 24 ° C i tre uker. Sett den på sykluser av 16 timer av lys (120 µmol m-2s-1) og 8 h mørke. For å unngå mikrobiell forurensing, bruk et stort glass fiber for å dekke potten.
2. samle potet Root eksudater
- Når skudd spire, overføre fylt kurven med hele potet i et sterilisert beaker med 150 mL autoklaveres deionisert vann, med potet knoller plassert like over vannflaten og røttene neddykket i vannet (se figur 1). Hold frøplante i klima chamber, og bruke de samme innstillingene som før [24 ° C; sykluser av 16 timer av lys (120 µmol m-2s-1), 8 h mørke].
- Den andre dagen på, samle vannet som inneholder eksudater og fylle kanne med sterilt deionisert vann. Utføre prøvetaking hver dag til den sjuende dagen etter overføring frøplante.
- Arkivere hver sampling separat på 4 ° C. For hver prøve, spre 100 µL på en Luria-Bertani (LB; 1% tryptone, 0,5% gjærekstrakt, 0,5% NaCl) agar platen etter mikrobiell forurensing. Kast forurenset prøvene.
- Kombinere de innsamlede eksemplene av en frøplante og konsentrer dem av Frysetørring dem på 40 ° C til et siste volum på 150 mL.
3. voksende bakterier
- Strek en B. mycoides stamme fra en-80 ° C glyserol aksje til en LB agar plate og ruge platen på 30 ° C over natten.
- Vaksinere et LB flytende medium med en enkelt koloni fra platen, og vokser kulturen i en risting inkubator på 200 rpm overnatting på 30 ° C.
4. behandling og prøvetaking av bakterier
- Hvis du vil sammenligne vekstkurve av bakterier behandlet med root eksudater til en negativ kontroll, forberede en rekke flasker som inneholder 50 mL av LB flytende medium. Legge til 0,5 mL av natten bakteriell kultur i alle flasker, og legge enten 0%, 5%, 10% eller 15% (v/v) root sårvæske eller sterilt deionisert vann til medium, henholdsvis.
- Bruke en kultur med deionisert vann i stedet for root eksudater som en kontroll. Måle optisk densitet ved 600 nm (OD600) hver 1t etterpå. Generere en vekstkurve ved plotting OD600 verdier versus tid.
Merk: Vi så at 10% av root eksudater ikke påvirke veksten av B. mycoides (se figur 2). Dette forholdet ble brukt RNA-seq eksperimenter. - Fortynne en overnatting B. mycoides kultur med 90 mL forvarmes LB medium til første OD600 av ~ 0,05 i en 300 mL kolbe. Legger 10 mL av root eksudater til kultur og ruge det ved 30 ° C i 1 time.
- Bruke en 10 mL steril deionisert vannbehandling som en kontroll. Samle celler fra kulturen med sentrifugering 9000 x g i 2 minutter på 4 ° C. Forkaste nedbryting, umiddelbart fryse pellet i flytende nitrogen, og lagre den på-80 ° C før bruk.
5. RNA isolasjon
Merk: Før du starter isolasjon, forberede workbench, stativer, og Pipetter ved å rense dem med en RNase dekontaminering løsning (se Tabell for materiale). Bruk hansker hele tiden, og kontroller at alle rør, tips og løsninger er RNase-fri. Alltid holde prøvene på is når mulig.
- Legge til 0,1% (v/v) diethyl pyrocarbonate (DEPC) i ultrapure vann (100 µL av DEPC per 100 mL løsning), bland det godt og holde det ved romtemperatur over natten. Autoclave blandingen å deaktivere i DEPC etter overnatting treatment. Bruk denne DEPC-behandlet ultrapure vann til å forberede TE bufferen [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] og en 10% SDS (w/v) løsning.
- Tine celle pellets på isen og suspendere hver i 400 µL av TE (DEPC) buffer. Overfør av suspensjoner til 2 mL skrukork rør.
- Premix 300 µL kloroform-isoamyl alkohol (24:1 v/v) og 300 µL av fenol (syre fenol, RNA klasse), og la blandingen stå i 5 minutter. Ta 500 µL av organisk øvre fasen legge til resuspended cellene. Deretter Legg 50 µL av 10% SDS og 0,5 g av glassperler (0,5 µm) inn i røret.
- Lukk dekselet fast og sett røret i en perle-mølle homogenizer (se Tabell for materiale). Utføre en 3 × 45 s puls homogenisering med et 1 minutt intervall på is.
- Sentrifuge prøvene i 10 min 11.000 x g (4 ° C), og overfør den øvre fasen til en ny tube.
- Legg til 500 µL kloroform-isoamyl alkohol (24:1) til øvre fase fra trinn 5.5 og sentrifuge blandingen for 5 min 11.000 x g (4 ° C).
Merk: Følgende ble endret fra produsentens instruksjon av en kommersiell glass fiber filter-basert RNA isolering kit (se Tabell for materiale). - Overføre 500 µL av øvre fase til en frisk tube, Legg 2 volumer (1 mL) en lysis binding buffer og bland det av pipettering opp og ned.
- Kombiner filter og samling rør (fra RNA isolering kit) og Pipetter blandingen fra trinn 5,7 til filteret røret. Sentrifuge rør for 15 s på 8000 x g og kast gjennomflytsenhet.
- Forberede 1,5 mL microcentrifuge rør med 100 µL DNase bufferen, 10 µL av DNase jeg, og 5 µL av en RNase hemmer (se Tabell for materiale). Legge til løsningen blanding på filter filter-rør og ruge det i 20-30 minutter på 15-25 ° C.
- Fremgangsmåten vask i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk 50 µL av en elueringsbufferen for å elute RNA.
- Lagre eluted RNA ved-80 ° C, og sette en plast parafin film rundt. Samtidig, kan du overføre noen microliters av utvalget slik 1,5 mL microcentrifuge å utføre kvalitetskontroll.
6. RNA kvalitetskontroll og sekvensering
- Sjekk RNA med et microvolume spektrofotometer.
Merk: Absorbance forholdstall på 260/280 skal være over 1,8 og forholdstall på 260/230 skal være over minst 1.8, helst over 2.0. - Løpe det renset RNA i et automatisert geleelektroforese instrument anbefaler RNA analyse kit (se Tabell for materiale); RNA integritet nummeret (RIN) må være minst over 7 å fortsette.
- Bruke et samlet beløp på 3 µg av per prøve for å generere biblioteker med en RNA-Seq biblioteket forberedelse kit (se Tabell for materiale) følge anbefalingene fra produsenten.
Merk: Biblioteket forberedelsene var sekvensielt på en høy gjennomstrømming sekvensering plattform og sammen-end leser ble generert.
7. dataanalyse ved hjelp av webbaserte rørledning T-REx
- Utføre en kvalitet filtrering ved hjelp av FASTX-Toolkit versjon 0.0.13 (Phred kvalitetspoeng > 20). Trimme den rå RNA-Seq lest fra kortet sekvenser med verktøyet Trimmomatic.
Merk: Alle nedstrøms analysene var basert på rene data med høy kvalitet. - Last ned B. mycoides ATCC 6462 NCBI genomet databasen (NCBI tiltredelse nr: CP009692.1) og bruke den som en referanse genomet for å kartlegge den rene lest bruker Bowtie2/2.2.3.
- Bruk HTSeq v0.6.1 å telle leser tallene som er tilordnet hver genet og leser per kilobase av transkripsjon per million tilordnet leser (RPKM) av hver genet basert på lengden på gene og leser greven tilordnet dette genet.
- For analyse av data fra rørledningen T-REx, kan du bruke tabellen RPKM som inndata, samt tre beskrivende filer: (i) en faktorer fil å beskrive eksperimentet faktorer, (ii) en kontraster-fil til å definere hvilke faktorer vil sammenlignes for differensial genuttrykk , og (iii) en klasse filen å beskrive grupper av gener av interesse.
Merk: Beskrivende filene er in.txt format. Eksempler kan bli funnet på nettstedet til T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). En detaljert instruksjon for dataanalyse ved hjelp av T-REx kan finnes i en tidligere publikasjon ved de Jong et al. 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plante-assosiert mikroorganismer kan positivt påvirke plantevekst og helse. Men er mekanismer for komplekse interaksjoner mellom planter og deres mikrobiell symbionter ikke fullt ut forstått. Root eksudater spiller en viktig rolle i å regulere rhizobacterial aktivitet og atferd, og det er generelt postulerte at mikrobielle koloniseringen av røtter starter med tiltrekningen av mikrober til root eksudater. Formålet med dette arbeidet var å undersøke transcriptomic respons på rhizobacterial B. mycoides til potet root eksudater. For å oppfylle dette, var potet knoller overflaten sterilisert og spirer i autoklaveres vermikulitt. Så ble root-eksudater samlet som vist i figur 1. For å utelukke muligheten for root eksudater påvirker bakterievekst, opptil 15% av root eksudater ble lagt til B. mycoides kultur, og ingen endring i veksten som ble oppdaget under måle tiden (figur 2). Dermed var gene expression endringene i denne studien ikke sannsynlig forårsaket av vekst-relaterte effekter.
Etter samlingen, root eksudater ble lagt til B. mycoides kulturen i 10% forholdet (v/v), og den bakterielle totale RNA ble isolert som beskrevet tidligere. RNA ble deretter utsatt for kvalitetskontroll av en automatisert geleelektroforese instrument som resultatene vises i Figur 3. Figur 3A og 3B representerer RNA isolert fra B. mycoides behandlet med root-eksudater, og Figur 3 c og 3D representerer RNA isolert fra kontrollgruppen. Alle prøver scoret en RIN verdi på over 9 med to klart band tilsvarer 16S og 23S RNA underenheter, demonstrere at høy kvalitet RNA ble innhentet av denne protokollen.
Etter biblioteket forberedelse, ble par-end leser innhentet med høy gjennomstrømming sekvensering plattform. Den rå RNA-Seq-lest var trimmet fra kortet sekvenser og tilordnet referanse Genova orden. Resulterende dataene, ble tabellen RPKM generert. Transcriptome analyse var utført med T-REx rørledningen. Forholdet intensitet handlingen i alle ulikt uttrykt gener er vist i Figur 4. Sammenlignet med en kontroll indusert tillegg av potet root eksudater 715 gener uttrykkes ulikt. Av disse, 408 gener var upregulated, og 307 gener var downregulated15. Den relative endringen av noen av gener med endrede uttrykk er oppført i tabell 1.
Figur 1: prosessen ordningen av samlingen av potet root eksudater. Materialer er autoklaveres spiring utføres i et klima kammer. Vask potet tuber med sterilisert vann, og bad det i 2-3% NaOCl for 5 min. bad det i 75% etanol for en annen 5 min. sted potet i en autoklaveres kurven og sette den inn i en pott som inneholder våt vermikulitt. Vokse potet i et klima kammer i 3-4 uker, og deretter overføre kurven med potet frøplante til et beger. Samle root eksudater hver dag og fylle begeret med sterilisert vann. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Vekstkurve av B. mycoides med ulike konsentrasjoner av potet root eksudater. Belastning EC18 ble dyrket i et flytende LB medium med tillegg av potet root eksudater eller sterilt H2O. OD600 ble målt hver 1t og plottet mot tiden. Alle grupper vise et lignende vekstmønster, som indikerer at opptil 15% av rot eksudater tillegg har ingen signifikante effekter på B. mycoides vekst. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: RNA kvalitetskontroll av automatiserte geleelektroforese instrumentet. A og B representerer RNA isolert fra B. mycoides behandlet med root eksudater og C og D representerer RNA isolert fra kontrollgruppen. Alle RNA prøvene viser to klart band tilsvarer 23S og 16S rRNA og en svak 5S rRNA band. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: forholdet intensitet plott for å visualisere differensial genuttrykk av RNA-seq prøver av B. mycoides svar på potet root eksudater. Tallet genereres automatisk av T-REx. X-aksen representerer gene expression og y-aksen representerer log2-forvandlet fold endringen. Gener er opp- og downregulated har positive og negative log2 forholdet verdier. Prikkene i stripete området angir gener som ikke er betydelig over - eller under-uttrykt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Genet tag | Strand | Kaste endring | Merknad |
| BG05_RS09165 | + | 3.3 | multidrug middelklasseinnbyggere protein |
| BG05_RS20930 | + | 25.3 | membran protein |
| BG05_RS10935 | + | 23.3 | fase III sporulation protein AD |
| BG05_RS08990 | - | 11,8 | sporulation protein |
| BG05_RS16405 | + | 3.9 | IclR familien transcriptional regulator |
| BG05_RS24905 | - | 3 | tryptofan syntase delenhet alpha |
| BG05_RS24920 | - | 2.3 | indol-3-glyserol fosfat syntase |
| BG05_RS22255 | - | 27 | acetolactate syntase |
| BG05_RS22250 | - | 6.5 | ketol-acid reductoisomerase |
| BG05_RS22265 | - | 26,4 | forgrenede-kjeden aminosyren aminotransferase |
| BG05_RS18715 | - | 2.8 | pullulanase |
| BG05_RS18040 | + | -9.1 | spiring protein YpeB |
| BG05_RS16930 | + | -4.2 | sukker ABC transporter ATP-bindende protein |
| BG05_RS27345 | + | -2.9 | MFS transporter |
| BG05_RS19555 | - | -3.3 | PTS cellobiose transporter delenhet IIB |
| BG05_RS24345 | - | -2.7 | putrescine importør |
| BG05_RS22525 | - | -12.4 | cardiolipin syntase |
| BG05_RS15225 | - | -3.3 | membran protein |
| BG05_RS18475 | + | -5.7 | membran protein |
| BG05_RS19095 | + | -2.1 | spiring protein |
Tabell 1: Liste over ulikt uttrykt gener av en rot eksudater-behandlet gruppe med en kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plante-mikrobe interaksjoner har vært hypotese skal bestemmes av en finstemt likevekt mellom bakterier og planter. Slik interaksjon er svært komplisert og vanskelig å studere i et naturlig system som omfatter variert mikrobielle arter, potensielt fungerer som konsortier. Dette dokumentet beskriver en forenklet protokoll for å studere bakteriell svaret root eksudater under godt kontrollerte forhold. Transcriptome profil av rhizobacteria, ved eksponering til root eksudater, gir detaljert informasjon om bakteriell å rhizosphere nisje. Denne roten eksudater samling protokollen krever ikke kompliserte prosedyrer og spesialisert utstyr. Men alle prosedyrer må utføres under strengt sterile forhold og en sterilitet kontroll skal inkluderes. Vi anbefaler voksende flere potet knoller parallelt og forkaster de forurenset. Endringer kan gjøres til denne protokollen hvis andre plantearter blir undersøkt. Det er viktig å bruke en passende metode for å sterilisere noen frø/knoller fordi varierer toleranse til desinfeksjonsmidler brukes.
Når root eksudater hentes, må høy kvalitet RNA isoleres fra bakterieceller. Ulike reagenser og standardprotokoller som er hovedsakelig basert på fenol/kloroform eller TRIzol metoden er tidkrevende16. De kommersielle kits er hovedsakelig utformet for modell organismer, men gjelder mindre for andre. Denne RNA isolasjon protokollen som kombinerer metoden fenol/kloroform og en RNA isolering kit overvinner ulempene ved disse metodene. Videre er en perle-juling trinn inkludert homogenize B. mycoides celler som vanligvis samlet i planktoniske kultur. Potensielle DNA forurensning er fjernet av en ekstra inkubasjon med DNase før elueringsrør. RIN mange innebærer isolasjon av intakt. Dermed er denne protokollen spesielt effektive og tidsbesparende for miljømessige bakteriell stammer.
Etter RNA sekvensering, dataanalyse utføres med T-REx, webbaserte statistisk analyse pipeline for RNA-seq gene expression data14. Denne rørledningen er brukervennlig, spesielt for biologer uten omfattende bioinformatikk kunnskap. Inndatafilen er RNA uttrykk nivå rådata, som RPKM, fragmenter per kilobase per million tilordnet leser (FPKM), teller per million tilordnet leser (CPM), eller andre gene expression enheter. Slike genet uttrykk filer kan genereres ved tilgjengelige verktøy inkludert SAMtools17, BEDtools18og NGS-Trex19. For å kjøre RNA-seq analysen, er tre andre inndatafiler nødvendig. Disse filene brukes til å definere faktorer som beskriver eksperimenter og gjentak, sammenligninger mellom ulike eksperimentelle forhold, og gruppene av gener av interesse. Når inndatafiler lastes, tar analyseprosessen bare et par minutter.
Flere ulikt uttrykt gener av B. mycoides EC18, når behandlet med root eksudater, vises i tabell 1. Blant dem endres uttrykket av flere gener koding membran proteiner. Gener knyttet til sporulation eller spiring prosessen uttrykkes ulikt. Uttrykket av gener involvert i sporulation også endringer i B. subtilis når co kultivert av ris, fordi root eksudater levere energien som kreves for dynamisk veksten av bakterielle celler18. Uttrykk for IclR transcriptional regulatoren, som er knyttet til multidrug motstand og nedbrytning av aromatiske forbindelser i jorda bakterier, er upregulated. IclR sletting belastningen av rhizobacteria Klebsiella pneumoniae har redusert mineral fosfat solubilization, sammenlignet med vill-type belastning19. Flere gener aminosyrer metabolisme og syntese blir stimulert, mens gener involvert i sukker transport inkludert en cellobiose PTS transporter er downregulated. Dette tyder på at belastningen EC18 kan ha en metabolsk preferanse for aminosyrer over sukker i rhizosphere. Funksjonen av endret genene kan være videre studerte i situ ved å gjøre knockout eller overuttrykte mutanter. I sammendraget kan protokoll beskrevet her en rask identifisering av en rekke potensielt viktig bakteriell gener involvert i anlegget-mikrobe interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Jakob Viel for hans nyttige kommentarer og forslag. Vi takker også Anne de Jong for hans hjelp bioinformatikk analysen. Yanglei Yi og Zhibo Li støttes av Kina stipend Council (CSC). Vi takker NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) for sin økonomiske støtte til OPK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. eZ., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
